黏細菌來源硫胺素酶Ⅰ的生理功能探究

摘要 為探究硫胺素酶Ⅰ 在黏細菌中的生理功能，選取Corallococcus sp. EGB、Myxococcus xanthusDK1622 和Cystobacter sp. 1404 三種不同種屬的黏細菌，研究3 種黏細菌基因組中硫胺素合成與菌株生長發(fā)育的關(guān)系。結(jié)果顯示，3 種黏細菌基因組中均具有完整的硫胺素合成途徑，且具有硫胺素合成前體嘧啶（4-amino-5-hydroxymethyl-2-methylpyrimidine，HMP）回收相關(guān)基因，但未發(fā)現(xiàn)硫胺素或其前體噻唑回收相關(guān)基因；HMP 合成酶基因thiC 上游存在的焦磷酸硫胺素核糖開關(guān)（TPP-riboswitch）可根據(jù)環(huán)境中硫胺素濃度調(diào)控thiC 基因的轉(zhuǎn)錄水平。菌株DK1622 及其硫胺素酶Ⅰ敲除突變株CL1003 中分別插入thiC 基因，構(gòu)建突變菌株CL1006 和CL1007，發(fā)現(xiàn)CL1006 在無硫胺素培養(yǎng)基中需要額外添加硫胺素或HMP 才能恢復(fù)生長，但相比于硫胺素處理組，HMP 處理組菌落直徑顯著增加了9.0%；CL1007 只能在添加HMP 平板中生長，單獨添加完整的硫胺素并不能使其恢復(fù)生長，但當硫胺素酶CcThi1 和硫胺素共同添加時，CL1007 的生長得到恢復(fù)。結(jié)果表明，黏細菌不直接利用外源硫胺素，但可通過硫胺素酶Ⅰ將其分解成嘧啶前體被利用。

關(guān)鍵詞 黏細菌； 硫胺素； 硫胺素酶Ⅰ； thiC 基因

中圖分類號 Q935 文獻標識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）04-0204-08

硫胺素又稱維生素B1，是最早被人們發(fā)現(xiàn)的水溶性維生素，由嘧啶環(huán)和噻唑環(huán)通過亞甲基橋連接組成，在生物體中起著維持正常糖代謝的作用，是一類十分重要的輔助因子［1］。在細胞中，硫胺素的生物活性形式為焦磷酸硫胺素（thiamine pyrophosphate，TPP），它以輔酶的形式參與了體內(nèi)許多生物過程，如糖酵解、磷酸戊糖途徑、三羧酸循環(huán)和一些氨基酸合成等過程［2］。自然界中大多數(shù)真菌、細菌和植物都可以自主合成硫胺素［3］。硫胺素的合成步驟已經(jīng)被報道，首先是前體噻唑和嘧啶的獨立合成，然后偶聯(lián)形成單磷酸硫胺素（thiamine monophosphate，TMP）后進一步形成TPP 參與生物體的各個反應(yīng)過程。TPP 是一些細菌和植物代謝過程中不可缺少的關(guān)鍵輔因子，這使得它們進化出多種途徑獲取TPP，包括利用環(huán)境中存在的前體物質(zhì)［4］。

