多粘類芽孢桿菌中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的克隆表達(dá)及固定化研究

摘要： 為了對D-半乳糖進(jìn)行異構(gòu)化制備D-塔格糖，從多粘類芽孢桿菌KF-1中克隆L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因，并在大腸桿菌BL21（DE3）細(xì)胞中表達(dá)； 重組蛋白PpoLAI通過鎳柱純化，并利用殼聚糖微球進(jìn)行固定化研究。結(jié)果表明： 使用D-半乳糖作為底物時，PpoLAI的最佳溫度和pH分別為50 ℃、 7.0； Mn2+顯著激活酶活性，當(dāng)Mn2+的濃度為0.8 mmol/L時，PpoLAI的活性最高；以D-半乳糖為底物的PpoLAI的米氏常數(shù)和分別為161.4 mmol/L及98.84 μmol/（mg·min）；PpoLAI的最優(yōu)固定化條件為殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為3%，游離酶添加量為0.9 mg/g，吸附溫度為25 ℃，吸附時間為4 h，PpoLAI的固定化率為80.12%，固定化的PpoLAI的熱穩(wěn)定性、 pH穩(wěn)定性與游離酶相比有顯著提升。

關(guān)鍵詞： D-塔格糖； L-阿拉伯糖異構(gòu)酶； 表達(dá)； 酶活性； 固定化

中圖分類號： Q814

文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

Cloning， Expression and Immobilization of

L-Arabinose Isomerase from Paenibacillus polymyxa

Abstract： To isomerize D-galactose for preparing D-tagatose， a novel L-arabinose isomerase gene was cloned from Paenibacillus polymyxa KF-1 and expressed in Escherichia coli BL21 （DE3） cells. The recombinant protein PpoLAI was purified by Ni Sepharose 6FF column， and immobilized by chitosan-glutaraldehyde crosslinking method. The results show that the optimal temperature and pH of purified PpoLAI are 50 ℃ and 7.0， respectively， using D-galactose as substrate. The enzyme is significantly activated by Mn2+， and the activity of PpoLAI reaches the highest when Mn2+ concentration is 0.8 mmol/L. The Michaelis constant and maximal velocity of PpoLAI with D-galactose as substrate are 161.4 mmol/L and 98.84 μmol/（mg·min）， respectively. The optimal immobilization conditions of PpoLAI are achieved with following conditions： mass fraction of chitosan is 3%， volume fraction of glutaraldehyde is 3%， amount of free enzyme addition is 0.9 mg/g， adsorption temperature is 25 ℃， and adsorption time is 4 h. Under these conditions， the immobilization rate reaches 80.12%， and the thermal stability and pH stability of immobilized PpoLAI are significantly improved compared with the free enzyme.

Keywords： D-tagarose; L-arabinose isomerase; expression; enzyme activity; immobilization

D-塔格糖是一種六碳酮糖，是自然界中的稀有單糖之一。D-塔格糖具有良好的水溶性，甜度與蔗糖相似，但提供的熱量僅為蔗糖的1/3。由于D-塔格糖具有高甜度、 低熱量和安全性的優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為是蔗糖的理想替代品［1］。研究結(jié)果表明，D-塔格糖在降低血糖、 改善腸道微生態(tài)環(huán)境、保護(hù)牙齒和防止肝損傷等方面具有廣闊的應(yīng)用前景［2-3］。

由于D-塔格糖從天然來源提取的產(chǎn)量有限，無法滿足大規(guī)模生產(chǎn)的需要，因此其制備工藝受到了研究人員的廣泛關(guān)注。D-塔格糖的生產(chǎn)方法主要有化學(xué)法和生物轉(zhuǎn)化法。研究者通過化學(xué)法轉(zhuǎn)化D-半乳糖制備D-塔格糖；但是該生產(chǎn)過程生成副產(chǎn)物且產(chǎn)生大量酸堿廢水［4］，因此該工藝的推廣應(yīng)用受到限制?；诖?，研究人員致力于開發(fā)溫和的酶轉(zhuǎn)化方法來生產(chǎn)D-塔格糖［5-6］。近年來，由于L-阿拉伯糖異構(gòu)酶催化的D-半乳糖異構(gòu)化為D-塔格糖的反應(yīng)步驟簡單，且D-半乳糖價格低廉，因此成為制備D-塔格糖最有前景的方法。

