畢赤酵母分泌型遺傳操作工具的構(gòu)建與優(yōu)化

摘要：為了解決畢赤酵母遺傳操作效率低且流程繁瑣的問題，提高其應(yīng)用價值，構(gòu)建并優(yōu)化了分泌型遺傳操作工具。首先，以α-淀粉酶為報告蛋白，通過融合自主復(fù)制序列構(gòu)建非整合型表達(dá)質(zhì)粒；其次，借助通用引物和POE-PCR，快速篩選評估與目的蛋白最匹配的內(nèi)源信號肽；最后，構(gòu)建以亞磷酸鹽為唯一磷源的營養(yǎng)依賴型篩選標(biāo)記。結(jié)果表明：2種非整合型質(zhì)粒表達(dá)α-淀粉酶的酶活分別是整合型質(zhì)粒的2倍和1.6倍；以FLO10、EXG1和MSB2為信號肽引導(dǎo)的α-淀粉酶酶活分別是常規(guī)信號肽α-MF的2.5倍、1.94倍和1.75倍；亞磷酸脫氫酶基因（ptxD）成功篩選出異源表達(dá)α-淀粉酶的重組菌株。研究簡化了基因操作流程，改進(jìn)了遺傳操作工具，開發(fā)的綠色安全且低成本的營養(yǎng)依賴型篩選標(biāo)記，有助于畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用和推廣。

關(guān)鍵詞：

合成生物學(xué)；畢赤酵母；分泌表達(dá)；復(fù)制子；信號肽；篩選標(biāo)記

中圖分類號：Q789

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

DOI：10.7535/hbkd.2024yx04008

Constructionandoptimizationofsecretorygenetic

manipulationtoolsinPichiapastoris

ZHANGMengyu，WANGYihan，LIHan，LITianming，F(xiàn)ENGHuiyong

（SchoolofFoodandBiology，HebeiUniversityofScienceandTechnology，Shijiazhuang，Hebei050018，China）

Abstract：

InordertosolvetheproblemsoflowefficiencyandcumbersomeprocessofPichiapastorisgeneticmanipulation，secretorygeneticmanipulationtoolswereconstructedandoptimizedtoimprovetheirindustrialproductionandapplicationvalue.Firstly，theα-amylasewasemployedasthereporterprotein，andthenon-integratedexpressionplasmidwasconstructedbyfusingtheself-replicatingsequence.Secondly，endogenoussignalpeptidesthatbestmatchthetargetproteinwerequicklyscreenedandevaluatedusinguniversalprimersandPOE-PCR.Finally，anutrition-dependentscreeningmarkerwasconstructedwithphosphiteasthesolephosphorussource.Theresultsindicatethatnon-integratedplasmidsexpressα-amylasewith2-foldand1.6-foldhigherenzymeactivitycomparedtointegratedplasmids，respectively;TheuseofFLO10，EXG1，andMSB2signalpeptidesresultsin2.5-fold，1.94-fold，and1.75-foldhigherα-amylaseactivitythantheconventionalsignalpeptideα-MF，respectively;Arecombinantstrainforheterologousexpressionofα-amylaseissuccessfullyscreenedusingthephosphitedehydrogenasegene（ptxD）.Theprocessofgeneoperationissimplified，thegeneticoperationtoolsareimproved，andgreen，safe，andlow-costnutrition-dependentscreeningmarkersareprovided，whichlaysafoundationfortheapplicationandpromotionofthePichiapastorissecretoryexpressionsystem.

Keywords：

syntheticbiology;Pichiapastoris;secretoryexpression;replicon;signalpeptide;screeningmarker

