耐鹽芽孢桿菌SF-18 的生防潛能與基因組學(xué)分析

摘要 為從極端環(huán)境中分離具有優(yōu)良抗菌活性的生物防治菌劑，采用稀釋涂布平板法從新疆阿克蘇鹽堿地土樣中分離篩選到1 株具有明顯抑菌作用的耐鹽菌株SF-18；以大麗輪枝菌為指示菌，利用牛津杯法測定該菌株發(fā)酵液拮抗活性的穩(wěn)定性，并利用2 代和3 代測序技術(shù)獲得該菌株完整的基因組序列，對測序數(shù)據(jù)進行基因組裝、預(yù)測、功能注釋及次級代謝產(chǎn)物合成基因簇預(yù)測。結(jié)果顯示，該菌株對金黃色葡萄球菌和大麗輪枝菌具有明顯的抑制作用，能在18% NaCl 的條件下生長；SF-18 菌體發(fā)酵液在-20～80 ℃均具有較強的抑菌活性，能耐受pH 5～12 的酸堿度環(huán)境；通過16S rDNA 基因和gyrB 基因序列分析，鑒定SF-18 菌株隸屬于芽孢桿菌屬（Bacil?lus）；全基因序列分析結(jié)果顯示菌株有480 個基因參與了多種碳源的代謝，含有編碼亞精胺和海藻糖等與菌株抗逆性相關(guān)化合物合成的基因，以及能夠降解病原菌細胞壁的葡聚糖酶、幾丁質(zhì)酶等酶的相關(guān)基因；次生代謝產(chǎn)物預(yù)測分析SF-18 含有合成bacillaene、bacillibactin 等多種抗性化合物的基因簇，推測菌株SF-18 可能通過產(chǎn)生抑菌性的次生代謝產(chǎn)物以及相關(guān)降解酶來達到抑菌的效果，在農(nóng)業(yè)生物防治中具有較好的應(yīng)用前景。

關(guān)鍵詞 耐鹽菌； 芽孢桿菌； 生物防治； 基因組學(xué)； 大麗輪枝菌； 次生代謝產(chǎn)物

中圖分類號 S476.1 文獻標(biāo)識碼 A 文章編號 1000-2421（2024）04-0192-12

生物防治與化學(xué)防治相比，具有高效、安全、無毒等綠色環(huán)保優(yōu)勢，在多種病蟲害防治中得到廣泛應(yīng)用。利用有益微生物防治植物病害起始于利用真菌防治猝倒?。?］，目前防治植物病害的有益微生物種群已經(jīng)涵蓋到真菌、放線菌、細菌甚至病毒 （噬菌體） 等多種微生物，其中芽孢桿菌屬（ Bacillus）、假單胞菌屬 （Pseudomonas） 等微生物應(yīng)用最多，尤其是芽孢桿菌屬，因其營養(yǎng)需求簡單、抗逆性強、生長速度快、殺菌高效、具有廣譜抑菌活性、對人和動物無害、廣泛分布于土壤、植物表面及內(nèi)部等特點，是生防菌篩選的理想對象［2-3］。目前，芽孢桿菌屬防治植物真菌病害應(yīng)用廣泛，種類包括枯草芽孢桿菌（B.subtilis）［4-5］、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）［6-7］、貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis） ［8-9］、蘇云金芽孢桿菌（B. thuringiensis）［10］、側(cè)孢芽孢桿菌（B. lat?erosporus） ［11］、凝結(jié)芽孢桿菌（B. coagulans）［12］、地衣芽孢桿菌（B. licheniformis） ［13］、短短芽孢桿菌（Bre?vibacillus brevis） ［14］、短小芽孢桿菌（ B. pumilus）［15］、堅強芽孢桿菌（B. firmus）［16］等。

芽孢桿菌的生物防治機制主要體現(xiàn)在通過分泌抗菌物質(zhì)拮抗病原菌、與病原菌競爭營養(yǎng)和空間位點［1］、溶菌作用、誘導(dǎo)植物產(chǎn)生抗病性以及對植物的促生作用［17］等，其中最主要的抑菌機制是對病原菌的拮抗作用。芽孢桿菌屬的菌株生長代謝過程中分泌的抗菌物質(zhì)已達到60 多種，包括脂肽類、多肽類、聚酮類、酶類和其他抗菌活性物質(zhì)等［3］。脂肽類化合物和多肽類化合物由非核糖體途徑 （nonribosomalpeptides sythetase，NRPS） 產(chǎn)生，按照結(jié)構(gòu)差異主要分為三大類：豐原素（fengycin）、伊枯草菌素 （iturin）和表面活性素（ surfactin）等；桿菌素（ bacillaene）、大環(huán)內(nèi)酰亞胺（ macrolactin H） 和地非西丁（ difficidin）等聚酮類化合物由聚酮合成酶（polyketidesynthase，PKS） 途徑合成；通過核糖體途徑（ ribosomal synthesis，RS） 產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)主要有細菌素和蛋白酶類，如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶、纖維素酶、脂肪酶等多種真菌細胞壁裂解酶，對于抑制病原真菌非常有效［18］。

近年來，生防細菌不斷被發(fā)掘和研究，測序技術(shù)的發(fā)展使得多種芽孢桿菌屬細菌，如貝萊斯芽孢桿菌（B. velezensis）［8，19］、枯草芽孢桿菌（B. subtil?is）［ 4-5］、解淀粉芽孢桿菌（ B. amyloliquefaciens） ［20-21］的全基因組序列獲得解析，尋找新的具有病原真菌拮抗作用的細菌的難度越來越大，因此，從極端環(huán)境中分離具有優(yōu)良抗菌活性的特殊菌株逐漸成為研究熱點［22］。鹽堿地分布廣泛，約占地球陸地總面積的1/4。中國的鹽堿土資源非常豐富，鹽堿地面積超過3 300 萬hm2。鹽堿土壤中含有豐富的耐鹽、耐堿微生物資源，對于鹽堿地的高效改良具有重要的研究價值和現(xiàn)實意義［23］。

