金線蓮多糖通過抑制NF-κB信號通路對糖尿病小鼠腎損傷的改善作用

摘要： 為了考察金線蓮多糖對糖尿病小鼠腎損傷的改善作用，將糖尿病小鼠隨機分為模型組、二甲雙胍組及高、低劑量金線蓮多糖組（100和300 mg·kg-1），給藥4周后測定小鼠血清生化指標、炎癥因子及腎皮質中的蛋白表達，并觀察腎組織形態(tài)學變化。結果表明：與正常組比，模型組小鼠24 h的尿蛋白質量，血肌酐濃度、丙二醛濃度、炎癥因子顯著升高，而血清超氧化物歧化酶活力顯著下降；模型組小鼠腎組織p-NF-κB p65的蛋白表達顯著上調，podocin，Nephrin的蛋白表達明顯下調；組織學檢查顯示模型組小鼠腎組織結構異常改變；經(jīng)金線蓮多糖干預后，糖尿病小鼠血清生化指標、腎組織中蛋白表達均明顯逆轉，組織學檢查也顯示糖尿病小鼠腎損傷明顯改善。

關鍵詞： 金線蓮多糖； 糖尿??； 腎損傷； NF-κB信號通路

中圖分類號： R 965.1文獻標志碼： A"" 文章編號： 1000-5013（2024）05-0635-07

Improvement Effects of Anoectochilus roxburghii Polysaccharose on Renal Injury in Diabetic Mice by Inhibiting NF-кB Signaling Pathway

Abstract： To investigate the improvement effect of Anoectochilus roxburghii polysaccharide on renal injury in diabetic mice， the diabetic mice were randomly divided into model group， metformin group and Anoectochilus roxburghii polysaccharide groups （100 and 300 mg·kg-1）. After 4 weeks of treatment， the serum biochemical indexes， inflammatory factors and protein expression in renal cortex of the mice were measured， and the renal morphological changes were observed. The results showed that compared with the control group， 24-hour urine protein mass， serum creatinine concentration， malondialdehyde content and inflammatory factors of mice in model group were significantly increased， while serum superoxide dismutase activity was significantly decreased. The protein expression of p-NF-κB p65 in renal tissue of model group was significantly up-regulated， and the protein expressions of podocin and Nephrin were significantly down-regulated. Histological examination showed abnormal changes of renal tissue structure of mice in model group. The serum biochemical indexes and protein expression in kidney tissue of diabetic mice were significantly reversed after the intervention of the Anoectochilus roxburghii polysaccharide， and the histological examination also showed that the kidney injury of diabetic mice treated with Anoectochilus roxburghii polysaccharide was significantly improved.

Keywords：Anoectochilus roxburghii polysaccharose； diabetes； renal injure； NF-κB signaling pathway

糖尿病腎病是糖尿病最常見的綜合癥。在持續(xù)高血糖的毒性作用下糖尿病患者腎臟的結構和功能發(fā)生改變，導致腎小球高濾過，尿蛋白增加及腎臟損傷［1］。腎小球濾過屏障異常，蛋白尿的出現(xiàn)是糖尿病腎病早期標志性的臨床表現(xiàn)。足細胞及其足突之間的裂孔隔膜構成濾過屏障的最外層，足細胞結構異常是蛋白尿發(fā)生的重要原因。足細胞的足突間交叉形成裂孔，其上覆蓋的隔膜中表達多種特異性蛋白，podocin和Nephrin是裂孔膜上的重要蛋白分子，對維持裂孔膜的完成整性起關鍵作用。如果足細胞的特征性蛋白丟失，裂孔間隙就會變大，引起腎小球濾過屏障高滲漏，蛋白就進入尿液，形成蛋白尿［2］。引起糖尿病腎病的機制復雜，目前臨床上還沒有理想的治療糖尿病腎病的特異性藥物。