硫胺素可被硫胺素酶催化分解，根據(jù)其催化過程中是否需要額外添加親核試劑，硫胺素酶分為硫胺素酶Ⅰ和硫胺素酶Ⅱ 2 種類型。硫胺素酶Ⅱ，又稱作TenA，需要水作為親核試劑，存在于細菌、古菌、真菌和植物中，細菌和古菌中分布較多［5-6］。TenA作為胞內(nèi)酶能夠回收利用環(huán)境中硫胺素的降解產(chǎn)物，如硫胺素在Bacillus halodurans 中被分解和去甲酰化生成氨基嘧啶，然后在TenA 催化下氨基被水中的羥基取代，生成前體HMP，用于新的硫胺素合成［7］。硫胺素酶Ⅰ的分布相對較窄，主要存在于某些特定種類的微生物和一些多細胞生物中，如黏細菌、芽孢桿菌（Bacillus spp.）、梭菌（Clostridium sp.）、某些蕨類、昆蟲、貝類、淡水和海洋魚類等［8-9］。硫胺素酶Ⅰ催化硫胺素分解是通過多種有機親核試劑實現(xiàn)［10］。研究表明動物硫胺素缺乏癥與硫胺素酶Ⅰ關(guān)系密切，如腳氣病的發(fā)生與人食用富含硫胺素酶Ⅰ食物有關(guān)，但該過程中硫胺素酶Ⅰ的生理功能卻一直未被確定［11-12］。硫胺素及其前體在生態(tài)環(huán)境中也被認為是驅(qū)動微生物之間相互作用的重要因素，但硫胺素酶Ⅰ在這個復(fù)雜的互作系統(tǒng)中所發(fā)揮的作用仍需進一步研究［12-13］。

黏細菌是一類具有獨特生命周期和多細胞群體行為的化能有機營養(yǎng)型革蘭氏陰性菌［14］，根據(jù)基因組信息，黏細菌被重新分類為黏細菌門（Myxococcota），包含黏球菌綱（Myxococcia）和多囊菌綱（Polyangia）2 個綱、4 個目、7 個科和24 個屬［15］。黏細菌在自然界中分布廣泛，北極苔原、酸性土壤、沙漠、溫帶、熱帶雨林、海洋和其他含鹽環(huán)境等都可以成為它的棲息地［16-17］。此外，黏細菌在土壤微生物中豐度較高。Zhou 等［18］對多種陸地土壤微生物群落進行分析，發(fā)現(xiàn)黏細菌在土壤總細菌群落中的相對豐度為0.4%～4.5%。在山東大學(xué)校園土壤中，在3% 的相似水平下，檢出黏細菌占細菌群落的4.10%，占總OTU 的7.5%，幾乎包含了所有已培養(yǎng)的黏細菌科或?qū)伲?8］。

作為微生物食物網(wǎng)結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵類群，黏細菌可以與包括細菌和真菌在內(nèi)的多種微生物相互作用［19-22］，如產(chǎn)生分泌水解酶瓦解病原真菌細胞壁［23］，產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物拮抗病原菌的生長［24］。南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點實驗室最新研究發(fā)現(xiàn)，黏細菌能分泌硫胺素酶Ⅰ拮抗大豆疫霉菌的生長并控制病害的發(fā)生。對于自然界的大多數(shù)生物來說，硫胺素是一種十分重要的營養(yǎng)物質(zhì)，黏細菌也不例外，其分泌的硫胺素水解酶似乎是對自身生長發(fā)育不利的，且微生物來源硫胺素酶Ⅰ的生理功能至今尚不明確。本研究通過解析黏細菌細胞內(nèi)硫胺素合成途徑及其關(guān)鍵基因的功能，闡明硫胺素酶Ⅰ在黏細菌生長發(fā)育過程中的生理作用，旨在為進一步探索硫胺素酶Ⅰ在其他生物體中的生理功能以及黏細菌在微生物關(guān)系網(wǎng)中所發(fā)揮的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究所使用Corallococcus sp. EGB 和Cysto?bacter sp. 1404 由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)環(huán)境微生物重點實驗室分離保藏。Myxococcus xanthusDK1622 為黏細菌模式菌株。

1.2 培養(yǎng)基類型

VY/4 固體培養(yǎng)基：0.25% 安琪酵母、0.1%CaCl2·2H2O、1.5% 瓊脂粉，pH 7.2。

LBS 液體培養(yǎng)基：0.7% 淀粉0.1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物、0.1% 硫酸鎂，pH 7.2。

不含維生素的CTT-1 液體培養(yǎng)基：1% 無維生素酪蛋白酸水解物（Sigma）、1 mmol/L PBS（pH7.6）、10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）、8 mmol/L Mg‐SO4·7H2O，pH 7.2。