本研究從新疆阿克蘇鹽堿地土樣中分離篩選獲得1 株具有明顯抑菌作用的耐鹽菌株SF-18，對該菌株進行序列分析鑒定，測定溫度、酸堿度處理下該菌株的發(fā)酵液對大麗輪枝菌的抑菌活性及其穩(wěn)定性；利用2 代和3 代測序技術(shù)，獲得該菌株完整的基因組序列，分析、挖掘抑菌活性物質(zhì)的遺傳基礎(chǔ)，以期為該菌株抑菌機制的研究以及作為生物防治菌劑的進一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

耐鹽菌株SF-18，從新疆阿克蘇鹽堿地土樣中用稀釋涂布平板法分離獲得；指示菌為金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus） 和棉花黃萎病病原菌大麗輪枝菌（ Verticillium dahliae Kieb.）。

1.2 培養(yǎng)基

篩選培養(yǎng)基：酵母粉 10 g，胰蛋白胨5 g，KCl 2g，MgSO4·7H2O 2 g，蒸餾水 1 000 mL，調(diào)節(jié)pH 值至7.0，瓊脂1.5 g/100 mL，加入質(zhì)量分數(shù)為3%、5% 的NaCl 制成高鹽篩選培養(yǎng)基。121 ℃濕熱滅菌20 min后，倒平板備用。

1.3 菌株的分離與純化

采用10 倍梯度稀釋法，將土樣粉末稀釋至10-3、10-4，每個稀釋梯度的土樣懸液取100 μL，分別均勻涂布到質(zhì)量分數(shù)為3%、5% NaCl 的高鹽篩選培養(yǎng)基平板各1 個，37 ℃恒溫培養(yǎng)2 d，觀察其生長情況。挑取單菌落劃線純化并編號，劃線平板同樣使用相對應(yīng)質(zhì)量分數(shù)NaCl 的篩選培養(yǎng)基。

1.4 菌株的分子鑒定

芽孢桿菌屬內(nèi)的各物種間親緣關(guān)系較近，僅分析16S rDNA 序列難以鑒別芽孢桿菌屬內(nèi)的物種，gyrB基因（ 編碼DNA促旋酶B亞單位蛋白） 是可替代16S rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育標(biāo)記，可有效區(qū)分芽孢桿菌屬內(nèi)菌種之間的差異［24］。根據(jù)菌株SF-18 全基因組注釋結(jié)果，選取其中16S rDNA 基因和gyrB 基因序列，通過BLAST 程序與NCBI 數(shù)據(jù)庫中已有的序列比對，比較分析同源性并構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（MEGA7.0.26 軟件）。

1.5 菌株的抑菌性能研究

采用牛津杯法測定菌株的抑菌性能［25］。用接種環(huán)挑取菌株SF-18，接種于裝有5 mL LB 液體培養(yǎng)基的血清瓶中，37 ℃、180 r/min 恒溫振蕩培養(yǎng)12～16 h，得菌體懸液。指示菌金黃色葡萄球菌的過夜培養(yǎng)物稀釋至106 個/mL，取0.1 mL 均勻涂布LB 固體培養(yǎng)基平板；用已滅菌的棉簽蘸取指示菌大麗輪枝菌的孢子，均勻涂抹到PDA 培養(yǎng)基平板上；用鑷子夾取已滅菌的牛津杯放置在固體平板上，牛津杯內(nèi)加入100 μL 菌液SF-18，將平板正放于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3～4 d，觀察抑菌效果。

1.6 菌株的耐鹽性

配制含質(zhì)量分數(shù)3%、5%、10%、15%、18%、20%、30% NaCl 的LB 固體培養(yǎng)基平板，接種菌株SF-18 和枯草芽孢桿菌（B. subtilis） CCTCC AB90008（正常LB 固體培養(yǎng)基，對照），每個處理3 個重復(fù)，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱倒置培養(yǎng)2～4 d，觀察生長狀況。

1.7 菌株的發(fā)酵液穩(wěn)定性研究

菌株的發(fā)酵液穩(wěn)定性研究參照文獻［8］進行。先制備種子液，再獲得發(fā)酵液。發(fā)酵液于4 ℃ 、12 000 r/min 離心5 min，棄菌體收集上清液用于發(fā)酵液穩(wěn)定性實驗。

1）溫度對菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響。取本文“1.7”上清液，進行溫度耐受能力檢測［26］，溫度處理分別為-20、20、37、60、80、100 ℃，處理時間為2 h，處理后恢復(fù)室溫，取100 μL 處理后的上清液，加入牛津杯中，每個處理做3 個平行，觀察菌株SF-18 對大麗輪枝菌的抑菌效果，檢測其抗菌能力。

2）pH 對菌株發(fā)酵液穩(wěn)定性的影響。取本文“1.7”上清液，對其進行pH 耐受能力檢測，pH 處理為2、4、6、8、10、12（ 以上清液原始pH為對照），處理時間為4 h，處理之后調(diào)回至原始pH 值［25］，取100 μL 處理后的上清液，加入牛津杯中，每個處理做3 個平行，觀察菌株SF-18 對大麗輪枝菌的抑菌效果，檢測其抗菌能力。

1.8 菌株SF-18 的全基因組測序和分析

1）全基因組測序。將在LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至指數(shù)期的菌株SF-18 離心收集菌體，提取其基因組 DNA，委托金唯智（ Genewiz） 公司進行全基因組測序，測序平臺為Illumina Novaseq 和PacBio sequel，對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)控分析，再利用軟件HGAP4 或者Falcon（version 0.3） 進行初步組裝，將過濾掉低質(zhì)量的二代測序數(shù)據(jù)比對到組裝結(jié)果上，使用軟件Pilon對組裝結(jié)果進行進一步的校正，得到最終的完整的染色體序列。

利用軟件Prodigal （3.02） 版本對編碼基因進行預(yù)測；利用Rfam （version 12.0） 數(shù)據(jù)庫對非編碼RNA，如rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA 和microRNA等多種已知功能的 RNA 及一些未知功能的RNA 等進行預(yù)測。