巴斯德畢赤酵母（Pichiapastoris，又稱Komagataellaphaffii）是一種非常規(guī)甲基營養(yǎng)型酵母，被美國食品藥品監(jiān)督管理局認(rèn)定為GRAS（generallyrecognizedassafe，即公認(rèn)安全的食品成分）微生物[1]，其具有表達(dá)效率高、分泌能力強、易于高細(xì)胞密度培養(yǎng)、產(chǎn)物純化回收成本低等優(yōu)勢，適合用于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)，且在食品和藥品領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用潛力[2]，是目前最常用的真核表達(dá)宿主之一[3]，甚至超過了釀酒酵母[4]。然而，畢赤酵母在應(yīng)用中缺少穩(wěn)定的非整合型質(zhì)粒[5]，基因操作的主要載體仍然是整合型質(zhì)粒，整合型質(zhì)粒的拷貝數(shù)低，通常采用高濃度抗生素篩選或在體外構(gòu)建不含復(fù)制子的多拷貝表達(dá)載體[6]。由于抗生素用量較高、操作相對復(fù)雜、同源重組及轉(zhuǎn)化效率較低、整合后染色體不穩(wěn)定等問題，使得開發(fā)非整合型質(zhì)粒成為研究重點。

由于畢赤酵母分泌機制的復(fù)雜性，仍然有多種蛋白質(zhì)的表達(dá)量相對較低[7]。為了提高異源蛋白的分泌表達(dá)，通常將目的蛋白融合在信號肽的C末端，促進(jìn)其分泌[8]。目前，釀酒酵母的α交配因子信號肽（α-MF信號肽）在畢赤酵母中應(yīng)用最為廣泛[9]。CHAHAL等[10]通過密碼子優(yōu)化、疏水區(qū)域改造等策略，可以有效提高α信號肽在畢赤酵母中介導(dǎo)的分泌效率，但是不同類型的外源蛋白需要通過實驗選擇表達(dá)效果最好的信號肽[11]。隨著人們對畢赤酵母X33蛋白質(zhì)組的深入研究，發(fā)現(xiàn)一些畢赤酵母內(nèi)源信號肽也有較強的分泌能力，并且推測內(nèi)源信號肽更容易被宿主識別，從而有利于外源蛋白的分泌[12-13]。篩選標(biāo)記是載體轉(zhuǎn)化酵母時篩選轉(zhuǎn)化子所必須的元件，畢赤酵母的表達(dá)質(zhì)粒有抗性篩選標(biāo)記和營養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記。近年來，因抗生素及其抗性基因被視為一類新的污染物[14]，使得其向環(huán)境的釋放受到限制，加上抗生素價格昂貴，因此需要開發(fā)具有低環(huán)境風(fēng)險的篩選標(biāo)記。ZHUANG等[15]在釀酒酵母中表達(dá)亞磷酸脫氫酶基因（ptxD），使攜帶該基因的菌株在以亞磷酸鹽作為唯一磷源的選擇培養(yǎng)基上正常生長，而不攜帶該基因的菌株不能生長，從而達(dá)到菌株篩選目的。該篩選標(biāo)記在畢赤酵母中的應(yīng)用還未見報道。

本研究通過構(gòu)建可以穩(wěn)定存在于畢赤酵母中的非整合型載體，避免載體線性化等復(fù)雜步驟，使后續(xù)基因操作更為簡便。在非整合型質(zhì)粒的基礎(chǔ)上優(yōu)化α信號肽，分析和克隆15個畢赤酵母內(nèi)源信號肽。以α信號肽作為對照，α-淀粉酶為報告蛋白，評估信號肽的分泌能力，開發(fā)新型營養(yǎng)依賴的篩選標(biāo)記基因亞磷酸脫氫酶基因（ptxD），并將此篩選標(biāo)記應(yīng)用到畢赤酵母遺傳操作系統(tǒng)上，克服抗生素價格昂貴及污染的問題，為畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)提供更加高效便捷的遺傳操作工具。

1材料和方法

1.1材料

本研究所使用的菌株、質(zhì)粒詳情見表1。

酵母提取物、胰蛋白胨、蛋白胨、葡萄糖，均購自O(shè)XOID生物制品有限公司；DNS試劑盒，購自Solarbio公司；凝膠DNA小量回收試劑盒，購自Magen公司；超薄DNA產(chǎn)物純化試劑盒，酵母質(zhì)粒提取試劑盒，質(zhì)粒小提中量試劑盒，均購自天根生化科技（北京）有限公司；KODDNA聚合酶、dNTP、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ，KpnⅠ，NdeⅠ和XbaI，購自ThermoScientific公司；DNAMarker，6×DNALoadingBuffer，購自北京全式金生物科技公司；博來霉素，購自Invitrogen公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

