美洲大蠊腸道菌株WA5-1-7的初步鑒定及其抗菌活性成分的研究

摘要：目的 對(duì)具有抗白念珠菌活性的美洲大蠊腸道來(lái)源菌株WA5-1-7進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，并對(duì)其次級(jí)代謝物進(jìn)行分離純化，從中篩選具有抗菌活性的單體化合物。方法 采用染色法和掃描電子顯微鏡觀察菌株形態(tài)；利用PCR技術(shù)擴(kuò)增菌株16S rRNA，通過其基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行BLAST比對(duì)并采用N-J法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。菌株發(fā)酵后經(jīng)乙酸乙酯溶劑萃取獲得粗提物，粗提物經(jīng)硅膠柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、HPLC分離純化，獲得單體化合物，經(jīng)核磁共振、質(zhì)譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)比對(duì)鑒定化合物結(jié)構(gòu)，并檢測(cè)化合物的抗菌活性。結(jié)果 菌株WA5-1-7初步鑒定為環(huán)圈鏈霉菌（Streptomyces anulatus），從粗提物中分離出10個(gè)化合物，分別為SF2738F（1）、SF2738D（2）、環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）二肽（3）、SF2738A（collismycin A， 4）、環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）二肽（5）、SF2738C（6）、1H-吲哚甲醛（7）、大豆黃酮（8）、放線菌素 X2（9）、放線菌素 D（10），其中化合物4、9和10有較強(qiáng)抗菌活性。結(jié)論 本研究從美洲大蠊腸道來(lái)源鏈霉菌次級(jí)代謝產(chǎn)物中分離出具有抗菌活性的單體化合物，為深入探索美洲大蠊腸道菌奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：美洲大蠊；鏈霉菌；次級(jí)代謝產(chǎn)物；抗菌活性

中圖分類號(hào)：R978.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Preliminary identification of strain WA5-1-7 from intestinal tract of Periplaneta americana and study on its secondary metabolites with antimicrobial activity

Wang Jie， Yu Tiantian， Chen Xueqin， Zhao Jiayi， Liu Wenbin， Ma Yan， and Jin Xiaobao

（Guangdong Provincial Key Laboratory of Pharmaceutical Bioactive Substances， School of Basic Medical Sciences， Guangdong Pharmaceutical University， Guangzhou 510006）

Abstract Objectives A strain WA5-1-7 from the intestinal tract of Periplaneta americana with anti-Candida albicans activity was identified by morphology and molecular biology， and its secondary metabolites were isolated and purified. The monomers with antibacterial activity were screened. Methods The morphology of the strain was observed by gram staining and scanning electron microscopy. The 16S rRNA sequence of the strain was amplified by PCR and compared with the NCBI database by BLAST. Its phylogenetic tree was constructed by the N-J method. After fermentation， the crude extract was extracted by ethyl acetate solvent and separated by silica gel column chromatography， which was purified to obtain monomer compounds by Dextran gel column chromatography and HPLC. The structures of the compounds were identified by nuclear magnetic resonance and mass spectrometry， and their antimicrobial activity was detected. Results Strain WA5-1-7 was preliminarily identified as Streptomyces anulatus， and 10 monomer compounds were isolated from its crude extract. They were SF2738F （1）， SF2738D （2）， cyclo-（D-Pro-D-Leu） （3）， SF2738A （collismycin A， 4）， Cyclo-（L-Phe-D-Pro） （5）， SF2738C （6）， indole-3-carboxaldehyde （7）， daidzein （8）， actinomycin X2 （9） and actinomycin D （10）. The compounds 4， 9 and 10 showed strong antimicrobial activity. Conclusions The monomer compounds with antimicrobial activities were isolated from the intestinal Streptomyces secondary metabolites of Periplaneta americana， which laid the foundation for further exploration of the intestinal bacteria of Periplaneta americana.