2） 基因功能分析?；蚬δ茏⑨尵闟F-18 預(yù)測得到的基因序列，通過BLAST 程序與非冗余蛋白數(shù)據(jù)庫 （non-redundant protein database， NR）、基因功能數(shù)據(jù)庫 （Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）、同源蛋白簇數(shù)據(jù)庫 （cluster of orthologousgroups of proteins，COG）、數(shù)據(jù)庫GO（gene ontology）、碳水化合物相關(guān)的酶數(shù)據(jù)庫CAZy（carbohydrate-active enzymes database） 等數(shù)據(jù)庫進行比對分析，注釋得分最高的比對結(jié)果（一致性和覆蓋率 均默認≥40%），獲得功能注釋信息。

在網(wǎng)站http：// antismash.secondarymetabolites.org 提交菌株的全基因組序列，預(yù)測其合成次級代謝產(chǎn)物的基因簇，將基因注釋結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫BLAST 比對結(jié)果進行綜合分析，推測分析菌株SF-18 中編碼次級代謝產(chǎn)物的基因簇和可能的抑菌物質(zhì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株SF-18 對金黃色葡萄球菌和大麗輪枝菌的抑制作用

本研究從新疆阿克蘇鹽堿地土樣中分離篩選獲得的耐鹽菌株SF-18，菌體為桿菌，形成芽孢，菌體長2.0～2.5 μm，寬0.5～0.8 μm，革蘭氏染色結(jié)果為陽性，菌落半透明突起，乳白色，吲哚實驗陽性，VP 實驗陽性。

拮抗實驗發(fā)現(xiàn)，菌株SF-18 對金黃色葡萄球菌和大麗輪枝菌均具有較好的抑制作用，結(jié)果如圖1 所示，抑菌圈直徑分別為（2.87±0.05） cm 和（3.4±0.1） cm。

2.2 菌株SF-18 的耐鹽性及其發(fā)酵液抑菌作用的穩(wěn)定性

菌株對NaCl 的耐受實驗結(jié)果（表1）顯示，在質(zhì)量分數(shù)3%、5%、10% 的NaCl 條件下，SF-18 菌體生長迅速且生長狀況良好，與菌株CCTCC AB 90008（正常LB 固體培養(yǎng)基，對照）的生長狀況無差異；Na‐Cl 質(zhì)量分數(shù)為15% 時，菌體生長需要2 d，分泌黏液較多；NaCl 質(zhì)量分數(shù)為18% 的條件下，菌體生長需要4 d 且菌落較少，培養(yǎng)至7 d 左右，菌落增多；NaCl質(zhì)量分數(shù)為20% 時，菌體沒有生長。而對照菌株枯草芽孢桿菌 （B. subtilis） CCTCC AB 90008 僅在質(zhì)量分數(shù)3%、5% 的NaCl 條件下生長迅速且生長狀況良好，隨著NaCl 質(zhì)量分數(shù)升高，菌體不生長。

以大麗輪枝菌為指示菌，測定菌株SF-18 發(fā)酵液抑菌作用的穩(wěn)定性，結(jié)果如圖2 所示。SF-18 菌株的抑菌活性物質(zhì)能耐受－20～80 ℃的溫度條件 （圖2A），在此范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，抗菌活性有所下降，但不能耐受100 ℃的高溫（ 結(jié)果未顯示）。pH穩(wěn)定性結(jié)果顯示，該菌株的抑菌物質(zhì)能耐受較寬的酸堿環(huán)境范圍，在pH 12 的條件下仍然具有較強的抑菌活性，在pH 5的條件下抑菌活性最強（ 圖2B）。

2.3 菌株SF-18 的基因組分析

菌株SF-18 的基因序列位于1 條染色體上，不含質(zhì)粒，全基因組大小為3 759 102 bp，平均GC 含量為45.14%，共編碼4 392 個基因、80 個rRNA、82 個tRNA和115個非編碼RNA（ ncRNA）。

基于菌株SF-18 的16S rDNA 序列和gyrB 基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖3 所示。16S rDNA 序列比對結(jié)果顯示，菌株SF-18 與菌株B. swezeyi DY301和B. licheniformis FJAT-44717 聚在一起，再與B.swezeyi ADL021 等多株菌株聚為一簇（圖3A）；gyrB基因的序列比對結(jié)果顯示，菌株SF-18 與菌株B.swezeyi DY301 聚在一起，再與B. glycinifermentansSRCM12603、 B. sonorensis SRCM101395、B. licheni?formis ATCC 14580 等菌株聚成一簇（圖3B）。因此，SF-18 隸屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），與斯韋澤伊芽孢桿菌（ B. swezeyi） 親緣關(guān)系最近。

2.4 基因組序列的功能注釋結(jié)果

將預(yù)測到的菌株SF-18 各基因的蛋白序列，與NR、COG、GO、KEGG、CAZy 等多個數(shù)據(jù)庫進行比對，獲得功能注釋，結(jié)果如表2 所示。NR 數(shù)據(jù)庫中基因獲得功能注釋最多，基因組的4 392 個基因均得到注釋；在COG、KEGG 和GO 數(shù)據(jù)庫分別有3 733、2 439、1 473 個基因獲得功能注釋，分別占基因總數(shù)的84.99%、57.60% 和33.54%；有480 個基因在CAZy數(shù)據(jù)庫中獲得注釋，是本研究使用的數(shù)據(jù)庫中獲得基因功能注釋最少的，僅占基因總數(shù)的10.93%。

1）COG 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果分析。菌株SF-18 中84.99% 的編碼蛋白基因 （3 733 個基因） 在COG 數(shù)據(jù)庫中得到注釋（ 圖4），分為21個COG亞類，其中，常規(guī)功能預(yù)測基因471 個，未知功能基因353 個，分別占總蛋白序列的10.72% 和8.04%。此外，aminoacid transport and metabolism （氨基酸運輸與代謝）、transcription （轉(zhuǎn)錄）、carbohydrate transport and metabolism（碳水化合物運輸及代謝） 和inorganic iontransport and metabolism （無機離子運輸與代謝） 是含量較為豐富的幾個亞類，其參與基因分別為362、322、320 和232 個，分別占總蛋白序列的8.24%、7.33%、7.29% 和5.28%。

