中華絨螯蟹MIH基因SNP位點篩選及其與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析

摘要： 為明確蛻皮抑制激素基因（MIH）對中華絨螯蟹的生長調(diào)控機制，本研究選取100只中華絨螯蟹幼蟹個體，分析幼蟹MIH基因的單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點及基因型，并對與生長指標相關(guān)的多態(tài)性位點進行連鎖不平衡和單倍型分析，進一步明確多態(tài)性位點單倍型與生長性狀之間的相關(guān)性。結(jié)果顯示，在中華絨螯蟹幼蟹MIH基因中共篩選鑒定出5個SNP位點，其中3個位點（C640G、C2529T和G2595T）與中華絨螯蟹生長性狀具有相關(guān)性；3個相關(guān)位點中共檢測到5種單倍型，其中H1單倍型（GCG）的占比最高（68.8%），為優(yōu)勢單倍型；H3單倍型（GTT）個體的生長性狀指標最高，顯著高于H2單倍型（CCG）。本研究得到的中華絨螯蟹MIH基因上3個與生長性狀相關(guān)的SNP位點，可作為候選分子標記用于中華絨螯蟹優(yōu)質(zhì)品種選育。

關(guān)鍵詞： 中華絨螯蟹；MIH基因；單核苷酸多態(tài)性（SNP）位點；單倍型；生長性狀

中圖分類號： S966.16"" 文獻標識碼： A"" 文章編號： 1000-4440（2024）06-1053-07

Screening of SNP loci of MIH gene in Eriocheir sinensis and its association with growth traits

DING Xiufang1， FENG Wenrong1，2， LI Jianlin1，2， SU Shengyan1，2， TANG Yongkai1，2

（1.Wuxi Fisheries College， Nanjing Agricultural University， Wuxi 214026， China;2.Freshwater Fisheries Research Center， Chinese Academy of Fishery Sciences/Key Laboratory of Freshwater Fisheries and Germplasm Resources Utilization， Ministry of Agriculture and Rural Affairs， Wuxi" 214026， China）

Abstract： In order to clarify the regulatory mechanism of molt-inhibiting hormone （MIH） gene on the growth of Chinese mitten crab （Eriocheir sinensis）， 100 juvenile Chinese mitten crabs were selected to analyze the single nucleotide polymorphism （SNP） loci and genotypes of MIH gene， and the linkage disequilibrium and haplotype analysis of polymorphic loci related to growth indicators were carried out to further clarify the correlation between haplotypes of polymorphic loci and growth traits. The results showed that five SNP loci were screened and identified in MIH gene of juvenile Chinese mitten crab， and three of them （C640G， C2529T and G2595T） were related to the growth traits of Chinese mitten crab. Five haplotypes were detected in the three related sites. Among them， H1 haplotype （GCG） accounted for the highest proportion （68.8%）， which was the dominant haplotype. The growth traits of individuals with H3 haplotype （GTT） were the highest and significantly higher than those of individuals with H2 haplotype （CCG）. The three SNP loci associated with growth traits in MIH gene of Chinese mitten crab obtained in this study can be used as candidate molecular markers for the breeding of high-quality Chinese mitten crab varieties.

Key words： Eriocheir sinensis;MIH gene;single nucleotide polymorphism （SNP） loci;haplotype;growth traits

蛻皮抑制激素MIH（Molt Inhibiting Hormone）屬于甲殼動物高血糖激素（Crustacean Hyperglycemic Hormone，CHH）家族神經(jīng)肽，由眼柄神經(jīng)細胞（X-器官竇腺復(fù)合體）分泌產(chǎn)生的一種多肽神經(jīng)激素，由竇腺的軸突末端釋放[1]。在青蝦（Macrobrachium nipponense）[2]、脊尾白蝦（Exopalaemon carinicauda）[3]、克氏原螯蝦（Procambarus calrkii）[4]、墨吉明對蝦（Fenneropenaeus merguiensis）[5]和中華絨螯蟹[6-7]等甲殼動物上的研究結(jié)果表明，MIH基因在甲殼動物的蛻殼生長調(diào)控中具有重要作用，通過調(diào)控MIH基因的表達可以控制甲殼動物的蛻殼過程。