Key words Periplaneta americana; Streptomycete; Secondary metabolites; Antimicrobial activity

微生物能夠產(chǎn)生多種具有生物活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物，為新藥研發(fā)提供了巨大的資源庫(kù)，但是由于研究手段的局限等原因，科學(xué)家們從傳統(tǒng)微生物來(lái)源如土壤或植物中發(fā)現(xiàn)新的代謝產(chǎn)物的速度正在減慢。因此，在特殊環(huán)境的微生物中尋求具有結(jié)構(gòu)特殊的化合物已成為研究熱點(diǎn)[1-2]。有文獻(xiàn)報(bào)道，在昆蟲體內(nèi)如腸道或者昆蟲體表生活的特境微生物可能是生物活性小分子的“巨型蓄水池”，產(chǎn)生的小分子化合物結(jié)構(gòu)骨架也非常有趣[3]，然而，只對(duì)少數(shù)昆蟲系統(tǒng)的微生物化合物進(jìn)行了研究[4-6]。

美洲大蠊（Periplaneta americana）俗稱“蟑螂”（cockroaches），隸屬于昆蟲綱（Insecta）網(wǎng)翅目（Dictyoptera）蜚蠊亞目（Blattaria）蜚蠊科（Blattidae），是地球上分布最廣泛、存在時(shí)間最長(zhǎng)的古老昆蟲之一。美洲大蠊生長(zhǎng)于陰暗潮濕的地方，生存環(huán)境差，食譜廣，對(duì)食物沒有嚴(yán)格篩選，然而其生命力和繁殖力卻極強(qiáng)。美洲大蠊具有較強(qiáng)的環(huán)境適應(yīng)能力以及能夠抵御外來(lái)病原菌侵染的能力，這與其腸道內(nèi)的微生物菌群存在密切的關(guān)系[7-8]。方霞、蔣詩(shī)林等[9-10]從美洲大蠊腸道分離159株放線菌，有30.82%菌株的次級(jí)代謝產(chǎn)物具有抗菌作用；Akbar等[11]從美洲大蠊腸道菌中分離出具有抗菌活性和抗阿米巴效應(yīng)的物質(zhì)；Chen等[12-13]從美洲大蠊腸道菌中鑒定出能分泌抗菌抗腫瘤物質(zhì)的球孢桿菌以及戈登菌；上述表明美洲大蠊腸道來(lái)源菌在發(fā)現(xiàn)新的抗菌物質(zhì)方面具有極大的潛力。

本研究從課題組前期分離的159株美洲大蠊腸道來(lái)源放線菌中，選取1株具有良好抗白念珠菌活性的菌株WA5-1-7，通過形態(tài)學(xué)觀察，分子生物學(xué)鑒定和系統(tǒng)發(fā)育樹分析對(duì)該菌株進(jìn)行初步鑒定。菌株發(fā)酵后經(jīng)乙酸乙酯溶劑萃取獲得粗提物，然后將具有抗白念珠菌活性的粗提物經(jīng)硅膠柱層析、葡聚糖凝膠柱層析、HPLC分離純化，所得單體化合物進(jìn)行核磁共振、質(zhì)譜表征，對(duì)目標(biāo)菌株的次級(jí)代謝物進(jìn)行初步研究。闡述目標(biāo)菌株次級(jí)代謝物抗白念珠菌活性的物質(zhì)基礎(chǔ)，以期尋找出結(jié)構(gòu)新穎的活性天然產(chǎn)物或先導(dǎo)化合物，為進(jìn)一步對(duì)昆蟲來(lái)源微生物及其放線菌次級(jí)代謝物的研究與開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

課題組前期從美洲大蠊腸道內(nèi)分離出具有良好抗白念珠菌活性的菌株WA5-1-7，保存于廣東省微生物菌種保藏中心（GDMCC NO.6163 0）；白念珠菌C. albicans（ATCC10231）、煙曲霉A. fumigatu（ATCC96918）、黑曲霉A. niger （ATCC16404）、紅色毛癬菌T. rubrum（ATCC28188）、金黃色葡萄球菌S. aureus（ATCC25923）、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA（ATCC43300）、大腸埃希菌E.coli（ATCC25922）、肺炎克雷伯菌K. Pneumoniae（ATCC13883）均購(gòu)自廣東省微生物研究所菌種保藏中心。