2）GO 注釋結(jié)果分析。GO 數(shù)據(jù)庫注釋結(jié)果顯示，菌株SF-18 基因組中基因富集到3 個方面共1 473 個GO terms 中（圖5）。其中，biological process（生物學(xué)過程）共14 個分支，被注釋到2 530 個基因，metabolic process、cellular process 和localization 分支中涉及的基因最多，各有990、667 和355 個基因；molecularfunction（分子功能） 12 個分支共有3 046 個注釋結(jié)果，注釋結(jié)果最多的3 個分支是binding、catalyticactivity、transporter activity，分別為1 460、1 054 和236個基因。cellular component（細胞組分） 8個分支中注釋到992 個基因，與membrane part、membrane、cellpart有關(guān)的基因相關(guān)性最高，分別有302、275和219個。

3）KEGG 注釋結(jié)果分析。KEGG 數(shù)據(jù)庫比對分析發(fā)現(xiàn)，SF-18 基因組中共有2 439 個編碼蛋白富集到6 大類信號通路層次的40 條代謝通路中，占基因總數(shù)的55.53%，其中21 條代謝通路的基因數(shù)大于20個 （圖6），參與metabolism （代謝類） 通路的基因最多，其次是環(huán)境信息處理類通路。在metabolism 通路中，基因注釋結(jié)果最多的分別是carbohydrate metabolism（碳水化合物代謝），有385 個基因注釋結(jié)果、amino acid metabolism（ 氨基酸代謝），有283個基因被注釋 以及global and overview maps （全局和概述圖譜）通路，有280 個基因注釋結(jié)果；在環(huán)境信息處理類通路，最多的注釋結(jié)果集中在membrane transport（膜轉(zhuǎn)運）有153個基因被注釋 和signal transduction（信號轉(zhuǎn)導(dǎo)） 通路，有136個基因被注釋。KEGG結(jié)果說明菌株SF-18 中存在豐富的代謝通路，暗示著菌株具有非?；钴S的代謝活動。

4）CAZy功能分析。CAZy數(shù)據(jù)庫比對分析（表3）顯示，屬于CAZy家族的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域（ 6大類別） 的編碼基因在菌株SF-18 基因組中共有480 個，其中，208 個基因編碼的蛋白屬于糖苷轉(zhuǎn)移酶家族（glycosyltransferases，GTs）、131 個屬于糖苷水解酶 （glycosidehydrolases，GHs）家族、49 個編碼碳水化合物酯酶（carbohydrate esterases，CEs，）、4 個編碼輔助氧化還原酶（auxiliary activities ，AAs）、8 個編碼多糖裂解酶（polysaccharide lyases，PLs）、80 個編碼碳水化合物結(jié)合模塊（carbohydrate-binding modules，CBMs，），其中，在整個基因家族占比較高的是糖苷轉(zhuǎn)移酶家族的蛋白（GTs） （43.33%） 和糖苷水解酶（GHs）家族（27.29%）。對這些基因家族進行分析發(fā)現(xiàn)，SF-18基因組中含有編碼幾丁質(zhì)酶（ chitinase） 的基因（ GH18、GH19、GH48和CBM50等）、纖維素酶（cellulase） 的基因（ GH5、GH9、GH12、GH26、GH48等），降解木聚糖的相關(guān)酶基因 （GH18、GH26、CBM9、CBM13 等），降解肽聚糖的相關(guān)酶基因（GT51、CBM50等），降解葡聚糖酶（ glucanase） 的相關(guān)酶基因 （GH1、GH3、GH9、GH12、GH16、GH48、GH51等），以及編碼溶菌酶（ lysozyme） 的相關(guān)酶基因（ GH23、GH25等） 等。因此，從基因角度推測，菌株SF-18 潛在地具有降解幾丁質(zhì)、葡聚糖、纖維素、木聚糖、肽聚糖等物質(zhì)的能力。

2.5 菌株SF-18 的次級代謝產(chǎn)物合成基因簇分析結(jié)果

芽孢桿菌的抑菌活性與其產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物關(guān)系密切［18］。預(yù)測菌株SF-18有 16個次級代謝產(chǎn)物基因簇（表4），分析具有抗菌活性的物質(zhì)如下：聚酮化合物（bcillaene）、schizokinen、丁酰苷菌素（butirosin）、抗霉枯草菌素 （mycosubtilin）、豐原素（fengycin）、普切明酸（ pulcherriminic acid）、兒茶酚型嗜鐵素（bacillibactin）、mersacidin、zwittermicin A 等。這些次級代謝產(chǎn)物基因簇中，豐原素（fengycin）、兒茶酚型嗜鐵素（bacillibactin）、抗霉枯草菌素（ mycosubtilin） 通過非核糖體途徑 （NRPS） 合成，聚酮化合物（bcillaene）通過聚酮合成酶途徑（ PKS） 合成；羊毛硫類細菌素（mersacidin） 是通過核糖體途徑（ RS） 合成。

對這些基因簇進行分析，發(fā)現(xiàn)Cluster 1、Cluster14 和Cluster 16 這3 個基因簇能比對到完全相似的已鑒定基因簇，分別與菌株B. velezensis FZB42 的bacillaene合成基因簇（BGC0001089），Bacillus sp.WMMC1349 的bacillibactin/bacillibactin E/bacillibactinF 合成基因簇（BGC0002695）、Bacillus sp.HIL-Y85/54728 的mersacidin 合成基因簇（BGC0000527） 的相似性均為 100%；Cluster 6、Cluster 7、Cluster 5 和Cluster 10 這4 個基因簇與已鑒定的基因簇具有較高的相似性，如Cluster 6 與B.subtilis subsp. spizizenii ATCC 6633 的mycosubtilin合成基因簇 （BGC0001103） 具有50% 的相似性，Cluster 7 與B. velezensis FZB42 的fengycin 合成基因簇 （BGC0001095） 具有60% 的相似性；Cluster 5 與schizokinen 合成基因簇 （BGC0002683） 相似性為60%；Cluster 10 與cytolysinClyLl/cytolysin ClyLs 合成基因簇 （BGC0000504） 相似性為40%；有2 個基因簇與已鑒定的基因簇存在一定的相似性，如Cluster4與B. circulans 的丁酰苷菌素（butirosin）基因簇（BGC0000693） 相似性為 7%；Cluster 3 與B. cereus的雙效菌素（ zwittermicin A）基因簇（ BGC0001059）相似性為22%；菌株SF-18 中還存在一些功能未知的基因簇 （Cluster 2、8、9、11、13、15），包括phospho‐nate 2 種、萜類（terpene） 1種、T3PKS（ type III PKS）類 1 種、RiPP-like 1 種、RRE-containing 1 種。