YT 液體培養(yǎng)基：1% 胰蛋白胨、0.5% 酵母提取物。

合成培養(yǎng)基A1：0.01% L-天冬氨酸、0.01% L-苯丙氨酸、0.01% L-異亮氨酸、0.01% L-纈氨酸、0.005% L-亮氨酸、0.001% L-甲硫氨酸、0.000 1%VB12、0.5% 丙酮酸鈉、0.012 5% 亞精胺、0.5% 天冬氨酸（KOH 調(diào)節(jié)pH 至7.6）、10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.6）、KH2PO4-K2HPO4（pH 7.6）、10 μmol/L 氯化鐵、8 mmol/L 硫酸鎂、10 μmol/L 氯化鈣、0.05% 硫酸銨。

1.3 黏細菌中硫胺素合成途徑相關(guān)基因分析

利用Corallococcus sp. EGB、Myxococcus xan?thus DK1622 和Cystobacter sp. 1404 基因組，結(jié)合NCBI 和KEGG 數(shù)據(jù)庫并參考原核生物硫胺素合成途徑，分析3 種黏細菌中硫胺素合成途徑相關(guān)基因的存在情況。

1.4 硫胺素合成途徑關(guān)鍵基因表達情況

在不含維生素的CTT-1 液體培養(yǎng)基中分別添加5 μmol/L 和50 μmol/L 硫胺素培養(yǎng)菌株EGB，以不加硫胺素的培養(yǎng)基作為對照。在30 ℃ 搖床180r/min 條件下培養(yǎng)24 h，每2 h 取1 mL 菌液離心收集菌體后進行液氮速凍處理，保存于―80 ℃。將收集的菌體利用生工柱式 RNA 提取試劑盒（B518659，Sangon， China）進行RNA 提取，具體步驟參照試劑盒說明書。隨后使用諾唯贊反轉(zhuǎn)錄試劑盒（R333-01，Vazyme，China）將RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA，具體步驟參照試劑盒說明書。通過PCR 擴增測定硫胺素合成關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄情況，模板為反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，內(nèi)參基因為EGB 中的rpoB 基因，相關(guān)引物見表1。

1.5 硫胺素合成關(guān)鍵基因的插入失活

在黏細菌DK1622 的thiC（MXAN_4235）基因內(nèi)部選取1 009 bp 進行PCR 擴增（表1），利用諾唯贊同源重組試劑盒（C112-01，Vazyme，China）將擴增后獲得的目的片段與pBJ113 載體相連，具體步驟參照試劑盒說明書。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，將測序正確的轉(zhuǎn)化子使用諾唯贊公司試劑盒（DC201-01，Vazyme，China）進行質(zhì)粒大提，具體方法參照使用說明書。隨后將提取質(zhì)粒電轉(zhuǎn)至DK1622 菌體中，電轉(zhuǎn)步驟如下：將5 μL 質(zhì)粒加入到菌體后輕輕混勻轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的2 mm 電轉(zhuǎn)杯中進行電轉(zhuǎn)。在1 250 V、400 Ω、25 μF 的條件下電擊，結(jié)束后迅速加入1 mLYT 液體培養(yǎng)基，在搖床180 r/min 30 ℃條件下孵育6 h，隨后涂布于0.35% 的半固體YT 培養(yǎng)基（卡那霉素抗性），30 ℃培養(yǎng)4～5 d 后挑取明黃色菌落進行PCR 驗證確認菌株正確性。