1.1.2 主要試劑與設(shè)備

革蘭染色試劑盒（廣東環(huán)凱微生物）；Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒（上海生工）；Taq PCR Mastermix、DNA Marker（日本TaKaRaBio）；分析型色譜柱（YMC-PackODS-AQ250×4.6 mm. D.S-5 μm， 12 nm）、制備型色譜柱（YMC-PackODS-AQ 250×10.0 mm. D.S-5 μm，12 nm）（日本YMC公司）。T100TM型PCR儀（美國(guó)Bio-Rad公司）、HitachiS-3400N型掃描電子顯微鏡（日本日立高新技術(shù)有限公司）、核磁共振譜儀AVANCEIII600M（德國(guó)Bruker公司）、三重四級(jí)桿質(zhì)譜儀TSQEndura（美國(guó)ThermoFisher公司）、高效液相色譜儀（535-2489，2695-2996，美國(guó)Waters公司）。

1.1.3 培養(yǎng)基的配制

高氏1號(hào)培養(yǎng)基（Gao's No.1 Medium，GS1號(hào)）將可溶性淀粉20.0 g、氯化鈉0.5 g、磷酸氫二鉀0.05 g、硫酸亞鐵0.01 g、硫酸鎂0.05 g、硝酸鉀1.0 g、瓊脂15.0 g溶于蒸餾水中，并定容至1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4之間，分裝，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。 "International Streptomyces Project 1：Tryptone-yeast extract broth （ISP1） 將葡萄糖10.0 g、酵母提取物2.0 g、

胰蛋白胨12.0 g溶解于蒸餾水中，并定容1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4之間，分裝，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。International Streptomyces Project 2：Yeast extract-malt broth （ISP2） 將葡萄糖4.0 g、酵母提取物4.0 g、麥芽糖提取物10.0 g溶解于蒸餾水中，并定容1000 mL，調(diào)節(jié)pH值至7.2～7.4之間，分裝，于121 ℃高壓蒸汽滅菌20 min。沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基（SDB）和水解酪蛋白胨（MH）肉湯均購(gòu)自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株WA5-1-7形態(tài)學(xué)鑒定

將保存的菌株采用劃線法接種于GS1號(hào)平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)4～7 d，觀察菌落形態(tài)特征；挑取平板中的單菌落，經(jīng)過革蘭染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察菌株的菌體顏色與特征；同時(shí)取平板上單菌落的少量菌體，經(jīng)2.5%戊二醛溶液固定后磷酸鹽緩沖液（PBS， pH7.2 ）漂洗3次， 采用不同濃度（30%、50%、70%、90%和100%）的乙醇脫水，干燥、噴金后使用掃描電子顯微鏡觀察其形態(tài)。

1.2.2 菌株WA5-1-7分子生物學(xué)鑒定

使用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取菌株基因組DNA，并以此為模板、27F/1492R細(xì)菌通用引物為引物PCR擴(kuò)增菌株16S rRNA，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析后送華大基因測(cè)序。測(cè)序序列輸入NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)，使用MEGA7.0軟件中的鄰接（neighbor-joining，N-J）法建立菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，初步確定菌株的種屬。

1.2.3 菌株WA5-1-7發(fā)酵粗提物的制備

從GS 1號(hào)平板中挑取菌株單菌落接種于ISP1種子培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min培養(yǎng)36 h，并按5%體積比接種到ISP2發(fā)酵培養(yǎng)基中，28 ℃、160 r/min發(fā)酵10 d。發(fā)酵液 4000 r/min離心10 min，取上清用等體積的乙酸乙酯萃取3次，置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中40 ℃濃縮至干，稱重后保存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.4 菌株WA5-1-7發(fā)酵粗提物的分離純化

將粗提物與200～300目硅膠按質(zhì)量比1：1.5進(jìn)行研磨混勻，以二氯甲烷-甲醇（100：0～0：100）作為流動(dòng)相，進(jìn)行硅膠柱層析，獲得的各個(gè)餾分進(jìn)行TLC薄層色譜和HPLC分析，將具有相同Rf值和相同HPLC指紋圖譜的餾分進(jìn)行合并，通過牛津杯法測(cè)定各個(gè)餾分抗白念珠菌活性[14]。再將有活性的餾分經(jīng)葡聚糖凝膠Sephadex LH-20柱（美國(guó)GE）進(jìn)一步分離純化，最后半制備-高效液相色譜制備出單體化合物。