2.6 其他抗菌相關(guān)因子

菌株SF-18能夠耐受18%的NaCl，分析其基因組序列，發(fā)現(xiàn)基因組中具有產(chǎn)生亞精胺（ spermidine） /腐胺（ putrescine） 合成酶和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基因，以及海藻糖蛋白代謝等與菌株的抗逆性密切相關(guān)的基因；也存在與誘導(dǎo)寄主抗性相關(guān)的合成乙酰乳酸合酶與乙酰乳酸脫羧酶等的基因，從基因角度說明菌株SF-18能夠誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性。在基因組中，還含有編碼植酸酶（ phytase） 的編碼基因。

3 討論

芽孢桿菌屬細菌如枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、貝萊斯芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等作為生防菌，防治多種作物病害成效顯著，這些生防菌多數(shù)從植物根際等生境中獲得，不同的芽孢桿菌對環(huán)境的抗逆性程度不同。

本研究從新疆阿克蘇鹽堿地土樣中分離篩選到1 株耐鹽芽孢桿菌SF-18，經(jīng)16S rDNA 序列分析初步鑒定為芽孢桿菌屬（ Bacillus），與斯韋澤伊芽孢桿菌（B. swezeyi）親緣關(guān)系最近。由于芽孢桿菌屬內(nèi)的物種間親緣關(guān)系較近，可以采用編碼DNA 促旋酶B亞單位蛋白的gyrB 基因來提高芽孢桿菌鑒定的準(zhǔn)確度［24］，因此，本研究基于16S rDNA 序列構(gòu)建了菌株SF-18 的系統(tǒng)進化樹，通過gyrB 基因再次確定了SF-18 的系統(tǒng)進化關(guān)系。

菌株SF-18 基因組全長3 759 102 bp，平均GC含量為45.14%，共編碼4 392 個基因。芽孢桿菌具有生防潛能的關(guān)鍵因素是其產(chǎn)生的抑菌次級代謝產(chǎn)物［27］，SF-18 基因組中存在大量與抗菌物質(zhì)合成相關(guān)的基因簇，包括與聚酮化合物bcillaene、兒茶酚型嗜鐵素（bacillibactin）、羊毛硫類細菌素mersacidin 等物質(zhì)完全一致的合成基因簇，同源性較高的豐原素（fengycin）、schizokinen、抗霉枯草菌素 （mycosubtilin）等合成基因簇，以及同源性不高的丁酰苷菌素（butirosin） 和zwittermicin A 的合成基因簇。多聚烯類抗生素bcillaene 由聚酮合成酶途徑 （PKS） 合成，能抑制蛋白質(zhì)的合成［28］，對細菌和真菌均有抑制作用；兒茶酚型嗜鐵素bacillibactin 通過非核糖體途徑（NRPS） 合成，是一種對鐵離子具有高親和性的螯合劑，通過對病原菌生長和發(fā)揮活性必需的可溶性鐵離子的競爭作用抑制病原菌的生長而發(fā)揮生防功效［29］。羊毛硫類細菌素mersacidin 通過核糖體途徑（RS） 合成，屬于Class Ⅱ類的羊毛硫肽，能結(jié)合lipid Ⅱ這一合成細菌肽聚糖的重要前體，使得摻入葡萄糖和D-丙氨酸受到抑制，從而阻止細菌細胞壁的單體聚合形成具有功能的胞壁質(zhì)［30］。豐原素（fengycin）存在于多種芽孢桿菌中的廣譜性抗菌物質(zhì)，過改變病原真菌生物膜的結(jié)構(gòu)與通透性進一步影響脂膜的穩(wěn)定性和完整性，從而產(chǎn)生抑菌作用［31］；抗霉枯草菌素（mycosubtilin）屬于伊枯草菌素家族的抗菌肽，由聚酮合酶-NRPS 雜合體系合成，通過影響細胞膜的完整性和改變膜的通透性而引起菌體的死亡［32］；schizokinen 是一種鐵載體，與結(jié)合并利用外源異羥圬酸型嗜鐵素相關(guān)［33］；普切明酸（pulcherriminic acid）能夠通過螯合鐵離子抑制病原微生物的生長［34］；丁酰苷菌素（butirosin）是一種氨基糖苷類抗生素，有效作用于沙門氏菌等革蘭氏陰性菌［35］；雙效菌素 zwittermicinA 是自然界發(fā)現(xiàn)的第一種水溶性氨基多元醇小分子抗生素，是一類新抗生素，同時具備非核糖體肽和聚酮雜合特征，對多種微生物的生長起到抑制作用［36］。此外，SF-18 基因組中還包含有6 種功能未知的基因簇。該菌株對金黃色葡萄球菌和大麗輪枝菌的抑制活性可能就是與這些已知的具有良好抑菌活性的物質(zhì)相關(guān)，而其他功能尚不明確的代謝產(chǎn)物的存在也可能對該菌株的抑菌活性有一定作用。

真菌細胞壁由多糖組成，主要成分為幾丁質(zhì)、β-1，3-葡聚糖、甘露聚糖、纖維素和半乳糖聚合物等，結(jié)構(gòu)復(fù)雜［37］。真菌的細胞壁在真菌的存活中起著至關(guān)重要的保護作用，細胞壁結(jié)構(gòu)的破壞會導(dǎo)致細胞質(zhì)膜的破裂與細胞的溶解［38］。幾丁質(zhì)在幾丁質(zhì)酶的作用下水解生成2- 乙酰氨基-2- 脫氧-D- 葡萄糖（GlcNAc），葡聚糖酶、纖維素酶和肽聚糖酶等能與幾丁質(zhì)酶協(xié)同作用，破壞真菌細胞壁結(jié)構(gòu)的完整性，進而抑制真菌菌絲的生長和孢子的萌發(fā)，從而達到生物防治的效果［39］，因此，各種細胞壁的降解酶也可作為一種重要的抑菌物質(zhì)用于真菌病害的防治。在菌株SF-18 基因組中共獲得480 個CAZy 家族的編碼基因，含有大量與幾丁質(zhì)、纖維素、木聚糖、肽聚糖等降解細胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的酶的編碼基因，推測菌株SF-18 通過各種碳水化合物酶系的共同作用降解病原真菌的細胞壁也是其抑菌的機制之一。

