桃雜交種胚培養(yǎng)技術(shù)探析

摘 要：為提高桃雜交種胚的成活率，克服遠(yuǎn)緣不親和性，利用組織培養(yǎng)技術(shù)研究不同激素配比對(duì)雜交胚成活率的影響。結(jié)果表明，最適芽萌發(fā)培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.2 mg/L），萌發(fā)率達(dá)86%；叢生芽誘導(dǎo)最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.3 mg/L）+NAA（0.1 mg/L），增殖系數(shù)為5.28；最適生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA（0.5 mg/L）+NAA（0.1 mg/L），生根率為91%。

關(guān)鍵詞：桃雜交胚；組織培養(yǎng)

中圖分類號(hào)：S662.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI編碼：10.19440/j.cnki.1006-9402.2024.02.006

為了滿足不同的市場(chǎng)需求，培育出個(gè)大、口感好、甜度高、耐儲(chǔ)運(yùn)的優(yōu)良品種一直是桃育種的目標(biāo)。但是桃雜交胚的成活率較低，種皮影響了雜交胚的發(fā)育，目前雜交桃種子的成苗率還比較低。因此為了解決育種中出現(xiàn)的問(wèn)題，就要將雜交育種與組織培養(yǎng)技術(shù)相結(jié)合，解決胚發(fā)育不成熟、成活率低的問(wèn)題，同時(shí)還能縮短育種年限。從胚培養(yǎng)到移栽成苗，如果某一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問(wèn)題，成苗率仍然比較低。因此，不斷改進(jìn)和完善桃雜種處理和胚培養(yǎng)技術(shù)，提高雜種苗成苗率，仍然是提高桃育種效率的重要內(nèi)容。

1 材料與方法

1.1 無(wú)菌外植體 供試材料選擇早熟品種中油4號(hào)為母本的雜交種，在成熟前2 周采集果實(shí)，進(jìn)行胚挽救。雜交果實(shí)采收后，采用如下處理：削去果肉，砸破果核，用流水沖洗30 min，用75%的酒精浸泡2 min，無(wú)菌水沖洗3～5次，然后再用5%NaClO浸泡外植體10 min，無(wú)菌水沖洗3次。在無(wú)菌濾紙上拭干水分，剝?nèi)シN皮，進(jìn)行接種，見(jiàn)表2～3，然后一部分接種胚直接在無(wú)菌室培養(yǎng)，一部分接種胚放在 0～5 ℃的冰柜里冷藏60 d，取出后在培養(yǎng)室不照光培養(yǎng)3～5 d，然后轉(zhuǎn)移到有光的培養(yǎng)室培養(yǎng)，光照時(shí)間為10-12h/d，光照強(qiáng)度為2 000 lx，培養(yǎng)室溫度25€？ ℃。

1.2 芽萌發(fā)誘導(dǎo) 每個(gè)處理接種20個(gè)外植體于芽萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)培養(yǎng)基均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基（見(jiàn)表1），培養(yǎng)25 d后，統(tǒng)計(jì)其萌芽率。

萌芽率＝（萌芽數(shù)/接種的外植體數(shù)）€？00%

成活率＝（成活數(shù)/萌芽數(shù)）€？00%

1.3 叢生芽誘導(dǎo) 經(jīng)過(guò)芽萌發(fā)培養(yǎng)后，切取脫毒嫩芽，接種到叢生芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基均以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基（見(jiàn)表2）。每處理接種20個(gè)外植體；25 d后統(tǒng)計(jì)其平均株高、平均葉片數(shù)及增殖系數(shù)。

平均株高＝苗的總高度/苗的總數(shù)

平均葉片數(shù)＝葉片總數(shù)/苗的總數(shù)

增殖系數(shù)＝增殖后的幼芽數(shù)/接種的外植體數(shù)

1.3 生根誘導(dǎo) 將叢生芽分切后的單芽，接種到生根培養(yǎng)基，誘導(dǎo)培養(yǎng)基均以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基（見(jiàn)表3）。每個(gè)處理接種10個(gè)外植體；25 d后統(tǒng)計(jì)其平均根數(shù)、平均根長(zhǎng)、平均株高及生根率。

平均根數(shù)＝生根總數(shù)/接種外植體數(shù)

平均根長(zhǎng)＝根的總長(zhǎng)度/根的總數(shù)

生根率＝（生根的外植體數(shù)／接種的外植體數(shù)）€？00%

2 結(jié)果與分析

2.1 外源激素對(duì)雜交種胚誘導(dǎo)芽萌發(fā)的影響 本試驗(yàn)的9種芽萌發(fā)誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)雜交胚芽萌發(fā)的影響差異較大。表4可見(jiàn)，經(jīng)9種處理組合培養(yǎng)基誘導(dǎo)后，都能夠促使雜交胚初代外植體萌芽，但以M5處理的萌芽率最高，達(dá)到86%，隨著6-BA濃度的增加，萌發(fā)率逐漸呈降低趨勢(shì)，當(dāng)6-BA在適當(dāng)?shù)臐舛葧r(shí)，NAA對(duì)芽萌發(fā)的誘導(dǎo)影響較小。

2.2 外源激素對(duì)雜交胚誘導(dǎo)叢生芽的影響 在MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑6-BA、NAA對(duì)雜交胚帶芽莖段進(jìn)行增殖培養(yǎng)，培養(yǎng)25 d后的統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表5。