1.2.5 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

核磁共振檢測(cè)：將冷凍干燥后的單體化合物置于氘代試劑中充分溶解，在600 MHz下進(jìn)行1H-NMR和13C-NMR核磁共振檢測(cè)。質(zhì)譜分析：稱取少量樣品溶解于甲醇（質(zhì)譜級(jí)別）中，配成濃度為10 mg/L的溶液，在質(zhì)荷比為100～1500的范圍內(nèi)對(duì)化合物進(jìn)行質(zhì)譜分析。結(jié)構(gòu)解析：利用MestReNova 6.1軟件對(duì)樣品的核磁共振圖譜進(jìn)行處理，并結(jié)合質(zhì)譜等譜圖信息，通過比對(duì)微譜、Sci Finder等數(shù)據(jù)庫(kù)及參考文獻(xiàn)，對(duì)樣品的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步的解析和確認(rèn)。

1.2.6 單體化合物最小抑菌濃度測(cè)定

單體化合物與陽(yáng)性對(duì)照品[兩性霉素B（白念珠菌）、氟康唑（煙曲霉、黑曲霉和紅色毛癬菌）、氨芐青霉素鈉（金黃色葡萄球菌）、萬(wàn)古霉素（耐甲氧西林金黃色葡萄球菌）和環(huán)丙沙星（大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌）]分別配制成512、256、128、64、32、16、8、4、2、1和0.5 μg/mL樣品液，每個(gè)濃度平行6次，SDB/MH培養(yǎng)基為空白對(duì)照。96孔板中分別加入供試菌液100 μL培養(yǎng)1 h；再加入待測(cè)樣品液/陽(yáng)性對(duì)照/空白對(duì)照100 μL，37 ℃培養(yǎng)16～24 h（供試菌為金色葡萄球菌、MRSA、大腸埃希菌及肺炎克雷伯菌），或28 ℃培養(yǎng)24 h（供試菌為白念珠菌），或28 ℃培養(yǎng)48 h（供試菌為黑曲霉、煙曲霉及紅色毛癬菌）。隨后每孔加入0.5%無(wú)菌的TTC溶液10 μL，恒溫培養(yǎng)2～3 h，觀察顯色現(xiàn)象并統(tǒng)計(jì)MIC值。

1.2.7 掃描電子顯微鏡觀察單體化合物抗白念珠菌的作用

首先將白念珠菌菌懸液（1.5×108 CFU/mL，經(jīng)麥?zhǔn)蠞岫刃Ｕ秊?.5）加入96孔板中，每孔100 μL，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h。再將待測(cè)的化合物配成4倍MIC值的濃度，加入到含有菌液的孔板中，每孔100 μL，再培養(yǎng)24 h。1000 r/min 離心后收集每孔菌體于 1.5 mL 離心管中，加入 2.5%戊二醛磷酸緩沖液（pH 7.2），置于冰箱中4 ℃避光固定過夜。800 r/min離心后棄去固定液，向樣品中加入1×PBS緩沖液（pH 6.8）浸泡洗滌 3次，每次15 min。分別用30%、50%、70%、90%和100%梯度乙醇對(duì)樣品進(jìn)行脫水處理，把樣品懸液均勻滴加在圓形玻片上，室溫下自然干燥。真空鍍膜機(jī)內(nèi)對(duì)樣品進(jìn)行噴金鍵膜，掃描電子顯微鏡觀察單體化合物抗白念珠菌作用。