SF-18 能夠耐受18% 的NaCl，發(fā)酵液抑菌性能穩(wěn)定，對其基因組序列分析發(fā)現(xiàn)，該菌株具有產(chǎn)生亞精胺（ spermidine） /腐胺（ putrescine） 合成酶和轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的基因，以及海藻糖蛋白代謝相關(guān)的基因。作為小分子物質(zhì)，亞精胺和海藻糖均具有保護機體耐受高鹽、低溫、低濕環(huán)境的功能［40］，而從基因角度揭示了菌株SF-18 具有耐受極端環(huán)境的能力，拓寬了菌株的生存環(huán)境。

在菌株SF-18 的基因組中，也含有生成乙酰乳酸合酶與乙酰乳酸脫羧酶等與誘導(dǎo)抗性相關(guān)的基因［41］，從基因角度說明菌株SF-18 能夠誘導(dǎo)寄主產(chǎn)生抗性。在基因組中還存在有植酸酶基因。植酸及植酸鹽在植酸酶的作用下可被水解成肌醇與磷酸（或磷酸鹽），土壤中量施用產(chǎn)植酸酶的微生物，不但可以提高土壤中植酸形式磷的生物利用率，對植物具有明顯的促生和增產(chǎn)作用［42］，還可降低過量施用磷肥對環(huán)境造成的污染，具有改善土壤的潛力。

參考文獻 References

［1］ 楊立，陳美蘭，邵愛娟，等. 生防菌對藥用植物土傳病害的抗

病機制及應(yīng)用探討［J］. 中國中藥雜志，2012，37（21）：3188-

3192.YANG L，CHEN M L，SHAO A J，et al.Discussion on

applications and mechanisms of biocontrol microoganisms

used for controlling medicinal plant soil-borne diseases［J］.China

journal of Chinese materia medica，2012，37（21）：3188-

3192（ in Chinese with English abstract）.

［2］ 王蕊，王騰，李二峰. 生防芽孢桿菌在植物病害領(lǐng)域的研究進

展［J］. 天津農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2021，28（4）：71-77. WANG R，

WANG T，LI E F.Research advances of biocontrol Bacillus in

the field of plant diseases［J］. Journal of Tianjin Agricultural

University，2021，28（4）：71-77 （in Chinese with English abstract）.

［3］ FIRA D，DIMKI? I，BERI? T，et al. Biological control of

plant pathogens by Bacillus species［J］.Journal of biotechnology，

2018，285：44-55.

［4］ 高圣風(fēng)，劉愛勤，桑利偉，等. 胡椒瘟病生防菌Bacillus subtil?

is VD18R19 全基因組測序及比較基因組學(xué)分析［J］. 熱帶作

物學(xué)報，2018，39（10）：2021-2027. GAO S F，LIU A Q，

SANG L W，et al.Whole genome sequencing and comparative

genomics analysis of Bacillus subtilis VD18R19 with biocontrol

activity against pepper phytophtora rot disease［J］.Chinese

journal of tropical crops，2018，39（10）：2021-2027（ in Chinese

with English abstract）.

［5］ 王曉宇，羅楚平，陳志誼，等. 枯草芽胞桿菌Bs-916 的全基因

組分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，44（23）：4807-4814.WANG

X Y，LUO C P，CHEN Z Y，et al.The complete genome sequence

of the gram-positive bacterium Bacillus subtils bs-916

［J］. Scientia agricultura sinica，2011，44（23）：4807-4814 （in

Chinese with English abstract）.

［6］ 王繼華，徐世強，張木清. 解淀粉芽孢桿菌的研究進展［J］. 亞

熱帶農(nóng)業(yè)研究，2017，13（3）：191-195.WANG J H，XU S Q，

ZHANG M Q. Research progress on Bacillus amyloliquefa?

ciens［J］. Subtropical agriculture research，2017，13（3）：191-

195（ in Chinese with English abstract）.

［7］ 張瑩，秦宇軒，尚慶茂，等. 解淀粉芽孢桿菌L-H15 的促生與

抗病特性研究［J］. 農(nóng)業(yè)機械學(xué)報，2017，48（12）：284-291.

ZHANG Y，QIN Y X，SHANG Q M，et al.Characteristics of

growth-promotion and antibiosis by Bacillus amyloliquefa?

ciens L-H15［J］. Transactions of the CSAM，2017，48（12）：

284-291（in Chinese with English abstract）.

［8］ 李錚，王金輝，丁麗麗，等. 貝萊斯芽孢桿菌菌株NZ-4 生防潛

能及基因組學(xué)分析［J］. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2023，51（2）：117-125.

LI Z，WANG J H ，DING L L，et al.Biocontrol potential and

genomic analysis of Bacillus velezensis strain NZ-4［J］.Jiangsu

agricultural sciences，2023，51（2）：117-125 （in Chinese with

English abstract）.

［9］ 李苗苗，張家韜，崔傳斌，等. 三株芽孢桿菌的生防特性研究

［J］. 中國煙草科學(xué)，2020，41（4）：80-89.LI M M，ZHANG J

T，CUI C B，et al.Study on biocontrol characteristics of three

Bacillus strains［J］.Chinese tobacco science，2020，41（4）：80-

89（ in Chinese with English abstract）.

［10］ SULTANA R，KIM K.Bacillus thuringiensis C25 suppresses

popcorn disease caused by Ciboria shiraianain mulberry

（Morus australis L.）［J］. Biocontrol science and technology，

2016，26（2）：145-162.