單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphisms， SNP），指單個核苷酸的變異而引起的核酸序列多態(tài)性，此標記技術(shù)屬于第3代分子標記技術(shù)[8]。目前SNP分子標記技術(shù)在水產(chǎn)動物病原菌鑒定[9-10]、經(jīng)濟性狀關(guān)聯(lián)分析[11-14]和分子育種[15-16]等方面得到了廣泛應(yīng)用。關(guān)于中華絨螯蟹MIH基因的SNP分子標記研究，大多集中于性早熟性狀相關(guān)分析。Xu等[17]發(fā)現(xiàn)在中華絨螯蟹MIH基因5′非翻譯區(qū)有5個SNP位點，在3′非翻譯區(qū)有6個SNP位點，然而只有3′非翻譯區(qū)中的1個SNP位點與中華絨螯蟹的性早熟相關(guān)；殷悅等[18]發(fā)現(xiàn)中華絨螯蟹MIH基因內(nèi)含子存在1個SNP位點，且其與性早熟之間存在顯著相關(guān)性。MIH與蛻殼生長密切相關(guān)，但目前關(guān)于中華絨螯蟹MIH基因的SNP位點與生長性狀相關(guān)分析還未見報道。

中華絨螯蟹（Eriocheir sinensis）是中國經(jīng)濟價值較高的淡水養(yǎng)殖品種。中華絨螯蟹一生經(jīng)歷多次蛻殼，其過程受內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的多重調(diào)節(jié)，MIH基因直接參與中華絨螯蟹的蛻殼過程[19-21]。由于蟹蛻殼過程伴隨著蟹體的生長與發(fā)育，因此 MIH基因在中華絨螯蟹的生長發(fā)育過程中具有重要作用。本研究通過對中華絨螯蟹MIH基因的測序，分析基因的結(jié)構(gòu)，篩選MIH基因SNP位點，分析其基因型，明確中華絨螯蟹MIH基因SNP位點基因型與生長性狀（體重、體長、體寬和體厚）的相關(guān)性，以期為中華絨螯蟹分子標記輔助育種提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2021年3月從中國水產(chǎn)科學研究院淡水漁業(yè)研究中心陽澄湖蝦蟹綠色養(yǎng)殖基地選取重約6.95 g的中華絨螯蟹幼蟹100只，測量每只蟹的體重、體長、體寬和體厚，冰水浴麻醉后，剪取步足肌肉，液氮速凍后，保存于-80 ℃超低溫冰箱，用于DNA提取。

1.2 基因組DNA的提取

使用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司產(chǎn)品）進行樣本基因組DNA提取。采用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性，采用NanoPhotometer-N50超微量分光光度計（德國Implen GmbH公司產(chǎn)品）檢測DNA純度和濃度。

1.3 MIH基因SNP位點篩選

根據(jù)美國國家生物技術(shù)信息中心（NCBI）網(wǎng)站查找得到的中華絨螯蟹MIH基因序列（GenBank：AY310313.1），設(shè)計5對引物（表1），進行PCR擴增。PCR反應(yīng)條件是94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸45 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，最后于4 ℃冰箱保存。PCR擴增產(chǎn)物送天霖生物科技無錫有限公司測序。用ClustalXv1.83軟件進行序列比對，篩選得到中華絨螯蟹幼蟹MIH基因SNP位點。根據(jù)測序峰值圖，明確SNP位點的基因型，其中，單峰峰值圖所對應(yīng)的基因型為純合子，而套峰峰值圖所對應(yīng)的基因型為雜合子。

1.4 數(shù)據(jù)分析

分析各SNP位點基因型與中華絨螯蟹生長性狀的關(guān)系，得到與中華絨螯蟹生長性狀存在顯著相關(guān)的SNP位點；進一步利用Haploview 4.2軟件對與中華絨螯蟹生長性狀存在顯著相關(guān)的SNP位點進行單倍型和連鎖不平衡分析，估算各單倍型的頻率。一般認為連鎖不平衡系數(shù)（D′）gt;0.7屬于強連鎖。利用SPSS 20.0軟件[22]分析中華絨螯蟹MIH基因SNP位點不同基因型以及不同單倍型與中華絨螯蟹生長性狀（體重、體高、體長和體厚）之間的相關(guān)性。差異顯著性水平設(shè)置為Plt;0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIH基因SNP位點的篩選