2 結(jié)果

2.1 菌株WA5-1-7的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株WA5-1-7接種至GS 1號(hào)平板上，28 ℃恒溫培養(yǎng)5 d后觀察菌落形態(tài)特征，如圖1所示。該菌株生長(zhǎng)良好，菌落為圓形，干燥不透明，氣生菌絲向四周伸展，呈現(xiàn)出內(nèi)外兩個(gè)圓環(huán)，菌株分泌水溶性色素，使得整個(gè)培養(yǎng)基呈淡黃色；經(jīng)革蘭染色呈紫色，確定菌株WA5-1-7為革蘭陽(yáng)性菌，并能看到細(xì)長(zhǎng)、不規(guī)則彎曲的菌絲。掃描電子顯微鏡結(jié)果顯示，菌株的菌絲體呈現(xiàn)出不同分支的線狀，表面不光滑。菌株WA5-1-7符合鏈霉菌的基本特征。

2.2 菌株WA5-1-7分子生物學(xué)鑒定

通過PCR擴(kuò)增得到的產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，在1000～2000 bp處出現(xiàn)明亮的條帶，如圖2（A）所示，大小與預(yù)期一致。PCR擴(kuò)增序列和GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST同源性比對(duì)，并進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹分析，如圖2（B）。結(jié)果表明該菌株與環(huán)圈鏈霉菌（Streptomyces anulatus NR043489）處于同一分支，同源性達(dá)到100%。初步鑒定菌株WA5-1-7為環(huán)圈鏈霉菌（Streptomyces anulatus）。將菌株16S rRNA序列提交至NCBI的GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，獲得菌株WA5-1-7序列登錄編號(hào)：MN759381。該菌株保藏于廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號(hào)為GDMCC NO.61630。

2.3 菌株WA5-1-7抗白念珠菌活性次級(jí)代謝物的分離純化

收集73 L菌株發(fā)酵液上清，經(jīng)乙酸乙酯溶劑萃取后獲得27.1 g乙酸乙酯粗提物。該粗提物裝于硅膠柱上，經(jīng)二氯甲烷-甲醇（100：0～0：100）極性遞增洗脫，最終得到13個(gè)不同組分（Fr.1～Fr.13）。牛津杯法測(cè)定7個(gè)組分具有抗白念球菌活性，其中組分2抑菌效果最好，抑菌圈直徑為（22.50±0.70） mm。對(duì)有活性的組分進(jìn)一步分離純化，得到10個(gè)單體化合物，其中化合物9和10產(chǎn)量較高（如表1和圖3）。

2.4 單體化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

通過質(zhì)譜和核磁共振分析，并與先前報(bào)道的質(zhì)譜和核磁共振數(shù)據(jù)進(jìn)行比較，解析鑒定出了 10 個(gè)化合物，結(jié)果見表2。該10個(gè)單體化物分別是4個(gè)生物堿類化合物： 4-甲氧基-5，6-異噻唑-1，6-二氫-2′-聯(lián)吡啶（SF2738F， 1）、4-甲氧基-5-甲硫基-6-氰基-1，6-二氫-2′-聯(lián)吡啶（SF2738D， 2）、4-甲氧基-5-甲硫基-6-甲醛肟基-1，6-二氫-2′-聯(lián)吡啶（SF2738A， 4）、4-甲氧基-5-甲硫基-6-羥甲基-1，6-二氫-2′-聯(lián)吡啶（SF2738C， 6）；2個(gè)環(huán)肽類化合物：環(huán)（脯氨酸-亮氨酸）二肽（cyclo-（D-Pro-D-Leu），3）、環(huán)（苯丙氨酸-脯氨酸）二肽（cyclo-（L-Phe-D-Pro），5）；1個(gè)雜環(huán)類化合物：1H-吲哚甲醛（indole-3-carboxaldehyde，7）；1個(gè)苷元類化合物：大豆黃酮（daidzein，8）；2 個(gè)酚酞類化合物：放線菌素 X2（actinomycin X2， 9）、放線菌素 D（actinomycin D， 10），其結(jié)構(gòu)式如圖4。