LLB培養(yǎng)基10g/L胰蛋白胨、5g/L酵母提取物、5g/L氯化鈉，調(diào)節(jié)pH值為7.5（若配置其固體培養(yǎng)基，則加入20g/L瓊脂粉）。

YPD培養(yǎng)基酵母提取物10g/L、蛋白胨20g/L、葡萄糖20g/L，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉，可根據(jù)需求添加適量的博來霉素。

YNB培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，YNB6.7g/L，20種氨基酸及Ade和Ura200mg/L，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。

SD篩選培養(yǎng)基葡萄糖20g/L，20種氨基酸及Ade和Ura200mg/L，碘化鉀0.1mg/L，硫酸銅0.04mg/L，

氯化鐵0.4mg/L，硫酸錳0.8mg/L，硫酸鋅0.8mg/L，鉬酸鈉0.4mg/L，硼酸1mg/L，硫酸銨5g/L，硫酸鎂0.5g/L，氯化鈣0.2g/L，對氨基苯甲酸0.4mg/L，硫胺素0.8mg/L，核黃素0.4mg/L，煙酸0.8mg/L，泛酸鈣0.8mg/L，吡哆醇0.8mg/L，生物素0.4mg/L，葉酸0.4mg/L，肌醇4mg/L，亞磷酸氫二鉀2g/L，固體培養(yǎng)基添加20g/L瓊脂粉。

1.2表達(dá)載體的構(gòu)建

1.2.1帶有2種不同復(fù)制子的非整合型質(zhì)粒的構(gòu)建

2種自主復(fù)制序列（autonomouslyreplicatingsequence，ARS）即來自畢赤酵母線粒體的mitoARS[16]與來自乳酸克魯維酵母基因組優(yōu)化后的OPT-panARS[17]均由金唯智公司合成。以實驗室保存的pGAPZαA（pXY001）為出發(fā)質(zhì)粒，將mitoARS和OPT-panARS分別無縫克隆到pXY001中，通過PCR驗證并經(jīng)測序確認(rèn)后，得到含有ARS的2種游離型載體pXY002和pXY003。

1.2.2淀粉酶表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以實驗室保存的解淀粉酶芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）的基因組為模板，克隆獲得解淀粉芽孢桿菌的α-淀粉酶基因（amyS），將2種非整合型載體pXY002和pXY003與整合型載體pXY001分別經(jīng)EcoRⅠ與KpnⅠ雙酶切后，同淀粉酶基因amyS進(jìn)行組裝，經(jīng)PCR驗證及測序確認(rèn)后，得到3種表達(dá)淀粉酶基因的載體：pWY01、pWY02和pWY03。

1.2.3含有信號肽質(zhì)粒的構(gòu)建

為了提高異源蛋白的分泌表達(dá)，本研究對α-MF信號肽進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)文獻(xiàn)報道，在信號肽α-MF的pre區(qū)和pro區(qū)按照畢赤酵母的密碼子偏好性新增13個氨基酸[18]，獲得優(yōu)化后的信號肽OPT-α-MF，利用無縫克隆技術(shù)，構(gòu)建含優(yōu)化信號肽的質(zhì)粒pWY04。同時，為了進(jìn)一步增強異源蛋白分泌表達(dá)，在信號肽與淀粉酶基因amyS之間插入Linker：GGGGS[19]，分別構(gòu)建出含原始信號肽的載體pWY05和含有Linker的信號肽載體pWY06。通過在線分析軟件SignalP6.0[20]，分析和篩選出15種畢赤酵母X33自身分泌的信號肽，借助通用引物和POE-PCR方法[21]，以構(gòu)建成功的重組載體pWY05為模板，將信號肽片段快速與模板質(zhì)粒序列融合，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞。

1.2.4亞磷酸脫氫酶基因表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

通過調(diào)研獲得亞磷酸脫氫酶基因ptxD的序列（gi|3127080），并委托金唯智生物公司合成。以WY003為基礎(chǔ)質(zhì)粒，使用無縫克隆技術(shù)，將質(zhì)粒中的博來霉素基因（BleoR）替換為亞磷酸脫氫酶基因ptxD，經(jīng)PCR驗證及測序確認(rèn)后，得到篩選標(biāo)記為（ptxD）的質(zhì)粒pWY07。