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（EC5.3.1.4）屬于醛酮異構(gòu)酶家族， 可催化L-阿拉伯糖異構(gòu)化產(chǎn)生L-核酮糖、 D-半乳糖異構(gòu)化產(chǎn)生D-塔格糖［7］。迄今為止， 能夠產(chǎn)生L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的微生物超過30種， 這些微生物幾乎都屬于細(xì)菌［8］。 研究表明， 大多數(shù)L-阿拉伯糖異構(gòu)酶含有二價金屬離子， 如Mn2+、 Co2+或Mg2+［9］。由于L-阿拉伯糖異構(gòu)酶對D-半乳糖的轉(zhuǎn)化效率較低， 因此在工業(yè)化D-塔格糖生產(chǎn)中的應(yīng)用受到限制， 篩選對D-半乳糖具有較高催化效率的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶具有重要意義。由于在前期研究中發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌能異構(gòu)化D-半乳糖， 因此本文中從多粘類芽孢桿菌的基因組中克隆L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因， 并在大腸桿菌中異源表達(dá)， 將重組L-阿拉伯糖異構(gòu)酶（PpoLAI）進(jìn)行純化和固定化研究， 為PpoLAI在D-塔格糖制備中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 生物材料及試劑

1.1.1 菌種和載體

菌種多粘類芽孢桿菌Paenibacillus polymyxa KF-1、 大腸桿菌Escherichia coli（E.coli） DH5α、 BL21（DE3）、 質(zhì)粒pET-28a（+）為本實(shí)驗(yàn)室自存。

1.1.2 主要試劑

卡那霉素（kanamycin， Kan）、 異丙基β-D-硫代吡喃半乳糖苷 （isopropyl-β-D thiogalactoside， IPTG）、 2， 2-聯(lián)喹啉-4， 4-二甲酸二鈉 （BCA）蛋白質(zhì)定量檢測試劑盒、 Ni Sepharose 6FF親和層析填料購自生工生物工程（上海）股份有限公司。分子克隆所用的試劑盒及蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品來源于寶生物（大連）有限公司。其他化學(xué)試劑購自北京索萊寶科技有限公司。

1.2 分子克隆及酶學(xué)性質(zhì)研究

1.2.1 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的三維結(jié)構(gòu)預(yù)測

利用蛋白結(jié)構(gòu)在線預(yù)測網(wǎng)站SWISS-MODEL，以嗜熱地芽胞桿菌來源的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶［蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB）登錄號：4R1O.1］作為模板，構(gòu)建PpoLAI的三維結(jié)構(gòu)模型，用PyMOL導(dǎo)出圖片。

1.2.2 目的基因的擴(kuò)增和原核表達(dá)載體構(gòu)建

1.2.3 篩選陽性克隆

測序驗(yàn)證的pET-28a/ppolai通過熱激法導(dǎo)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，涂布于Kan抗性平板上培養(yǎng)過夜，挑取單菌落，酶切驗(yàn)證。驗(yàn)證正確的單菌落進(jìn)行保種，并用于后續(xù)的重組蛋白的表達(dá)。

1.2.4 PpoLAI表達(dá)條件的優(yōu)化

將BL21/pET-28a/ppolai接種于含Kan的質(zhì)量濃度為50 mg/L的LB培養(yǎng)基，在37 ℃培養(yǎng)至菌體在波長600 nm處吸光度為0.6～0.8后，加入IPTG誘導(dǎo)重組蛋白。對誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，誘導(dǎo)溫度分別為16、 21、 25、 30、 35 ℃，IPTG的濃度分別為0、 0.25、 0.50、0.75、1.00mmol/L，誘導(dǎo)時間分別為8、 12、 16、 20、 24 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心分離5 min， 收集沉淀， 加入5 mL三羥甲基氨基甲烷（Tris）的濃度為20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，氯化鈉的濃度為100 mmol/L，咪唑的濃度為20 mmol/L， pH為7.0）重懸菌體，超聲破碎，超聲波開啟3 s，關(guān)閉8 s，總計10 min。裂解產(chǎn)物在4 ℃溫度下以轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心分離 30 min，收集包含目的蛋白L-阿拉伯糖異構(gòu)酶PpoLAI的上清液，通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分析檢測目的蛋白是否可溶表達(dá)［11］。