金線蓮是蘭科開唇屬的多年生草本植物，在我國主要分布于福建、江西、臺灣等地。金線蓮性平味甘，具有清熱涼血、祛風利濕的功效［2］，且無毒副作用，在民間常用于治療腎炎、糖尿病、高血壓等病癥［3］。金線蓮多糖是金線蓮的主要有效成分之一，以往的研究顯示，金線蓮多糖有很好的降血糖、降血脂等作用［4-5］。金線蓮多糖能保護糖尿病小鼠的腎組織［6］，但金線蓮多糖是否能通過改善糖尿病小鼠的腎小球過濾屏障而改善腎功能還未見研究。基于此，本文研究金線蓮多糖通過抑制NF-κB信號通路對糖尿病小鼠腎損傷的改善作用。

1 實驗材料

1.1 材料與試劑

金線蓮原植物（福建省佳晟生物有限公司）；二甲雙胍腸溶片（0.25 mg·片-1，貴州天安藥業(yè)股份有限公司），藥物均采用蒸餾水現(xiàn)配現(xiàn)用。金線蓮多糖（Anoectochilus roxburghii polysaccharose，ARP）由蘭州大學功能有機分子化學國家重點實驗室提取、鑒定并提供［6］，純度≥95%。

鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma公司）；高脂飼料（HFD，按照20%脂肪、2%膽固醇、10%蔗糖、0.5%膽酸鈉、其他為基礎鼠飼料進行配置）；尿蛋白、總超氧化物歧化酶（T-SOD）、丙二醛（MDA）、肌酐、IL-6試劑盒、TNF-α ELISA試劑盒（南京建成生物公司）；p-NF-κB p65抗體（Affinity試劑公司）；Nephrin抗體、podocin抗體（武漢博士德生物工程有限公司）；β-actin抗體（武漢愛博泰克生物科技有限公司）；BCA 蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司）；二抗（上海圣克魯斯生物技術有限公司）。

1.2 實驗動物

SPF級雄性ICR小鼠，體質量為（18±2） g，由福建醫(yī)科大學實驗動物中心提供，許可證號SYXK（閩）2016-0006。將小鼠置于溫度（22±2） ℃，濕度（50±5）%，光暗周期為12 h/12 h（光照時間7：00-19：00）的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由獲取飲水與飼料，適應性飼養(yǎng)1周后開始糖尿病模型的誘導。實驗遵守華僑大學倫研批第（A2019016）號審查要求。

1.3 儀器

超微量核酸蛋白測定儀（英國 Bio Drop公司）；M530型組織切片機（德國MEDITE公司）；MULTISKAN ASCENT-354型酶標儀（美國熱電公司）；JY-SCZ2型垂直板電泳槽、JY300C型電泳儀（北京君意東方電泳設備有限公司）；Image Station 4000MM型化學發(fā)光成像儀（美國柯達公司）；快速血糖檢測儀（美國羅氏生物科技有限公司）。

2 實驗方法

2.1 2型糖尿病小鼠模型的建立

高脂飼料（HFD）/STZ誘導2型糖尿病小鼠建模方法參考文獻［6］，即除正常組小鼠給予標準飼料外，其余小鼠給予HFD喂養(yǎng)3周，小鼠體質量明顯增加后，將小鼠禁食不禁水12 h后，采用質量比為130 mg·kg-1的STZ一次性腹腔注射。72 h后，測小鼠空腹血糖濃度。選擇血糖濃度≥11.1 mmol·L-1為糖尿病小鼠，血糖不達標的小鼠3 d后再用80 mg·kg-1的STZ一次性腹腔注射，72 h后，選擇血糖濃度≥11.1 mmol·L-1為糖尿病小鼠。將糖尿病小鼠隨機分為4組，每天分別灌胃給予同體積不同藥物。糖尿病模型組（生理鹽水，9只）、二甲雙胍組（200 mg·kg-1，8只），低劑量ARP組（100 mg·kg-1，9只）、高劑量ARP組（300 mg·kg-1，9只），所有糖尿病小鼠均持續(xù)給予高脂飼料，正常組小鼠給予普通飼料（10只）。藥物處理4周之后，處死動物。處死動物前3 d，收集小鼠24 h尿液，測尿蛋白質量，并測定小鼠空腹血糖濃度。小鼠處死后收集血液，分離血清，用于生化檢測，并分離右側腎臟皮質組織，快速冷凍，于-80 ℃保存，用于Western blot分析。左側腎臟保存于4 g·mL-1的多聚甲醛溶液中，用于組織學觀察。