1.3畢赤酵母轉(zhuǎn)化子的篩選與鑒定

畢赤酵母感受態(tài)的制備及電轉(zhuǎn)化操作參照文獻(xiàn)[22]。將載體和信號肽片段進(jìn)行POE-PCR后，將5μgPCR產(chǎn)物與80μL畢赤酵母X33感受態(tài)混合，轉(zhuǎn)入0.2mm電轉(zhuǎn)杯冰浴5min，1500V電壓下電擊，在1mol/L山梨醇中孵育1～2h后涂布于含有100μg/mLZeocin的YPD淀粉平板上，于30℃培養(yǎng)3～4d。得到轉(zhuǎn)化子后，倒入適量的碘液，觀察透明圈，較大透明圈且PCR驗證正確的單菌落即為陽性克隆。

1.4α-淀粉酶的酶活檢測

分別挑取野生型菌株及陽性克隆菌株，置于西林瓶中進(jìn)行微培養(yǎng)，采用DNS法檢測酶活。酶活測定的反應(yīng)條件如下：2%玉米淀粉溶液270μL，粗酶液30μL（發(fā)酵液經(jīng)過6000r/min，離心10min后取上清），混合均勻后于60℃水浴10min，加入600μLDNS溶液，于100℃水浴5min，取200μL測OD540，計算淀粉酶的酶活。

2結(jié)果與分析

2.1非整合型載體的構(gòu)建

2.1.1重組表達(dá)載體的構(gòu)建

以實驗室保存的pGAPZαA（pXY001）為骨架，通過無縫克隆技術(shù)分別插入2種自主復(fù)制序列構(gòu)建非整合型質(zhì)粒pXY002和pXY003。然后，將3種質(zhì)粒pXY001、pXY002及pXY003使用EcoRⅠ與KpnⅠ進(jìn)行雙酶切后插入淀粉酶基因（amyS），成功構(gòu)建1種整合型及2種非整合型含淀粉酶基因的表達(dá)質(zhì)粒pWY01、pWY02及pWY03。以pWY03表達(dá)載體為例，構(gòu)建過程如圖1所示。

2.1.2非整合型質(zhì)粒的功能驗證

將2種含有非整合型載體的菌株在無抗性的YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)后涂布到無抗性的YPD固體培養(yǎng)基上，獲得單菌落。將單菌落分別稀釋影印至無抗性的固體培養(yǎng)基YPD及含博來霉素的固體培養(yǎng)基YPDZ上，如圖2所示。2種游離質(zhì)粒均可在YPD培養(yǎng)基上生長，在YPDZ培養(yǎng)基上無法生長。這說明2種質(zhì)粒已在無抗性的YPD液體培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)時丟失，沒有整合到染色體上，而是以游離形式存在，即將2種復(fù)制子OPT-panARS與mitoARS作為質(zhì)粒骨架時，可以使質(zhì)粒以游離形式存在于畢赤酵母體內(nèi)。

將2種含有非整合型載體的菌株于抗性培養(yǎng)基YPDZ中連續(xù)傳代培養(yǎng)，使用試劑盒提取傳至第10代的質(zhì)粒，對其進(jìn)行穩(wěn)定性檢測，質(zhì)粒大小分別為6027bp和5051bp。使用內(nèi)切酶EcoRⅠ進(jìn)行酶切驗證，電泳結(jié)果如圖3所示，可以看出，條帶大小正確，證明2種質(zhì)粒經(jīng)抗性培養(yǎng)基傳代10代時仍可穩(wěn)定存在畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)。

通過在無抗性液體培養(yǎng)基YPD中傳代培養(yǎng)，并對每代菌液留樣，再將留樣菌液稀釋后，分別涂布于無抗性的固體培養(yǎng)基YPD及含博來霉素的固體培養(yǎng)基YPDZ上，獲取單菌落后進(jìn)行計數(shù)，計算質(zhì)粒丟失率，如表2所示。