1.6 黏細菌對硫胺素的利用試驗

在固體培養(yǎng)基CTT-1 條件下研究黏細菌對硫胺素的利用情況。采用YT 培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株DK1622、CL1003、CL1006、CL1007，5 d 后在固體平板上刮取菌落，經(jīng)無菌水洗滌3 次，用無菌水重懸菌體，統(tǒng)一濃度為OD600 nm=5。將0.1 μmol/L 硫胺素、0.1 μmol/L HMP 和0.1 μmol/L 硫胺素與CcThi1 的反應(yīng)產(chǎn)物（1 μmol/L CcThi1 與0.1 μmol/L 硫胺素處理24 h）、等體積無菌水（CK）分別添加到CTT-1 培養(yǎng)基后制備平板，將3 μL 制備好的黏細菌菌液點在平板培養(yǎng)基上，待菌液吹干后置于30 ℃培養(yǎng)1 d，統(tǒng)計菌落直徑。在液體培養(yǎng)實驗中，鑒于菌株DK1622 在CTT-1 液體培養(yǎng)基中生長狀態(tài)不佳的情況，選用合成培養(yǎng)基A1 進行液體實驗。將1 μmol/L 硫胺素、1 μmol/L HMP 和1 μmol/L 硫胺素與CcThi1 的反應(yīng)產(chǎn)物（1 μmol/L CcThi1 與0.1 μmol/L 硫胺素處理24h）分別添加到4 mL A1 培養(yǎng)基試管中進行試驗，搖床180 r/min 30 ℃條件下培養(yǎng)5 d，收集菌體并使用FastDNA? SPIN Kit（MP Biomedicals， Santa Ana，CA）提取菌體DNA，使用諾唯贊公司qPCR 試劑盒（Q511-02，Vazyme，China）對菌體生物量進行定量分析，具體步驟參照試劑盒說明書，相關(guān)引物見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 黏細菌硫胺素合成與回收途徑的分析

本研究以Corallococcus sp. EGB、Myxococcusxanthus DK1622 和Cystobacter sp. 1404 三種不同種屬來源的黏細菌基因組為代表，分析硫胺素合成途徑在黏細菌基因組中的存在情況（圖1）。結(jié)果顯示，3 種不同種屬來源的黏細菌基因組中都具有從頭合成硫胺素相關(guān)激酶的基因，表明黏細菌具有自主從頭合成硫胺素的能力。但需要注意的是，在外界硫胺素供應(yīng)充足的條件下，許多生物會直接利用外源硫胺素或前體并轉(zhuǎn)換為TMP 或TPP，而非自身合成，最大程度地減少生化過程的能量消耗。在3 株黏細菌的基因組中進一步分析均沒有發(fā)現(xiàn)與硫胺素和噻唑回收利用相關(guān)的3 種激酶（硫胺素激酶ThiK、硫胺素焦磷酸激酶ThiN 和噻唑激酶ThiM）的存在，推測黏細菌在回收利用硫胺素和噻唑前體方面可能存在一定限制。

2.2 硫胺素合成途徑中thiC基因的分析

分析不同種屬黏細菌硫胺素合成途徑發(fā)現(xiàn)，上述3 個種屬的黏細菌基因組均具有磷酸甲基嘧啶合酶（phosphomethylpyrimidine synthase，thiC）基因，該基因參與硫胺素生物合成途徑中嘧啶環(huán)的合成，將5-氨基咪唑核糖核苷酸（AIR）轉(zhuǎn)化為4-氨基-2-甲基-5-羥甲基嘧啶磷酸（HMP-P）或相關(guān)醇，是硫胺素合成途徑中的關(guān)鍵酶之一；并且在該基因上游存在TPP 核糖開關(guān)（TPP-riboswitch），而TPP 核糖開關(guān)通常被認為是可以根據(jù)硫胺素濃度控制基因轉(zhuǎn)錄的元件，當硫胺素濃度過高時，TPP 核糖開關(guān)就開始工作，從而控制相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄停止（圖2）。以上結(jié)果表明，細胞內(nèi)外硫胺素的濃度可能會影響基因thiC 的表達。