2.5 單體化合物最小抑菌濃度

分別用分離純化得到的10種單體化合物對(duì)4種真菌白念珠菌（C.albicans）、黑曲霉（A. niger）、煙曲霉（A. fumigatus）、紅色毛癬菌（T. rubrum）；4種細(xì)菌大腸埃希菌（E. coli）、肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、金黃色葡萄球菌（S.aureus、MRSA）的進(jìn)行抑菌活性測(cè)定，結(jié)果如表3～4。化合物4、9和10對(duì)這8種病原菌均有較強(qiáng)的抑制作用。化合物4對(duì)4種真菌的抑制活性比較高，其中對(duì)白念珠菌的抑制活性最強(qiáng)，達(dá)到

8 μg/mL。化合物9和10對(duì)4種細(xì)菌的抑制活性比較高，其中對(duì)MRSA的抑制活性達(dá)到1 μg/mL。

2.6 單體化合物4和10抗白念珠菌活性作用

利用掃描電子顯微鏡觀察抑菌活性較強(qiáng)的化合物4和10對(duì)白念珠菌的生長(zhǎng)抑制作用，結(jié)果如圖5所示，空白對(duì)照組中的白念珠菌的細(xì)胞膜表面平整、光滑，細(xì)胞黏附在一起，從圖中可以觀察到細(xì)胞正在進(jìn)行出芽生殖。經(jīng)化合物4作用后，細(xì)胞表面出現(xiàn)空泡，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞間連接開始出現(xiàn)斷裂。經(jīng)化合物10作用后，細(xì)胞表面出現(xiàn)皺縮凹陷，內(nèi)容物外泄，細(xì)胞形態(tài)遭到嚴(yán)重?fù)p傷。

3 討論

微生物的次級(jí)代謝物是具有生物活性的天然產(chǎn)物來(lái)源之一，也是藥物來(lái)源之一。微生物的次級(jí)代謝物不僅用于醫(yī)療領(lǐng)域，在農(nóng)業(yè)、食品領(lǐng)域也有著強(qiáng)大的潛力[15]。目前所研究的能產(chǎn)生具有生物活性的次級(jí)代謝物微生物有40%屬于放線菌，而鏈霉菌占其中80%[16-17]。目前，微生物來(lái)源已從土壤擴(kuò)大到特殊環(huán)境，例如：高鹽度、高壓、低溫和低營(yíng)養(yǎng)的海洋環(huán)境，極寒之地與沙漠，以及昆蟲和植物的微環(huán)境等[18-20]。人們已從植物、土壤以及海洋來(lái)源鏈霉菌中分離出多種具有抗菌活性的次級(jí)代謝物，包括聚酮類、生物堿、肽類、酰胺類和甾體類等[21-23]。本研究以美洲大蠊腸道中分離的具有抗白念珠菌的環(huán)圈鏈霉菌為研究對(duì)象，從其次級(jí)代謝物中分離出生物堿、環(huán)肽、雜環(huán)與苷元類化合物以及酚酞類化合物。這說明美洲大蠊腸道來(lái)源鏈霉菌次級(jí)代謝物具有分離出新抗菌化合物的潛力。

本研究首次在環(huán)圈鏈霉菌的次級(jí)代謝物中分離出1H-吲哚甲醛（indole-3-carboxaldehyde，7）、大豆黃酮（daidzein，8）、放線菌素 X2（actinomycin X2， 9）、放線菌素D（actinomycin D， 10），其中放線菌素D和大豆黃酮是目前已經(jīng)應(yīng)用于臨床的藥物。李聆莉等[24]從南海紅樹林底泥放線菌Streptomyces sp. H41-26中分離出放線菌素D，并研究其抗細(xì)菌活性，結(jié)果顯示放線菌素D的抗菌活性良好，MIC值為80 μg/mL；而本研究從環(huán)圈鏈霉菌次級(jí)代謝物分離出放線菌素X2和放線菌素D抑菌活性具有明顯優(yōu)勢(shì)，抗大腸埃希菌MIC值分別為32和64 μg/mL，對(duì)MRSA表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制活性，MIC值均為1 μg/mL，同時(shí)也具有抗白念珠菌活性，MIC值分別為32和64 μg/mL。另外，對(duì)這10種化合物進(jìn)行抗菌譜篩查，發(fā)現(xiàn)化合物4（4-甲氧基-5-甲硫基-6-甲醛肟基-1，6-二氫-2'-聯(lián)吡啶）對(duì)白念珠菌的抑制活性最強(qiáng)，達(dá)到8 μg/mL；化合物4對(duì)煙曲霉、紅色毛癬菌、金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌也有較好的抑制作用，MIC值在8～64 μg/mL