由表2可知，含OPT-panARS復(fù)制子的質(zhì)粒在第1代、第2代的丟失率明顯高于含mitoARS復(fù)制子的質(zhì)粒，但兩者的質(zhì)粒均于第3代全部丟失。這表明2種復(fù)制子均可較快丟失質(zhì)粒，可作為畢赤酵母CRISPR/Cas9或CRISPR/Cpf1的基因編輯工具。

2.1.3以mitoARS和OPT-panARS為復(fù)制子的載體淀粉酶的表達(dá)情況比較

不同復(fù)制子表達(dá)淀粉酶基因的蛋白表達(dá)量不同，以α-淀粉酶為報告蛋白，整合型質(zhì)粒pWY01為對照，將2種非整合型質(zhì)粒pWY02和pWY03轉(zhuǎn)入X33菌株后，選取生理驗證中水解圈較大的菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，將上清液進(jìn)行酶活測定，比較不同復(fù)制子的蛋白表達(dá)情況。分別于24、48、72h測定淀粉酶酶活，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，在48h酶活均達(dá)到最高，且含有非整合型質(zhì)粒的菌株WY02和WY03比含有整合型質(zhì)粒的菌株WY01表達(dá)α-淀粉酶酶活高，其中攜帶復(fù)制子OPT-panARS的菌株WY03酶活是整合型菌株WY01的2倍，含有復(fù)制子mitoARS的菌株WY02的酶活是整合型WY01的1.6倍。

綜上所述，本研究以畢赤酵母整合型質(zhì)粒pGAPZαA作為出發(fā)質(zhì)粒，分別以mitoARS和OPT-panARS作為復(fù)制子，構(gòu)建含不同復(fù)制子的α-淀粉酶表達(dá)質(zhì)粒及菌株。畢赤酵母中沒有穩(wěn)定的非整合型質(zhì)粒，與商用整合型載體相比，非整合型載體無需線性化處理，實驗操作更為方便，且研究顯示含有畢赤酵母ARS復(fù)制子的表達(dá)載體蛋白質(zhì)產(chǎn)量與轉(zhuǎn)化效率更高[23]。除常用的PARS1外，來自畢赤酵母線粒體中的mitoARS[16]與來自乳酸克魯維酵母基因組的panARS[24]均可作為游離質(zhì)粒的復(fù)制子。有研究對panARS的3個區(qū)域進(jìn)行突變，得到的OPT-panARS保持了強大的ARS活性且穩(wěn)定性優(yōu)于panARS[17]。本研究通過DNS法測定淀粉酶酶活。結(jié)果表明，mitoARS和OPT-panARS游離質(zhì)?？梢苑€(wěn)定傳代，并在無篩選壓力下使質(zhì)粒丟失，具備進(jìn)行外源基因表達(dá)及作為基因編輯工具質(zhì)粒的功能。與整合型質(zhì)粒相比，mitoARS和OPT-panARS非整合型質(zhì)?？截悢?shù)高，淀粉酶的表達(dá)量是整合型質(zhì)粒的2倍，這與文獻(xiàn)報道相一致。文獻(xiàn)[25]報道，畢赤酵母整合型質(zhì)粒表達(dá)熒光蛋白為單拷貝，復(fù)制子panARS為10余個拷貝，是整合型的7倍～9倍。本研究也側(cè)面表現(xiàn)出非整合型質(zhì)?？蓪崿F(xiàn)高拷貝數(shù)的表達(dá)。

2.2信號肽的分析與評估

2.2.1α-MF信號肽的優(yōu)化

釀酒酵母α-MF信號肽廣泛用于畢赤酵母重組蛋白的分泌表達(dá)。為了提高異源蛋白的分泌表達(dá)，在信號肽α-MF的pre區(qū)和pro區(qū)按照畢赤酵母的密碼子偏好性新增13個氨基酸[18]，獲得優(yōu)化后的α-MF信號肽，進(jìn)而構(gòu)建4種含有優(yōu)化后信號肽的重組質(zhì)粒及其對照質(zhì)粒，再將4種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化至畢赤酵母獲得工程菌株，分別是帶有原始信號肽α-MF的工程菌pWY03、帶有優(yōu)化后信號肽OPT-α-MF的工程菌pWY04、帶有Linker序列的原始信號肽α-MF-（GGGGS）1的工程菌pWY05和帶有Linker序列的優(yōu)化信號肽OPT-α-MF-（GGGGS）1的工程菌pWY06。借助淀粉酶作為報告蛋白，對經(jīng)過改造的α-MF信號肽引導(dǎo)淀粉酶的分泌能力進(jìn)行評估，將4種工程菌進(jìn)行搖瓶發(fā)酵，并分別于24、48、72h取樣，利用DNS法測定樣品裂解前后粗酶液的酶活，結(jié)果如圖5所示。