經(jīng)測序分析及堿基序列比對，中華絨螯蟹MIH基因序列全長為3 506 bp，包括3個外顯子和2個內(nèi)含子。在MIH基因堿基序列上共篩選得到5個SNP位點，位置如圖1所示。第1內(nèi)含子上有3個SNP位點（T614C、T621C和C640G），3′非翻譯區(qū)和第3外顯子上各有1個SNP位點，分別為G2595T和C2529T。第3外顯子上的SNP位點為無義突變。

中華絨螯蟹MIH基因SNP位點測序峰值圖如圖2所示。T614C位點單峰對應(yīng)的純合子為C/C，套峰對應(yīng)的雜合子為T/C； T621C位點單峰對應(yīng)的純合子為T/T，套峰對應(yīng)的雜合子為T/C； C640G位點單峰對應(yīng)的純合子為G/G，套峰對應(yīng)的雜合子為C/G； C2529T位點單峰對應(yīng)的純合子為T/T，套峰對應(yīng)的雜合子為C/T；G2595T位點單峰對應(yīng)的純合子為G/G，套峰對應(yīng)的雜合子為G/T。

5個SNP位點的基因型類型與頻率和等位基因類型與頻率見表2。從表中數(shù)據(jù)可知，所有位點均有3個基因型和2個等位基因。C640G和G2595T位點的優(yōu)勢基因型是GG，其頻率分別為59%和92%；C2529T、T614C、T621C位點的優(yōu)勢基因型是CC，其頻率分別為91%、73%和59%。位點C640G和G2595T的優(yōu)勢等位基因類型是G，其頻率分別為72.0%和95.0%；位點C2529T、T614C、T621C的優(yōu)勢等位基因類型是C，其頻率分別為94.0%、85.5%和76.0%。

2.2 中華絨螯蟹MIH基因SNP位點基因型與生長性狀之間的相關(guān)性

中華絨螯蟹MIH基因5個SNP位點不同基因型個體的生長性狀指標如表3所示。從表3可以看出，位點T614C和T621C的不同基因型個體之間的體重、體長、體寬及體厚等生長性狀指標無顯著差異，而位點C640G、C2529T和G2595T的不同基因型個體的生長性狀指標存在一定的差異。位點C640G為GG基因型的體重、體長、體寬和體厚顯著高于CG基因型，CC基因型的蟹體生長性狀指標介于兩者之間，但與2者都沒有顯著差異。位點C2529T優(yōu)勢基因型CC的體長、體寬和體厚顯著低于CT基因型，而TT基因型個體的生長性狀指標介于CC基因型和CT基因型之間。同樣，位點G2595T優(yōu)勢基因型GG的體長、體寬和體厚都顯著低于GT基因型。

2.3 中華絨螯蟹MIH基因SNP位點單倍型與生長性狀之間的相關(guān)性

對中華絨螯蟹MIH基因中與生長顯著相關(guān)的3個SNP位點（C640G、C2529T和G2595T）連鎖不平衡和單倍型分析結(jié)果如圖3和表4所示。位點C640G和位點C2529T連鎖不平衡系數(shù)為0.27，位點C640G和位點G2595T連鎖不平衡系數(shù)為0.11，位點G2595T和位點C2529T之間的連鎖不平衡系數(shù)為1.00。其中，位點C2529T和G2595T之間處于強連鎖不平衡狀態(tài)。3個與生長顯著相關(guān)的C640G、C2529T和G2595T位點共檢測到5種單倍型H1～H5（表4）。5個單倍型中，H1單倍型頻率最高（68.8%），為優(yōu)勢單倍型；H5單倍型頻率最低，為1.0%。

MIH基因單倍型與生長性狀指標之間的關(guān)聯(lián)性如表5所示。從表中可以看出，蟹個體生長性狀指標（體重、體長、體寬和體厚）從高到低的單倍型依次為H3、H4、H5、H1、H2，其中H3單倍型個體的生長性狀指標（體重、體長、體寬和體厚）皆顯著高于H2單倍型。