2.2 生化檢測

使用血糖儀檢測小鼠的空腹血糖濃度。取血液樣品，分離血清，采用生化檢測試劑盒檢測小鼠24 h尿蛋白質量及血清中SOD活性、MDA濃度及血肌酐濃度。

2.3 ELISA分析

分離血清，按照試劑盒說明書要求檢測小鼠血清中IL-6，TNF-α的質量濃度。

2.4 Western blot分析

采用Western blot分析小鼠腎組織p-NF-κB p65，podocin，Nephrin的蛋白表達。取小鼠腎臟組織勻漿約50 mg，加入含蛋白酶抑制劑的預冷細胞裂解液，充分裂解后，離心取上清，采用BCA法測蛋白質量并定量。將各組蛋白樣品用裂解液調成相同濃度（50 μmol·L-1），經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）恒壓電泳分離蛋白，將電泳好的凝膠轉膜至硝酸纖維素膜，將轉好的膜加5 g·mL-1脫脂牛奶封閉后，分別加入相應一抗，即p-NF-κB p65抗體（1∶1 000）、podocin抗體（1∶1 000）、Nephrin抗體（1∶1 000）和β-actin單抗（1∶300），4 ℃下孵育過夜。最后，加二抗37 ℃下孵育1 h，ECL電化學發(fā)光成像。使用Quantity-one專業(yè)分析軟件對Western blot實驗所得圖片進行光密度掃描分析。

2.5 蘇木精-伊紅染色觀察小鼠腎臟組織損傷

用4 g·mL-1多聚甲醛溶液固定小鼠腎臟組織24 h以上，經(jīng)脫水、浸蠟、包埋，制成石蠟塊，再用切片機切成4 μm厚的切片，脫蠟至水，蘇木精-伊紅（HE）染色，二甲苯透明，樹膠封片，于400倍光學顯微鏡下觀察腎臟組織損傷情況。

2.6 統(tǒng)計學分析

實驗結果以x±s形式表示，數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析，多組比較采用單因素方差分析，2組比較采用LSD-t檢驗。當P＜0.05時，表示差異具有統(tǒng)計學意義。與正常組比較，aPlt;0.05，bPlt;0.01；與模型組比較，cPlt;0.05，dPlt;0.01 。

3 實驗結果與分析

3.1 小鼠的血糖與體質量

各組小鼠血糖濃度及體質量變化，如圖1所示。圖1中：cb為小鼠血糖濃度；m為小鼠體質量。

由圖1可知：實驗開始時（0周），各組小鼠的血糖濃度沒有明顯差異，小鼠經(jīng)HFD喂養(yǎng)3周，STZ誘導后，糖尿病小鼠的血糖濃度比正常組明顯升高（P＜0.01）；隨著實驗時間的延長，與正常組相比，糖尿病小鼠的血糖濃度持續(xù)升高，而與模型組相比，給予不同藥物干預4周后，藥物組小鼠血糖明顯下降（P＜0.05）；實驗開始時，各組小鼠的體質量無明顯差異，HFD喂養(yǎng)3周后，小鼠體質量明顯增加（P＜0.01）；隨著實驗時間的延長，正常組小鼠體質量增加較快，相比之下，模型組小鼠的體質量明顯下降（P＜0.01）；經(jīng)藥物治療4周后，糖尿病小鼠的體質量下降得到明顯緩解（P＜0.01）。

3.2 生化檢測結果

生化檢測結果，如圖2所示。圖2中：z為SOD的活性；cMDA為MDA濃度；mp為24 h尿蛋白質量；ccr為血肌酐濃度。

由圖2可知：與正常小鼠相比，模型組小鼠的血清中抗氧化酶SOD的活性下降，MDA濃度增多，表明糖尿病小鼠的氧化應激作用增強；同時，模型組小鼠的24 h尿蛋白質量及血肌酐濃度增多，表明模型組小鼠腎功能異常；給予糖尿病小鼠金線蓮多糖后，高、低兩個劑量的ARP組小鼠的24 h尿蛋白質量及血肌酐濃度均明顯下降（P＜0.01），表明糖尿病小鼠腎小球高濾過現(xiàn)象得到改善；給予不同劑量金線蓮多糖干預后，小鼠血清中SOD的活性顯著上升（P＜0.01），MDA濃度明顯降低（P＜0.01），表明糖尿病小鼠增強的氧化應激作用減弱。