結(jié)果顯示，在24h和48h內(nèi)發(fā)酵液裂解后的酶活高于裂解前的酶活，而在72h達(dá)到一致。這表明信號肽在引導(dǎo)外源蛋白分泌表達(dá)時具有時間延遲的特點。因此，使用72h的樣品粗酶液的酶活，比較4種工程菌中的信號肽分泌能力。其中：含有OPT-α-MF-（GGGGS）1信號肽的菌株WY06酶活最高，是含有α-MF信號肽的對照菌株WY03酶活的2.4倍；含有OPT-α-MF信號肽的菌株WY04的酶活是對照菌株WY03酶活的1.4倍；含有α-MF-（GGGGS）1信號肽的菌株WY05酶活是對照菌株WY03酶活的1.24倍。實驗結(jié)果表明，改造后的α-MF信號肽比原始α-MF信號肽的酶活高，因此適當(dāng)改造信號肽對提高畢赤酵母分泌表達(dá)水平具有積極意義。

2.2.2畢赤酵母內(nèi)源信號肽的預(yù)測

為了選擇用于在畢赤酵母中分泌異源蛋白的新信號肽，通過對畢赤酵母分泌體進(jìn)行研究[26]，挑選15種畢赤酵母X33自身分泌的信號肽。使用在線分析軟件SignalP6.0[20]進(jìn)一步分析這15種潛在的信號肽序列，獲得預(yù)測的切割位點及各個蛋白的信號肽序列。氨基酸序列會影響信號肽酶對信號肽切割的效率[13]，因此將信號肽的氨基酸序列后延2位，保證信號肽切割位點的正常識別與切割，獲得的信號肽序列如表3所示。使用釀酒酵母α-MF作為對照，研究15種新信號肽的分泌效率。

2.2.3畢赤酵母內(nèi)源信號肽的評估

為了研究15種信號肽的分泌能力，借助通用引物和POE-PCR方法[21]，以構(gòu)建成功的重組載體pWY06為模板，將信號肽片段快速與模板質(zhì)粒序列融合，轉(zhuǎn)化畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞后獲得15種工程菌。再將含不同信號肽的15種工程菌以及含有α-MF信號肽的工程菌分別進(jìn)行發(fā)酵，以α-淀粉酶為指征蛋白，檢測重組菌株的生長情況以及α-淀粉酶酶活。選用72h發(fā)酵樣品上清液的酶活比較不同信號肽的分泌效率，結(jié)果如圖6所示。

由圖6可知：有7種畢赤酵母內(nèi)源信號肽分泌α-淀粉酶的能力比α-MF信號肽高，其中畢赤酵母FLO10、EXG1和MSB2信號肽引導(dǎo)淀粉酶的酶活分別是α-MF信號肽引導(dǎo)淀粉酶酶活的2.5倍、1.94倍和1.75倍；有4種信號肽（SCW10、GAS1、DSE4、PHO5）分泌α-淀粉酶的能力同α-MF信號肽差異不大；剩余4種信號肽（UTH1、CPR5、DAN4、PDI1）低于α-MF信號肽的分泌能力，其中PDI1分泌α-淀粉酶的能力最低。因此對于同一外源蛋白而言，不同的信號肽分泌蛋白質(zhì)的效率也不同，選擇并使用高效信號肽是提高畢赤酵母分泌表達(dá)外源蛋白的有效途徑。