1.2.5 目的蛋白PpoLAI的純化

細(xì)胞裂解液上清中的目的蛋白PpoLAI用鎳柱親和層析柱純化。柱體積為5 mL，洗脫液中咪唑的濃度為50～250 mmol/L （溶于Tris-HCl的濃度為20 mmol/L的緩沖液，氯化鈉的濃度為100 mmol/L，pH為7.0）。洗脫體積為5倍柱體積，洗脫液用SDS-PAGE檢測目的蛋白的含量和純度。

1.2.6 PpoLAI的酶活力測定

以D-半乳糖為底物對重組PpoLAI進(jìn)行酶活力檢測， 反應(yīng)體系（體積為1 mL）包括20 μL的重組酶、 200 μL含MnSO4的濃度為1 mmol/L、 D-半乳糖質(zhì)量濃度為10 g/L的溶液（pH=7.0）及濃度為50 mmol/L的磷酸鹽緩沖液（以磷酸氫二鈉計，pH=7.0）。反應(yīng)體系在50 ℃反應(yīng)1 h，然后按照文獻(xiàn)所述的硫酸-咔唑法，測定反應(yīng)產(chǎn)物在波長為560 nm處的吸光度。轉(zhuǎn)化率定義為D-塔格糖與D-半乳糖的質(zhì)量之比。1單位（1 U）的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶活力的定義為：D-半乳糖在一定條件下被異構(gòu)化生成1 μmol/min塔格糖所需要的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的量［12］。

1.2.7 PpoLAI的酶學(xué)性質(zhì)研究

1）PpoLAI的最適pH及pH穩(wěn)定性研究。選用醋酸鈉濃度為50 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH=2.0～6.0）、 Tris濃度為50 mmol/L的Tris-HCl緩沖液（pH=6.0～8.0）以及甘氨酸濃度為50 mmol/L 的甘氨酸-氫氧化鈉緩沖液（pH=8.0～11.0）。將PpoLAI置于上述不同pH緩沖液中，以質(zhì)量濃度為10 g/L的D-半乳糖為底物，按1.2.6方法測定酶活力，每組3個平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。將測得的最大吸光值定義為100%。將PpoLAI的酶液在不同pH的緩沖液、溫度為4 ℃條件下孵育24 h，按1.2.6方法測定PpoLAI的殘余酶活力。同等測定條件下，未預(yù)孵育的PpoLAI的酶活力定義為100%。

2）最適溫度以及溫度穩(wěn)定性的測定。以質(zhì)量濃度為10 g/L的D-半乳糖為底物，分別在溫度為20～70 ℃的條件下反應(yīng)，按照1.2.6的方法測定酶活力，每組3個平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值。將測得的最大吸光值定義為100%。將重組PpoLAI置于溫度為20～70 ℃的條件下孵育，孵育時間分別為0、 20、 40、 60、 120 min，按1.2.6的測定方法，測定PpoLAI的殘余酶活力，每組3個平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值及標(biāo)準(zhǔn)差（SD）。

3）金屬離子對酶活力的影響。將PpoLAI酶液置于金屬離子中， 金屬離子的終濃度為1 mmol/L， 50 ℃孵育1 h， 按1.2.6的方法測定PpoLAI的殘余酶活力。 以未添加金屬離子孵育的PpoLAI的酶活力定義為100%。 此外， 將PpoLAI酶液與不同濃度的Mn2+混勻， 按照前述方法測定PpoLAI的殘余酶活力。 將未添加Mn2+時的PpoLAI酶活力定義為100%。

4）PpoLAI的動力學(xué)參數(shù)測定。在pH為7.0、 溫度為50 ℃的條件下測定PpoLAI對不同質(zhì)量濃度D-半乳糖（20、 40、 60、 80、 100 g/L）的反應(yīng)初速度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取3次實(shí)驗(yàn)的平均值，利用雙倒數(shù)作圖法計算米氏常數(shù)Km和最大反應(yīng)速率vmax［13］。