3 討論

MIH基因是甲殼動物高血糖激素（CHH）基因家族的一員，在甲殼動物生長發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用。高俊娜[23]對三疣梭子蟹MIH基因的SNP位點進行了篩選，在MIH基因的外顯子序列1上找到了1個SNP位點G212A，該位點突變導(dǎo)致精氨酸改變?yōu)楣劝滨０?；Yu 等[24]在斑節(jié)對蝦的MIH1和MIH2基因中分別檢測到1個SNP位點；Xu等[25]在克氏原螯蝦MIH基因的5′端非編碼區(qū)和3′端非編碼區(qū)共鑒定出了17個SNP位點，其中位點g.-12Cgt;G與體重顯著相關(guān)。上述研究結(jié)果說明將MIH基因作為甲殼動物生長性狀分子標記候選基因是合理的。本研究用直接測序法從中華絨螯蟹幼蟹MIH基因序列中共鑒定出5個SNP位點，并發(fā)現(xiàn)3個與生長性狀相關(guān)的SNP位點（C640G、C2529T和G2595T）。位點C640G中的GG基因型個體、C2529T中的CT基因型個體、G2595T中的GT基因型個體均表現(xiàn)出較優(yōu)的生長性狀，說明這3個位點可以作為提高中華絨螯蟹體重的候選分子標記位點。

單倍型是指在同一個染色體上作為一個整體而共同遺傳的塊狀區(qū)域內(nèi)多個基因座上等位基因的組合，其比單個SNP位點包含更多的有價值信息。目前在動物基因單倍型與生長性狀的關(guān)聯(lián)分析方面已有較多研究。例如，王明遠等[26]通過連鎖不平衡分析發(fā)現(xiàn)綿陽MTNR1A基因單倍型與產(chǎn)羔數(shù)具有顯著相關(guān)性；祁增源等[27]將青海高原型牦牛SCD基因單倍型與生長性狀進行關(guān)聯(lián)性分析，發(fā)現(xiàn)H1H3為最優(yōu)組合單倍型，SCD基因可作為優(yōu)質(zhì)牦牛篩選的分子標記輔助候選基因；石福岳等[28]將早勝牛CAPN1基因上檢測到的4個SNP位點存在的6種單倍型與肉質(zhì)性狀進行關(guān)聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)單倍型與早勝牛的肉品質(zhì)性狀具有顯著相關(guān)性，因此這4個位點可作為優(yōu)質(zhì)早勝牛選育的候選分子標記位點。本研究通過中華絨螯蟹MIH基因3個與生長性狀相關(guān)的SNP位點連鎖不平衡分析，并構(gòu)建單倍型，發(fā)現(xiàn)3個SNP位點共存在5種單倍型，且不同單倍型中華絨螯蟹個體生長性狀指標存在較大的差異，H3單倍型個體占據(jù)一定的生長優(yōu)勢，其體重、體長、體寬和體厚顯著大于H2單倍型個體。H3單倍型中華絨螯蟹具有較高的生長力，是優(yōu)良的種質(zhì)資源。

4 結(jié)論

本研究在中華絨螯蟹MIH基因中共篩選出5個SNP位點，其中C640G、C2529T和G2595T 3個位點與生長性狀之間具有相關(guān)性。3個位點中C2529T和G2595T處于強連鎖不平衡狀態(tài)；3個位點存在5種單倍型，其中H3單倍型個體占據(jù)一定的生長優(yōu)勢，是優(yōu)良的種質(zhì)資源。

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（責任編輯：石春林）

收稿日期：2023-03-29

基金項目：江蘇省種業(yè)振興項目[JBGS（2021）031]；江蘇省農(nóng)業(yè)重大新品種創(chuàng)制項目（PZCZ201749）；中央級基本科研業(yè)務(wù)費（2020TD36）；江蘇省重點研發(fā)項目（BE2022360）

作者簡介：丁秀芳（1997-），女，河南周口人，碩士研究生，研究方向為水產(chǎn)動物遺傳育種。（E-mail）1806336879@qq.com

通訊作者：唐永凱，（E-mail）tangyk@ffrc.cn