綜上所述，釀酒酵母的α-MF信號肽是畢赤酵母中應(yīng)用最廣泛的信號肽，對α-MF信號肽的結(jié)構(gòu)和功能及相關(guān)分泌通路的詳細(xì)研究表明信號肽在協(xié)助胞外分泌中不可或缺[7]。本研究優(yōu)化的α-MF信號肽，不僅可以利用通用引物，方便構(gòu)建操作，而且淀粉酶的表達(dá)活性最高提高了2.4倍。根據(jù)生物信息挖掘與分析，確定了15種還未見其他文獻(xiàn)報道的內(nèi)源信號肽的氨基酸序列。利用通用引物和POE-PCR方法，建立了一個操作方便的信號肽庫，無需通過大腸桿菌構(gòu)建質(zhì)粒，可以直接與任何待表達(dá)基因融合，直接轉(zhuǎn)化畢赤酵母進(jìn)行篩選和評估。該方法高效簡便，為異源蛋白更廣泛分泌表達(dá)提供了新的操作工具和方案。通過測定淀粉酶酶活，評估15種畢赤酵母內(nèi)源信號肽，其中畢赤酵母FLO10、EXG1和MSB2信號肽引導(dǎo)的淀粉酶的酶活都高于商品質(zhì)粒常用的α-MF信號肽，可以為其他外源蛋白表達(dá)提供借鑒。

2.3營養(yǎng)依賴的篩選標(biāo)記的建立

2.3.1亞磷酸脫氫酶基因作為篩選標(biāo)記的可行性與有效性

以WY003為基礎(chǔ)質(zhì)粒，使用無縫克隆技術(shù)將質(zhì)粒中的博來霉素基因BleoR替換為亞磷酸脫氫酶基因ptxD，構(gòu)建攜帶ptxD基因的表達(dá)質(zhì)粒，并通過電穿孔法轉(zhuǎn)化到畢赤酵母X33菌株中，涂布于以亞磷酸為唯一磷源的SD篩選培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)化子生長正常。其生長圖如圖7所示。

對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR驗證，單克隆1號—4號擴增出的ptxD基因大小與目的條帶一致，獲得了具有ptxD篩選標(biāo)記的淀粉酶表達(dá)菌株WY07，結(jié)果如圖8所示，證明了ptxD可作為營養(yǎng)型篩選標(biāo)記基因用于轉(zhuǎn)化子的篩選。

利用淀粉酶水解圈對重組菌株WY07進(jìn)行生理驗證，如圖9所示。由圖9可知：對照菌株X33不含有淀粉酶基因，故影印于1%淀粉平板后，無法產(chǎn)生水解圈；而重組菌株WY07含有淀粉酶基因，可觀察到較大透明圈，說明以ptxD為篩選標(biāo)記基因的質(zhì)?？沙晒Ρ磉_(dá)淀粉酶基因，證明該篩選標(biāo)記在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)時篩選轉(zhuǎn)化子具有可行性。

2.3.2亞磷酸脫氫酶基因作為篩選標(biāo)記的穩(wěn)定性

將重組菌株WY07在以亞磷酸為唯一磷源的培養(yǎng)基中連續(xù)傳代培養(yǎng)，使用試劑盒提取傳至第10代的質(zhì)粒，進(jìn)行穩(wěn)定性檢測，質(zhì)粒大小應(yīng)為4817bp。通過使用內(nèi)切酶KpnⅠ進(jìn)行酶切驗證，電泳結(jié)果如圖10所示。M代表Trans5KDNAMarker；+代表陽性對照；1—3代表第10代菌株所提質(zhì)粒。由圖10可以看出，條帶大小正確，證明該質(zhì)粒經(jīng)以亞磷酸為唯一磷源的培養(yǎng)基傳10代仍可穩(wěn)定存在于畢赤酵母細(xì)胞內(nèi)。

2.3.3亞磷酸脫氫酶基因表達(dá)菌株的生長情況

將驗證正確的重組菌株WY07及野生型菌株X33分別在YNB全價培養(yǎng)基與SD培養(yǎng)基中培養(yǎng)，檢測其生長情況，繪制生長曲線，結(jié)果如圖11所示。