1.3 固定化研究

1.3.1 PpoLAI的固定化

按文獻(xiàn)［14］中所述的方法制備殼聚糖微球。稱取適量的殼聚糖微球，置于5 mL戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為 2%的溶液中（戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為25%的原液用去離子水稀釋12.5倍可得體積分?jǐn)?shù)為2%的戊二醛溶液），在溫度為30 ℃、 轉(zhuǎn)速為100 r/min的條件下振蕩2 h，然后在4 ℃靜止過夜，用去離子水多次沖洗微球后抽濾干燥。稱取0.5 g的上述殼聚糖微球置于5 mg純化的PpoLAI酶液中，在25 ℃條件下吸附4 h，然后放置于4 ℃靜置12 h，取出用去離子水緩慢沖洗干凈，抽濾干燥于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 PpoLAI固定化酶的酶活力測定

取0.1 g固定化殼聚糖微球，加入1.0 mL D-半乳糖的質(zhì)量濃度為10 mg/mL的溶液（溶于Tris的濃度為20 mmol/L的Tris-HCl緩沖液，pH=7.0）及0.121 mg MnSO4，在50 ℃振蕩反應(yīng)1 h，按照1.2.6測定方法檢測固定化酶的酶活力。固定化酶的固定化率計算公式為

式中： η為固定化度； a為酶總活力； af為游離酶的總活力。

1.3.3 PpoLAI固定化條件優(yōu)化

1）單因素實(shí)驗(yàn)。首先篩選影響PpoLAI固定化的因素， 包括殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)（2.0%～4.5%）、 游離酶用量（0.2～1.2 mg/g）、 戊二醛的體積分?jǐn)?shù)（1.0%～6.0%）、 吸附溫度（10～35 ℃）、 吸附時間（1～6 h）， 計算不同條件下的固定化效率。

2）Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)。利用Design Expert 8.0軟件設(shè)計五因素二水平（實(shí)驗(yàn)次數(shù)N=12）的Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)的因素及水平如表1所示。

3）最陡爬坡實(shí)驗(yàn)。對顯著影響酶活性的3個因素設(shè)計最陡爬坡路徑，根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)值變化的梯度方向確定爬坡方向。

4）響應(yīng)面分析。使用Design Expert 8.0軟件進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的Box-Behnken設(shè)計（BBD），并進(jìn)行回歸方程擬合和方差分析［15］。響應(yīng)面水平如表2所示。

5）最佳條件驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。根據(jù)響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)驗(yàn)證最佳固定化條件。使用前述方法測定固定化PpoLAI的酶活性，并與預(yù)測值進(jìn)行比較。計算固定化PpoLAI對D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率。

1.3.4 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)對比

1）按照 PpoLAI的酶活力測定方法對固定化酶與游離酶的最適pH及pH穩(wěn)定性、 最適溫度及熱穩(wěn)定性進(jìn)行研究，溫度分別設(shè)定為50、 60、 70 ℃。

2）研究固定化酶與游離酶的儲存穩(wěn)定性。將固定化酶與游離酶放置于4 ℃環(huán)境中，定期取樣，按照酶活力測定方法檢測參與酶活力。

3）固定化酶重復(fù)使用次數(shù)測定。反應(yīng)結(jié)束后，將固定化酶殼聚糖微球回收，緩沖液清洗微球，再次進(jìn)行酶促反應(yīng)及酶活力測定，重復(fù)7次。將第一次催化反應(yīng)測定的酶活力定義為100%。

1.4 結(jié)果處理

在酶學(xué)性質(zhì)研究和固定化研究中，每個實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個平行，實(shí)驗(yàn)結(jié)果取平均值及SD值。

2 結(jié)果與分析

2.1 多粘類芽孢桿菌中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶PpoLAI的三維結(jié)構(gòu)模擬

以嗜熱地芽胞桿菌中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶作為模板［16］，構(gòu)建PpoLAI的三維結(jié)構(gòu)模型，結(jié)果如圖1所示。由圖可以看出，PpoLAI的預(yù)測結(jié)構(gòu)與嗜熱地芽胞桿菌中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶相似，因此推測PpoLAI以同六聚體的形式存在。其中，每個亞基包含氮（N）端結(jié)構(gòu)域、中心結(jié)構(gòu)域和碳（C）端結(jié)構(gòu)域。6個亞基形成的中心空隙與底物結(jié)合和二價金屬離子的結(jié)合相關(guān)。前期研究表明，L-阿拉伯糖異構(gòu)酶通常在其中心空隙中結(jié)合Mn2+［8］。