2.3 外源硫胺素濃度對黏細菌中thiC基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

為進一步驗證上述結(jié)果，本研究以菌株EGB 為研究對象，在其培養(yǎng)基中添加不同濃度硫胺素，測定thiC 基因的轉(zhuǎn)錄水平。由圖3 可知，添加不同濃度的硫胺素會導(dǎo)致EGB 中thiC 基因的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生明顯改變。在無維生素的CTT-1 培養(yǎng)基中分別添加無菌水、5 μmol/L 硫胺素和50 μmol/L 硫胺素，發(fā)現(xiàn)thiC基因的轉(zhuǎn)錄水平會隨著硫胺素濃度的增加而下調(diào)，在5 μmol/L 硫胺素和50 μmol/L 硫胺素添加2 h 后thiC 分別下調(diào)了約10% 和50%。以上結(jié)果表明硫胺素濃度對調(diào)控黏細菌基因組中編碼嘧啶合成酶基因thiC 的轉(zhuǎn)錄水平具有重要影響。環(huán)境中高濃度的硫胺素可能通過抑制細胞內(nèi)硫胺素合成途徑相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄抑制細胞內(nèi)硫胺素的合成，而此時黏細菌更傾向于利用外源硫胺素而不是通過自身合成。但在黏細菌EGB 基因組中并未發(fā)現(xiàn)硫胺素回收相關(guān)基因。因此，本研究推測黏細菌中硫胺素酶Ⅰ的存在可能與環(huán)境中硫胺素的回收利用有關(guān)。

2.4 thiC基因?qū)︷ぜ毦L的影響

為了更深入探究黏細菌和硫胺素的關(guān)系，本研究分別在菌株DK1622 和硫胺素酶Ⅰ基因敲除菌株CL1003 中插入thiC 基因，獲得突變菌株CL1006 和CL1007。由圖4 可知，具有自主合成硫胺素的能力的菌株DK1622 和突變菌株CL1003（ΔMAXN_4523），在無硫胺素的CTT-1 固體培養(yǎng)基上能正常生長，但插入失活了thiC 基因的突變菌株CL1006 和CL1007 則在CTT-1 培養(yǎng)基上失去了生長能力。在培養(yǎng)基中額外添加硫胺素后，突變菌株CL1006 恢復(fù)生長，但突變菌株CL1007 仍不能生長；在培養(yǎng)基中添加硫胺素前體HMP 時，突變菌株CL1007 恢復(fù)生長。隨后本研究將異源表達的硫胺素酶CcThi1 與硫胺素反應(yīng)后的產(chǎn)物加到CTT-1 培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)突變菌株CL1006 和CL1007 的生長狀態(tài)良好。但突變菌株CL1006 在添加HMP 和CcThi1+硫胺素的培養(yǎng)基中生長的菌落直徑比在只添加硫胺素的培養(yǎng)基中增加了9.0%，并且菌株DK1622 和突變菌株CL1003在試驗中也出現(xiàn)了相似的現(xiàn)象。

隨后，本研究在液體培養(yǎng)條件下做了同樣的試驗來驗證結(jié)果。在液體培養(yǎng)基A1 中分別添加硫胺素、硫胺素前體HMP、CcThi1 水解硫胺素的產(chǎn)物，收集培養(yǎng)5 d 后的DK1622、CL1003、CL1007 全部菌體，提取總DNA 并利用熒光定量PCR 測定其生物量。由圖5 可知菌株DK1622 和突變菌株CL1003 在4 種培養(yǎng)條件下均可生長，突變菌株CL1007 只有在添加HMP 和CcThi1 與硫胺素反應(yīng)后的產(chǎn)物時才會生長，該結(jié)果與固體平板上的結(jié)果一致。但突變菌株CL1006 在單獨添加外源硫胺素的液體培養(yǎng)基中并沒有表現(xiàn)生長跡象，與其在固體平板上的生長現(xiàn)象相反，推測可能是黏細菌在液體培養(yǎng)條件下所產(chǎn)生的硫胺素酶Ⅰ不足以分解硫胺素生成前體供自身使用。以上結(jié)果表明，硫胺素酶Ⅰ可以優(yōu)先將外源硫胺素分解供黏細菌利用。