由圖10可知：野生型菌株由于不能利用亞磷酸，因而只能在YNB全價培養(yǎng)基中生長；含有亞磷酸脫氫酶基因的菌株既可以在YNB全價培養(yǎng)基中生長，也可以在SD培養(yǎng)基中生長。這表明，亞磷酸脫氫酶基因可以作為畢赤酵母的篩選標(biāo)記基因，達(dá)到篩選目的。但重組菌株WY07在YNB培養(yǎng)基中的生長速度高于SD培養(yǎng)基，表明菌株利用亞磷酸鹽生長較為緩慢。推測后續(xù)以亞磷酸鹽為唯一磷源進(jìn)行篩選時，轉(zhuǎn)化子生長所需時間將長于2～4d。鑒于重組菌株在以亞磷酸鹽為唯一磷源的篩選培養(yǎng)基中生長較慢，后續(xù)可以在轉(zhuǎn)錄水平及培養(yǎng)基配方上進(jìn)行優(yōu)化，使該基因能夠更好地發(fā)揮篩選標(biāo)記基因的作用。

綜上所述，篩選標(biāo)記基因是質(zhì)粒中必不可少的元件。近年來抗生素抗性標(biāo)記在轉(zhuǎn)基因微生物商業(yè)應(yīng)用中受到限制，所以開發(fā)安全性篩選標(biāo)記基因十分重要。磷是所有生物的必需營養(yǎng)元素，許多微生物體內(nèi)含有亞磷酸脫氫酶基因（ptxD），參與生物體中亞磷酸代謝[27]。但畢赤酵母只能利用五價的磷酸鹽而不能利用三價的亞磷酸鹽。本研究使用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建亞磷酸脫氫酶基因表達(dá)質(zhì)粒，驗證結(jié)果表明ptxD作為游離質(zhì)粒的篩選標(biāo)記基因是有效可行的，可以穩(wěn)定傳代。同抗生素相比，亞磷酸鹽是一種無毒、安全且價格低廉的化學(xué)品，克服了抗性基因篩選標(biāo)記的弊端，已在釀酒酵母[16]、水稻[28]中得到應(yīng)用，但在畢赤酵母中的應(yīng)用還未見報道。目前，以ptxD作為游離質(zhì)粒的篩選標(biāo)記基因存在的問題是在亞磷酸培養(yǎng)基上菌體生長的速度低于在磷酸培養(yǎng)基中的速度，后續(xù)研究還有待通過適應(yīng)性進(jìn)化加快其生長速度。

3結(jié)語

本研究以α-淀粉酶為報告蛋白，通過構(gòu)建非整合型質(zhì)粒、優(yōu)化α-MF信號肽、篩選內(nèi)源信號肽以及開發(fā)新的營養(yǎng)依賴的篩選標(biāo)記等多個方面對畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，含有非整合型質(zhì)粒的菌株WY03表達(dá)α-淀粉酶的酶活可達(dá)到含整合型質(zhì)粒菌株WY01的2倍，含優(yōu)化的α-MF信號肽的菌株WY06是含常規(guī)α-MF信號肽菌株WY03的2.4倍，篩選出的FLO10、EXG1和MSB2信號肽屬于畢赤酵母強信號肽，以亞磷酸脫氫酶基因ptxD為篩選標(biāo)記穩(wěn)定、安全且價格低廉，實現(xiàn)了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)在基因水平及蛋白轉(zhuǎn)運水平方面的優(yōu)化。

本研究僅針對自主復(fù)制序列、信號肽及篩選標(biāo)記等方面進(jìn)行了探索，尚未對培養(yǎng)基、菌株生長狀態(tài)等培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化和調(diào)整。后續(xù)工作將著眼于分子伴侶、糖基化修飾等方面，提高畢赤酵母外源蛋白的折疊、修飾效率，進(jìn)而提升畢赤酵母分泌型遺傳操作工具的性能。

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收稿日期：2023-09-01；修回日期：2024-03-26；責(zé)任編輯：張士瑩

基金項目：

國家科技支撐計劃項目（2015BAD15B0501）；河北省重點研發(fā)計劃項目（21372402D）

第一作者簡介：

張夢宇（1998—），女，河北石家莊人，碩士研究生，主要從事畢赤酵母分泌表達(dá)系統(tǒng)方面的研究。

通信作者：李天明。E-mail：dayafterday2006@163.com

馮惠勇，教授。E-mail：fenghuiyong@163.com

張夢宇，王祎涵，李涵，等.

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