［11］ 邢芳芳，宋濤，徐文鳳，等. 側(cè)孢芽孢桿菌在生防中的應(yīng)用及

研究進展［J］. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，46（6）：146-149.XING F

F，SONG T，XU W F，et al.Application of Bacillus laterospo?

rus in biological prevention and research advances［J］. Shandong

agricultural sciences，2014，46（6）：146-149 （in Chinese

with English abstract）.

［12］ 柳成東，趙平，王乙茹，等. 凝結(jié)芽孢桿菌抑菌性能的研究進

展［J］. 飼料工業(yè)，2021，42（10）：58-64.LIU C D，ZHAO P，

WANG Y R，et al.Research progress on antibacterial properties

of a probiotic Bacillus coagulans［J］.Feed industry，2021，

42（10）：58-64（ in Chinese with English abstract）.

［13］ 郭繼平，馬光，蘇長青. 一株生防地衣芽孢桿菌分泌蛋白質(zhì)的

鑒定及分析［J］. 北方園藝，2018（18）：29-35.GUO J P，MA

G，SU C Q. Identification and analysis of secreted proteins

from a biocontrol strain of Bacillus licheniformis［J］.Northern

horticulture，2018（18）：29-35 （in Chinese with English abstract）.

［14］ 龔國利，王忠忠. 短短芽孢桿菌的鑒定及其抑菌物質(zhì)的初步

研究［J］. 陜西科技大學(xué)學(xué)報，2017，35（4）：126-131.GONG

G L，WANG Z Z. Identification of Brevibacillus brevis strain

and preliminary study on its antibacterial substance［J］.Journal

of Shaanxi University of Science amp; Technology，2017，35（4）：

126-131（in Chinese with English abstract）.

［15］ 王靜，曹建敏，陳德鑫，等. 短小芽孢桿菌AR03 揮發(fā)性有機

物的抑菌活性及其組分分析［J］. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，51

（10）：1908-1919.WANG J，CAO J M，CHEN D X，et al.Antimicrobial

effect and components analysis of volatile organic

compounds from Bacillus pumilus AR03［J］. Scientia agricultura

sinica，2018，51（10）：1908-1919（ in Chinese with English

abstract）.

［16］ 周全勝.25 億CUF/g 堅強芽孢桿菌可濕性粉劑防治水稻紋

枯病效果研究［J］. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2018（9）：141.ZHOU Q S.

Study on the control effect of 2.5 billion CUF/g Bacillus fortis

wettable powder on rice sheath blight［J］.Modern agricultural

science and technology，2018（9）：141（ in Chinese）.

［17］ 王衛(wèi)雄，沈博，賈洪柏，等. 根際生防菌群的應(yīng)用及其防病增

效的潛在機制［J］. 生物技術(shù)通報，2020，36（9）：31-41.

WANG W X，SHEN B，JIA H B，et al.Application of rhizospheric

biocontrol consortia and the potential mechanisms of

their enhancing efficacy on disease-suppressive effect［J］.Biotechnology

bulletin，2020，36（9）：31-41（ in Chinese with English

abstract）.

［18］ 王華，聶蓓蓓，包立軍，等. 生防芽孢桿菌抑真菌機制及其在

桑樹真菌病害防治中的潛在應(yīng)用價值［J］. 蠶業(yè)科學(xué)，2021，

47（2）：186-193.WANG H，NIE B B，BAO L J，et al.Antifungal

mechanism of biocontrol Bacillus and its potential application

in the control of mulberry fungal diseases［J］.Acta sericologica

sinica，2021，47（2）：186-193 （in Chinese with English

abstract）.

［19］ 李虹梅，何明川，高熹，等. 生防菌貝萊斯芽孢桿菌MC2-1 全

基因組測序分析［J］. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報，2022，53（12）：3420-

3432. LI H M，HE M C，GAO X，et al. Whole genome sequencing

analysis of a biocontrol bacterium Bacillus velezensis

MC2-1［J］. Journal of southern agriculture，2022，53（12）：

3420-3432（ in Chinese with English abstract）.

［20］ 李蘇冉，李雪，馮佳霖，等. 生防菌解淀粉芽孢桿菌SQ-2 全基

因組測序及生物信息學(xué)分析［J］. 微生物學(xué)通報，2023，50

（3）：1073-1097.LI S R，LI X，F(xiàn)ENG J L，et al.Whole genome

sequencing and genomics analysis of Bacillus amyloliquefa?

ciens SQ-2 with biocontrol activity［J］. Microbiology China，

2023，50（3）：1073-1097（ in Chinese with English abstract）.

［21］ 戴利銘，李嵐嵐，劉一賢，等. 解淀粉芽孢桿菌生防菌BS-3 全

基因組測序及生物信息分析［J］. 微生物學(xué)通報，2021，48

（6）：2073-2088.DAI L M，LI L L，LIU Y X，et al.Whole genome

sequencing and genomics analysis of Bacillus amyloliq?

uefaciens BS-3 with biocontrol activity［J］. Microbiology China，

2021，48（6）：2073-2088 （in Chinese with English abstract）.

［22］ 李江，李光友. 極端微生物：生物活性物質(zhì)的新源泉［J］. 自然

雜志，2011，33（5）：275-280.LI J，LI G Y.Extremophilic microorganisms：

new resources of bioactive substances［J］. Chinese

journal of nature，2011，33（5）：275-280 （in Chinese with

English abstract）.

［23］ 俞冰倩，朱琳，魏巍. 我國鹽堿土土壤微生物研究及其展望

［J］. 土壤與作物，2019，8（1）：60-69.YU B Q，ZHU L，WEI

W. Microorganisms research in saline soil of China：progress

and prospects［J］.Soils and crops，2019，8（1）：60-69 （in Chinese

with English abstract）.

［24］ WANG L T，LEE F L，TAI C J，et al. Comparison of gyrB

gene sequences，16S rRNA gene sequences and DNA-DNA

hybridization in the Bacillus subtilis group［J］. International

journal of systematic and evolutionary microbiology，2007，57：

1846 -1850.