3.3 Elisa檢測結果

小鼠血清中IL-6，TNF-α的質量濃度，如圖3所示。圖3中：ρIL-6，ρTNF-α分別為IL-6，TNF-α的質量濃度。

由圖3可知：模型組小鼠血清中炎癥因子IL-6，TNF-α的質量濃度比正常小鼠高，經(jīng)金線蓮多糖干預后，糖尿病小鼠血清中炎癥因子IL-6，TNF-α的質量濃度明顯下降（P＜0.05），表明金線蓮多糖有較強的抗炎作用。

3.4 Western blot分析

小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65，podocin，Nephrin的蛋白表達，如圖4所示。由圖4可知：模型組小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65的表達上調，提示糖尿病小鼠腎臟組織中NF-κB信號通路被激活；模型組小鼠腎臟組織中podocin，Nephrin的蛋白表達均下調，提示糖尿病小鼠腎小球濾過膜受損；給予金線蓮多糖后，糖尿病小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65的表達下調（P＜0.01），podocin，Nephrin的蛋白表達均上調（低劑量ARP組P＜0.05，高劑量ARP組P＜0.01），（低、高劑量ARP組P＜0.01）。

3.5 HE染色分析

金線蓮多糖對糖尿病小鼠腎臟組織病理學變化的影響，如圖5所示。圖5中：紅色箭頭顯示系膜區(qū)增生；黑色箭頭顯示足細胞病變；右下角方框內為箭頭所示足細胞局部放大圖。

正常組小鼠腎小球系膜細胞及基質無增生，毛細血管管腔通暢，腎小球囊無擴張（圖5（a））；與正常小鼠相比，模型組小鼠的腎臟結構明顯改變，腎小球系膜細胞呈現(xiàn)明顯增生，系膜基質增多，呈彌漫或節(jié)段性，毛細血管受壓，管腔狹窄，腎小球囊擴張，足細胞萎縮、變性（圖5（b））；給予二甲雙胍的糖尿病小鼠的腎小球體積如常，系膜基質、系膜細胞呈局灶節(jié)段或節(jié)段性輕度增多，毛細血管擴張，腎小球囊無明顯擴張，足細胞增生（圖5（c））；給予低劑量金線蓮多糖的糖尿病小鼠的腎小球系膜細胞及基質呈節(jié)段性輕度增生，以系膜基質增生為主，毛細血管腔無明顯受壓，足細胞肥大，損傷明顯緩解，腎小球囊無明顯擴張（圖5（d））；給予高劑量金線蓮多糖的糖尿病小鼠的腎小球系膜細胞及基質呈節(jié)段性明顯增生，毛細血管受壓貧血，腎小球囊擴張，但比模型組小鼠有所改善，足細胞增生（圖5（e））。

4 結論

糖尿病腎病占糖尿病患者的30%～40%，是最常見的糖尿病并發(fā)癥。引起糖尿病腎病的確切機制還不清楚。大量的報道顯示，炎癥反應、氧化應激、胰島素抵抗等與糖尿病腎病病理密切相關［7-9］。對糖尿病機制及治療藥物的研究是醫(yī)療領域的熱點，目前HFD/STZ誘導的2型糖尿病模型被很多糖尿病研究者采用［10-11］。實驗小鼠經(jīng)高脂飲食喂養(yǎng)3周，出現(xiàn)明顯肥胖后，一次性注射STZ損傷小鼠胰島β細胞，并持續(xù)給予高脂飼料喂養(yǎng)，經(jīng)HFD/STZ誘導將小鼠發(fā)展為2型糖尿病。糖尿病小鼠隨著血糖濃度的升高，體質量逐漸減輕，其24 h蛋白尿質量及血肌酐濃度均明顯升高，表明糖尿病小鼠腎臟功能受損。腎小球高濾過，炎癥、氧化應激與糖尿病腎病的發(fā)病機制有關［12-13］。實驗結果表明，糖尿病小鼠在持續(xù)高血糖作用下，血清抗氧化酶SOD活性顯著下降。SOD是內源性自由基清除酶，SOD活性下降使體內氧化與抗氧化失衡，導致活性氧ROS產(chǎn)生量增多，引起脂質過氧化中間產(chǎn)物MDA濃度增多，MDA濃度越高，表明氧化損傷越嚴重。