范圍內(nèi)；化合物4經(jīng)核磁質(zhì)譜確認(rèn)為collismycin A，而collismycin A在抗菌，抗癌以及抗炎方面有著巨大的潛力。Chen等[12]也從美洲大蠊腸道來(lái)源菌提取出collismycin A，發(fā)現(xiàn)collismycin A能抑制耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的細(xì)胞膜生成；此外，有文獻(xiàn)報(bào)道[25]具有聯(lián)吡啶為母核的一類化合物通過螯合鐵離子來(lái)抑制MSSA和MRSA的生物膜形成，這一點(diǎn)與本文的電鏡結(jié)果一致。放線菌素D作為具有抗腫瘤、抗菌等作用的臨床應(yīng)用藥物，其主要通過與DNA結(jié)合，抑制DNA依賴的RNA的合成，同時(shí)還能抑制拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ，從而達(dá)到抗菌作用；然而，Lee等[26]研究了放線菌素D的抗生物膜活性，結(jié)果顯示其抗生物膜活性呈現(xiàn)出劑量依賴性；Mu等[27]采用微滴板法和顯微鏡法測(cè)定放線菌素D的抗生物膜活性，并證明放線菌素D通過下調(diào)ica位點(diǎn)，減少胞間黏附素的產(chǎn)生，從而抑制細(xì)菌細(xì)胞膜的形成，然而放線菌素D抑制白念珠菌生物膜形成的機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究對(duì)美洲大蠊腸道來(lái)源的具有抗白念珠菌活性的鏈霉菌進(jìn)行了鑒定，并對(duì)其具有抑菌活性的次級(jí)代謝產(chǎn)物進(jìn)行了挖掘和初步研究，為新天然產(chǎn)物的發(fā)現(xiàn)提供了一條新途徑，為昆蟲來(lái)源菌今后的研究奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

Sayed A M， Hassan M H A， et al. Extreme environments： Microbiology leading to specialized metabolites[J]. J Appl Microbiol， 2020， 128（3）： 630-657.

楊芹， 郭普宇， Abidueva E Y， 等. 西伯利亞Gudzhirganskoe鹽湖土壤放線菌多樣性、新穎性及抗菌活性研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2023， 48 （4）： 403-412.

Nesa J， Sadat A， Buccini D F， et al. Antimicrobial peptides from Bombyx mori： A splendid immune defense response in silkworms[J]. RSC Adv， 2020， 10： 512-523.

Zhang X， Zhang F， Lu X. Diversity and functional roles of the gut microbiota in Lepidopteran insects[J]. Microorganisms， 2022， 10（6）： 1234.

Li Y， Chang L， Xu K， et al. Research progresses on the function and detection methods of insect gut microbes[J]. Microorganisms， 2023， 11（5）：1-16.

Siddiqui R， Elmashak Y， Khan N A， et al. Cockroaches： A potential source of novel bioactive molecule（s） for the benefit of human health[J]. Appl Entomol Zool， 2023， 58（1）： 1-11.

Guzman J， Vilcinskas A. Bacteria associated with cockroaches： Health risk or biotechnological opportunity[J]？ Appl Microbiol Biotechnol， 2020， 104（24）： 10369-10387.

Geng J， Sui Z X， Dou W H， et al. 16S rRNA gene sequencing reveals specific gut microbes common to medicinal insects[J]. Front Microbiol， 2022， 13： 892767.

方霞， 沈娟， 王影姣， 等. 藥用昆蟲美洲大蠊內(nèi)生放線菌的分離和鑒定[J]. 中國(guó)病原生物學(xué)雜志， 2016， 11（6）： 550-553.

蔣詩(shī)林， 葉宇歆， 沈娟， 等. 美洲大蠊腸道內(nèi)生放線菌抗金黃色葡萄球菌和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌活性分析[J]. 環(huán)境昆蟲學(xué)報(bào)， 2021， 43（2）： 453-461.