從表5可見(jiàn)，雜交胚外植體在4號(hào)培養(yǎng)基上增殖能力最強(qiáng)，繁殖系數(shù)達(dá)5.28，且試管苗生長(zhǎng)旺盛，葉片翠綠，玻璃化現(xiàn)象較少；在Z2、Z5培養(yǎng)基上增殖能力次之，增殖系數(shù)分別達(dá)4.87、4.25，生長(zhǎng)情況較好；Z1和Z8培養(yǎng)基上增殖能力較差，且隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，易出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，葉片呈水浸透明狀。綜上，叢生芽誘導(dǎo)最佳增殖培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.3 mg/L）+NAA（0.1 mg/L），增殖系數(shù)為5.28。

2.3 外源激素對(duì)雜交胚誘導(dǎo)生根的影響 選取苗高在3 cm以上的健壯嫩苗，分別在加入NAA 0.05～0.10 mg/L、IBA 0.00～1.00 mg/L的生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)。暗培養(yǎng)5 d后，再置于正常的光照條件下進(jìn)行培養(yǎng)。S1、S2、S8、S9培養(yǎng)基苗的基部有愈傷組織出現(xiàn)，根系較粗而脆；S3、S4、S6、S7培養(yǎng)基生根率較高，但根數(shù)少，有時(shí)僅生長(zhǎng)出一條細(xì)長(zhǎng)的白色根，且易產(chǎn)生須根，根系較細(xì)而柔軟；S5培養(yǎng)基生根較好，一般8 d左右就能看見(jiàn)較粗的小根長(zhǎng)出，單株根數(shù)也較多，因此，最適合雜交胚生根的培養(yǎng)基為1/2MS+NAA 0.10 mg/L+IBA 0.50 mg/L，生根率達(dá)91%（表6）。

2.4 雜交胚培苗的煉苗 將經(jīng)過(guò)繼代培養(yǎng)后生長(zhǎng)健壯的生根胚培苗在溫室中進(jìn)行煉苗，溫室中的溫度和濕度要嚴(yán)格控制，溫度控制在25～28 ℃，早晚噴一遍水，保持室內(nèi)環(huán)境的濕度。煉苗15 d后，揭去瓶口的一層塑料膜。如果光照太強(qiáng)，要注意用遮陽(yáng)網(wǎng)遮蔭。煉苗結(jié)束后，每瓶加入800倍多菌靈10～15 mL進(jìn)行殺菌，移栽時(shí)要洗凈根部的培養(yǎng)基。要特別注意從莖桿、葉片等方面觀察煉苗程度，當(dāng)葉色變得深綠、苗木生長(zhǎng)健壯時(shí)，莖桿變紅即可進(jìn)行移栽。

目前雜交胚的胚挽救技術(shù)已經(jīng)較為成熟，但是煉苗、移栽的技術(shù)要求仍比較嚴(yán)格，對(duì)胚培苗的影響較大，雜交胚培苗的移栽環(huán)境主要選用草炭和珍珠巖混合作為基質(zhì)，比例為3∶1，配制時(shí)用50%多菌靈或甲基托布津500～800倍液噴灑基質(zhì)消毒，然后將基質(zhì)攪拌均勻后用塑料膜蓋住待用。

移栽后為保證成活率要搭建小拱棚，小環(huán)境內(nèi)空氣濕度維持90%以上，這樣有利于緩苗，葉片也不會(huì)萎蔫。栽后澆水量不宜過(guò)多，否則會(huì)出現(xiàn)爛根現(xiàn)象。移栽季節(jié)不同，對(duì)揭膜通風(fēng)的要求也不同。一般早晚和夜間氣溫低，棚內(nèi)濕度較高，可掀開(kāi)棚膜進(jìn)行通風(fēng)。移栽后第15 d左右，視苗木長(zhǎng)勢(shì)和天氣情況，選擇陰天，逐漸開(kāi)始整天通風(fēng)，直到一個(gè)月后，（下轉(zhuǎn)第14頁(yè)）（上接第11頁(yè)）選擇陰天，全部揭去棚膜。通過(guò)這種方法進(jìn)行胚挽救苗的移栽，成活率可達(dá)到60%～80%。

3 結(jié)論與討論

研究結(jié)果表明：桃雜交種胚芽萌發(fā)的最適培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.5 mg/L）+NAA（0.2 mg/L），萌發(fā)率達(dá)86%；叢生芽誘導(dǎo)最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA（0.3 mg/L）+NAA（0.1 mg/L），增殖系數(shù)為5.28；最適生根培養(yǎng)基1/2MS+IBA（0.5 mg/L）+NAA（0.1 mg/L），生根率為91%。

為研究冷藏在胚挽救過(guò)程中的作用，本文做了相應(yīng)的對(duì)比試驗(yàn)。將一部分培養(yǎng)基冷藏后再放入培養(yǎng)室，另一部分是接種后直接放入培養(yǎng)室進(jìn)行培養(yǎng)。結(jié)果表明，經(jīng)過(guò)冷藏的胚出芽率要高于未進(jìn)行冷藏的胚，因此在進(jìn)行大批量胚挽救的工作時(shí)，可以采取冷藏的方式提高出芽率，促進(jìn)胚的發(fā)育。今后研究重點(diǎn)將放在對(duì)胚冷藏時(shí)間的探索，以提高胚挽救效率。

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