NF-κB信號通路是對氧化應激及炎癥敏感的信號通路。糖尿病狀態(tài)下，在過多活性氧ROS及炎癥因子的刺激下，NF-κB信號通路被激活，促進系膜表達TGF-β，引起細胞外基質增生，導致腎小球基底膜增厚和腎小球硬化，加速纖維化進程，并引起或加劇炎癥［14-15］。足細胞損傷也是糖尿病腎病早期的一個關鍵特征。糖尿病狀態(tài)下，足細胞丟失，導致腎小球內皮細胞的損傷和高通透性，引起蛋白尿的發(fā)生［16］。實驗中糖尿病小鼠血清中炎癥因子IL-6和TNF-α的質量濃度顯著升高。過多的炎癥因子與氧化應激使糖尿病小鼠腎臟組織中p-NF-κB p65的表達上調，激活了NF-κB信號通路，激活的NF-κB信號通路反過來又調控IL-6和TNF-α等炎癥因子，加速疾病的進展［17］。組織學檢查顯示，糖尿病小鼠腎小球系膜細胞明顯增生，系膜基質增多，毛細血管腔明顯受壓，腎小球囊擴張，腎小球結構明顯改變。腎小球結構的改變進一步引起腎小球功能的改變。實驗中糖尿病小鼠腎臟組織的podocin和Nephrin的表達顯著下降，podocin和Nephrin是足細胞裂孔膜上的特殊蛋白分子，它們的減少導致腎小球濾過屏障缺損，使蛋白分子進入尿液，糖尿病小鼠出現(xiàn)蛋白尿、血肌酐濃度升高癥狀，并出現(xiàn)糖尿病腎病。

給予金線蓮多糖后，糖尿病小鼠腎臟炎癥因子水平明顯下調，血清SOD活性增加，MDA濃度顯著減少，氧化應激反應降低，腎臟組織p-NF-κB p65的表達下調，NF-κB信號通路被抑制。病理學檢查結果顯示，金線蓮多糖組小鼠的損傷減輕，特別是低劑量金線蓮多糖組系膜細胞及基質呈節(jié)段性輕度增生，毛細血管腔無明顯受壓，腎小球囊無明顯擴張，足細胞損傷緩解（圖5（d））。與病理學結果一致的是，經(jīng)金線蓮多糖干預后，糖尿病小鼠尿蛋白明顯減少，血肌酐濃度降低，糖尿病腎病明顯好轉。

臨床上還沒有理想的糖尿病腎病治療藥物，目前主要采用血管緊張素轉化酶抑制劑，血管緊張素Ⅱ受體阻斷劑等藥物治療糖尿病腎病。但總體療效和遠期預后較差，加上不良反應多，不能有效阻止糖尿病腎病患者發(fā)展為終末期腎病。二甲雙胍是臨床推薦使用的抗2型糖尿病的一線藥物，它可能增加乳酸酸中毒的風險，不適用于晚期糖尿病腎病的治療［18］。實驗結果表明，金線蓮多糖有與二甲雙胍相似的作用，糖尿病腎病治療藥物仍是臨床面臨的難題，糖尿病腎病不僅提高了心血管疾病的病死率，還加重了患者和社會的負擔?？紤]到金線蓮多糖基本無毒，能通過抗炎、抗氧化，抑制NF-κB信號通路發(fā)揮腎保護作用，因此，將金線蓮用于治療糖尿病腎病可能具有較好的前景。

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