［25］ 孫平平，崔建潮，賈曉輝，等. 貝萊斯芽孢桿菌L-1 對梨灰霉

和青霉病菌的抑制作用評價及全基因組分析［J］. 微生物學(xué)

報，2018，58（9）：1637-1646.SUN P P，CUI J C，JIA X H，et

al.Complete genome analysis of Bacillus velezensis L-1 and its

inhibitory effect on pear gray and blue mold［J］.Acta microbiologica

sinica，2018，58（9）：1637-1646 （in Chinese with English

abstract）.

［26］ 王傳旭，于慧瑛，趙愛華，等.1 株鹽湖芽孢桿菌AF-1 的鑒定

及其抗尖孢鐮刀菌活性研究［J］. 云南大學(xué)學(xué)報（自然科學(xué)

版），2019，41（1）：164-171.WANG C X，YU H Y，ZHAO A

H，et al.Identification of Bacillus sp.AF-1 from a salt lake in

Yuncheng and the antimicrobial activity against Fusarium oxy?

sporum［J］.Journal of Yunnan University （natural sciences edition），

2019，41（1）：164-171 （in Chinese with English abstract）.

［27］ 高曉丹，馬鳴超，曹鳳明，等. 基于生物化學(xué)和基因組學(xué)方法

的Bacillus velezensis 19573-3 生防潛力評價［J］. 植物營養(yǎng)與

肥料學(xué)報，2021，27（6）：1068-1079. GAO X D，MA M C，

CAO F M，et al. Biocontrol potential of Bacillus velezensis

19573-3 identified using biochemistry and genomics methods

［J］. Journal of plant nutrition and fertilizers，2021，27（6）：

1068-1079（ in Chinese with English abstract）.

［28］ MüLLER S，STRACK S N，HOEFLER B C，et al. Bacillaene

and sporulation protect Bacillus subtilis from predation

by Myxococcus xanthus［J］.Applied and environmental microbiology，

2014，80（18）：5603-5610.

［29］ 劉郵洲，沈佳慧，喬俊卿，等. 芽孢桿菌嗜鐵素研究進展［J］.

江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2023，39（1）：266-276.LIU Y Z，SHEN J H，

QIAO J Q，et al.Research progress of siderophore produced by

Bacillus spp.［J］.Jiangsu journal of agricultural sciences，2023，

39（1）：266-276（ in Chinese with English abstract）.

［30］ BR?TZ H，BIERBAUM G，REYNOLDS P E，et al.The lantibiotic

mersacidin inhibits peptidoglycan biosynthesis at the

level of transglycosylation［J］.European journal of biochemistry，

1997，246（1）：193-199.

［31］ JIN P F，WANG H N，LIU W B，et al.A new cyclic lipopeptide

isolated from Bacillus amyloliquefaciens HAB-2 and safety

evaluation［J］.Pesticide biochemistry and physiology，2018，

147：40-45.

［32］ YU C J，LIU X，ZHANG X Y，et al.Mycosubtilin produced by

Bacillus subtilis ATCC6633 inhibits growth and mycotoxin

biosynthesis of Fusarium graminearum and Fusarium verticil?

lioides［J/OL］. Toxins，2021，13（11）：791［2023-10-25］.

https：//doi.org/10.3390/toxins13110791.

［33］ STOREY E P，BOGHOZIAN R，LITTLE J L，et al.Characterization

of‘ Schizokine’：a dihydroxamate-type siderophore

produced by Rhizobium leguminosarum IARI 917［J］.Biometals，

2006，19（6）：637-649.

［34］ GORE-LLOYD D，SUMANN I，BRACHMANN A O，et al.

Snf2 controls pulcherriminic acid biosynthesis and antifungal

activity of the biocontrol yeast Metschnikowia pulcherrima［J］.

Molecular microbiology，2019，112（1）：317-332.

［35］ HEIFETZ C L，CHODUBSKI J A，PEARSON I A，et al.Butirosin

compared with gentamicin in vitro and in vivo［J］.Antimicrobial

agents and chemotherapy，1974，6（2）：124-135.

［36］ HE H Y，SILO-SUH L A，HANDELSMAN J，et al.Zwittermicin

A，an antifungal and plant protection agent from Bacillus

cereus［J］.Tetrahedron letters，1994，35（16）：2499-2502.

［37］ LATGé J P.Tasting the fungal cell wall［J］.Cellular microbiology，

2010，12（7）：863-872.

［38］ 朱信霖，扈東營，陳顯振，等. 作用于細胞壁的抗真菌藥物研

究進展［J］. 菌物學(xué)報，2022，41（6）：871-877.ZHU X L，HU

D Y，CHEN X Z，et al. A review of the study on antifungal

drugs acting on cell wall［J］.Mycosystema，2022，41（6）：871-

877（ in Chinese with English abstract）.

［39］ 張博陽，朱天輝，韓珊，等. 桑氏鏈霉菌幾丁質(zhì)酶ChiKJ40 基

因的克隆表達及其抑菌作用［J］. 微生物學(xué)通報，2018，45

（5）：1016-1026.ZHANG B Y，ZHU T H，HAN S，et al.Cloning，

expression and antibacterial functions of ChiKJ40，a chitinase

gene from Streptomyces sampsonii［J］. Microbiology China，

2018，45（5）：1016-1026 （in Chinese with English abstract）.

［40］ ALCáZAR R，BITRIáN M，BARTELS D，et al.Polyamine

metabolic canalization in response to drought stress in Arabi?

dopsis and the resurrection plant Craterostigma plantagineum

［J］.Plant signaling amp; behavior，2011，6（2）：243-250.

［41］ 劉長樂，郭月，李芳芳，等. 抗ALS 類除草劑作物種質(zhì)創(chuàng)制與

利用研究進展［J］. 植物遺傳資源學(xué)報，2022，23（2）：333-345.

LIU C L，GUO Y，LI F F，et al.Advances in development and

utilization of crop germplasm resources resistant to ALS herbicides

［J］.Journal of plant genetic resources，2022，23（2）：333-

345（ in Chinese with English abstract）.

［42］ IDRISS E E，MAKAREWICZ O，F(xiàn)AROUK A，et al.Extracellular

phytase activity of Bacillus amyloliquefaciens FZB45

contributes to its plant-growth-promoting effect［J］.Microbiology，

2002，148（pt 7）：2097-2109.

（責(zé)任編輯：張志鈺）