Akbar N， Siddiqui R， Iqbal M， et al. Gut bacteria of cockroaches are a potential source of antibacterial compound（s）[J]. Lett Appl Microbiol， 2018， 66（5）： 416-426.

Chen Z， Ou P， Liu L， et al. Anti-MRSA activity of actinomycin X2 and collismycin a produced by Streptomyces globisporus WA5-2-37 from the intestinal tract of American cockroach （Periplaneta americana）[J]. Front Microbiol， 2020， 11： 1-8.

Ma Y， Xu M， Liu H， et al. Antimicrobial compounds were isolated from the secondary metabolites of Gordonia， a resident of intestinal tract of Periplaneta americana[J]. AMB Express， 2021， 11（1）： 1-11.

Ma Y， Guo P， Chen X， et al. Anti-Klebsiella pneumoniae activity of secondary metabolism of Achromobacter from the intestine of Periplaneta americana[J]. BMC Microbiol. 2023， 23（1）： 1-9.

趙江華， 房歡， 張大偉. 微生物次級(jí)代謝產(chǎn)物生物合成的研究進(jìn)展[J]. 生物技術(shù)通報(bào)， 2020， 36（11）： 141-147.

張琳， 常愷莉， 姚感， 等. Streptomyces albireticuli和Streptomyces albofavus次生代謝產(chǎn)物的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2021， 46（2）： 89-96.

薛正蓮， 王珊， 孫俊峰， 等. 鏈霉菌形態(tài)分化與次級(jí)代謝產(chǎn)物合成的研究進(jìn)展[J]. 微生物學(xué)報(bào)， 2021， 61（12）： 3870-3886.

Chakraborty B， Kumar R S， Almansour A I， et al. Bioprospection and secondary metabolites profiling of marine Streptomyces levis strain KS46[J]. Saudi J Biol Sci， 2022， 29（2）： 667-679.

Durán P， Barra PJ， Jorquera M A， et al. Occurrence of soil fungi in antarctic pristine environments[J]. Front Bioeng Biotechnol， 2019， 7： 28.

盧覃培， 劉少偉， 胡辛欣， 等. 塔克拉瑪干沙漠來(lái)源鏈霉菌Streptomyces sp. 90次級(jí)代謝產(chǎn)物的研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2022， 47（7）： 654-660.

Wu T， Salim A A， Khalil Z G， et al. Glenthmycins A-M： Macrocyclic spirotetronate polyketide antibacterials from the Australian pasture plant-derived Streptomyces sp. CMB-PB041[J]. J Nat Prod， 2022， 85（6）： 1641-1657.

Ma R， Cheng S， Sun J， et al. Antibacterial gilvocarcin-type aryl-C-glycosides from a soil-derived Streptomyces species[J]. J Nat Prod， 2022， 85（10）： 2282-2289.

Chen J， Xu L， Zhou Y， et al. Natural products from actinomycetes associated with marine organisms[J]. Mar Drugs，2021， 19（11）： 1-57.

李聆莉， 許琳雅， 唐曉翠， 等. 南海紅樹林底泥放線菌Streptomyces sp. H41-26的抗菌化學(xué)成分研究[J]. 中國(guó)抗生素雜志， 2017， 42（4）： 351-356.

Jin-Hyung L， Eonmi K， Hyukjae C， et al. Collismycin C from the micronesian marine bacterium Streptomyces sp. MC025 inhibits Staphylococcus aureus biofilm formation[J]. Marine Drugs， 2017， 15（12）：1-10.

Lee J H， Kim Y G， Lee K， et al. Streptomyces-derived actinomycin D inhibits biofilm formation by Staphylococcus aureus and its hemolytic activity[J]. Biofouling， 2016， 32（1-2）： 45-56.

Mu Y Q， Xie T T， Zeng H， et al. Streptomyces-derived actinomycin D inhibits biofilm formation via downregulating ica locus and decreasing production of PIA in Staphylococcus epidermidis[J]. J Appl Microbiol， 2020， 128（4）： 1201-1207.