3 討論

本研究對3 種不同種屬的黏細菌基因組進行比對分析發(fā)現(xiàn)，它們均具有從頭合成硫胺素的能力并且在編碼嘧啶合成酶相關(guān)基因（thiC）的上游都發(fā)現(xiàn)TPP 核糖開關(guān)，推測其可能與黏細菌合成硫胺素相關(guān)。黏細菌培養(yǎng)過程中thiC 基因的轉(zhuǎn)錄水平隨外源添加硫胺素濃度的增加顯著下調(diào)，表明黏細菌中thiC基因的轉(zhuǎn)錄受環(huán)境中硫胺素濃度的調(diào)控。硫胺素作為包括黏細菌在內(nèi)的許多生物重要的營養(yǎng)物質(zhì)，在生物生長代謝過程中起著關(guān)鍵作用［12］，黏細菌可以不依賴外部環(huán)境中的硫胺素進行細胞內(nèi)從頭合成，但其進化出外泌型硫胺素酶Ⅰ的生理生態(tài)功能需要進一步研究。Xia 等［9］研究發(fā)現(xiàn)，珊瑚球菌屬黏細菌EGB 能通過分泌硫胺素酶CcThi1 分解環(huán)境中硫胺素，抑制大豆疫霉菌的生長，表明硫胺素酶具有在生態(tài)環(huán)境中為黏細菌創(chuàng)造競爭優(yōu)勢的潛在作用。盡管硫胺素酶Ⅰ的發(fā)現(xiàn)證明了黏細菌在植物病原菌防治中的潛力，但該酶在黏細菌自身生長發(fā)育過程中的功能尚不清楚。

硫胺素酶自從20 世紀中期被發(fā)現(xiàn)以來，一直備受科學(xué)家們的關(guān)注。然而，科學(xué)家們至今仍未完全明確硫胺素酶Ⅰ的生理功能。前人研究認為Burk?holderia thailandensis 產(chǎn)生的硫胺素酶Ⅰ和硫胺素酶Ⅱ在生理功能上存在相似之處，參與硫胺素的收集利用并且供自身生長［12， 25］。雖然Burkholderia thai?landensis 能夠直接利用硫胺素，但在環(huán)境中存在硫胺素前體物質(zhì)時，該菌還是會優(yōu)先利用前體而不是外源硫胺素。在海洋細菌Candidatus pelagibacterstrain HTCC1062 中也有類似情況，硫胺素缺乏限制菌株的生長，但其并不能通過外源添加硫胺素來緩解［25］。相反，HTCC1062 只在HMP 存在時恢復(fù)生長［25］。同樣，真核浮游植物在生長過程中更傾向于利用嘧啶前體而非硫胺素［26］。本研究通過對黏細菌基因組進行分析，發(fā)現(xiàn)黏細菌擁有完整的硫胺素從頭合成能力，但環(huán)境中存在硫胺素時，黏細菌并不能直接吸收利用外源硫胺素，它們會利用自身分泌的硫胺素酶Ⅰ將硫胺素分解，釋放出可供使用的嘧啶前體。該過程使黏細菌相對于從更基礎(chǔ)成分合成硫胺素的生物而言具有一定的生態(tài)優(yōu)勢。此外，本研究推測黏細菌通過對外源硫胺素的分解以達到抑制直接利用外源硫胺素微生物生長的目的是一種適應(yīng)性競爭策略。該策略能夠保證黏細菌自身在微生物群落中的生長優(yōu)勢，但包括黏細菌在內(nèi)的很多微生物只能利用HMP 的原因仍然未知，該過程是否與硫胺素或HMP 的胞內(nèi)轉(zhuǎn)運過程相關(guān)需要進一步驗證。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了黏細菌具有從頭合成硫胺素的能力，但通過黏細菌基因組比對并未發(fā)現(xiàn)與硫胺素和噻唑回收相關(guān)酶的合成基因。TPP-binding核糖開關(guān)存在于thiC 基因的上游，并且thiC 基因的轉(zhuǎn)錄水平在環(huán)境中存在硫胺素時顯著下調(diào)。黏細菌無法直接利用外源硫胺素，而是通過其分泌的硫胺素酶CcThi1 將外源硫胺素水解成嘧啶供自身利用或直接利用外源HMP。

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（責任編輯：葛曉霞）