2.2 多粘類芽孢桿菌中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的克隆與表達(dá)

以多粘芽孢桿菌基因組為模板進(jìn)行擴(kuò)增，得到一條編碼基因長度約為1 500 bp的特異性條帶，與數(shù)據(jù)庫中多粘類芽孢桿菌的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶編碼基因的長度相符（1 425 bp）。連接得到的重組質(zhì)粒pET-28a/ppolai經(jīng)雙酶切驗(yàn)證插入片段長度正確（約為1 500 bp）。測序結(jié)果表明，插入片段與GenBank中報道的多粘類芽孢桿菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶基因的序列完全重合（登錄號為WP_061829746.1）。

2.3 L-阿拉伯糖異構(gòu)酶PpoLAI的誘導(dǎo)表達(dá)以及酶的分離純化

重組菌大腸桿菌BL21/pET-28a/ppolai經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后， 電泳結(jié)果顯示重組蛋白PpoLAI位于細(xì)胞裂解液上清中， 表明PpoLAI為可溶性表達(dá)。 為了最大程度生產(chǎn)重組蛋白， 對PpoLAI的誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化， 結(jié)果表明， 當(dāng)誘導(dǎo)溫度為16 ℃、 IPTG的濃度為0.5 mmol/L、 誘導(dǎo)時間為16 h時， PpoLAI的產(chǎn)量最高， 重組酶活力達(dá)到24.01 U/mL， PpoLAI轉(zhuǎn)化D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率為53.7%。

通過鎳柱親和層析，用濃度為100 mmol/L的咪唑溶液將目的蛋白洗脫下來。經(jīng)鎳柱純化后的PpoLAI在SDS-PAGE圖中表現(xiàn)為均一的單條帶，如圖2所示。重組PpoLAI的分子質(zhì)量約為50 kDa。以D-半乳糖為底物的PpoLAI的Km和Vmax分別為161.4 mmol/L、 98.84 μmol/（mg·min）。

2.4 金屬離子對PpoLAI酶活性的影響

金屬離子對PpoLAI酶活性的影響的實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表3所示。由表可見：濃度分別為1 mmol/L的二價陽離子Mn2+、 Co2+、 Zn2+和Ca2+能夠有效提高重組酶PpoLAI的活性，其中Mn2+對PpoLAI酶活力的促進(jìn)最為顯著；相反，F(xiàn)e2+、 Mg2+、 Cu2+和K+可使PpoLAI的酶活力出現(xiàn)不同程度的減小。

Mn2+是目前發(fā)現(xiàn)的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶反應(yīng)需要的金屬離子之一， 不同濃度的Mn2+對酶活性影響很大， 因此繼續(xù)考察不同濃度的Mn2+對PpoLAI酶活性的影響， 結(jié)果如圖3所示。由圖可見： 當(dāng)Mn2+的濃度為0.8 mmol/L時PpoLAI酶活力是對照組的約6倍； 濃度大于0.8 mmol/L后， Mn2+對酶活力的促進(jìn)作用逐步下降。 Mn2+被認(rèn)為是一些細(xì)菌L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的激活劑， 對嗜熱地芽胞桿菌中L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的結(jié)構(gòu)解析結(jié)果表明， 高溫下亞基間相互作用引起的金屬介導(dǎo)異構(gòu)化反應(yīng)決定了L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的底物特異性， 并提升了酶的熱穩(wěn)定性［16］。

2.5 PpoLAI固定化條件的單因素優(yōu)化

2.5.1 殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

殼聚糖包埋法是常用的固定化酶方法。圖4所示為殼聚糖含量對PpoLAI固定化影響。由圖可以看出：當(dāng)殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%～3%時，PpoLAI的固定化效果逐步提升，在殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%時達(dá)到峰值；隨著殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)繼續(xù)增大， PpoLAI的相對酶活力逐漸減小。

2.5.2 游離酶用量

游離酶用量對PpoLAI固定化影響如圖5所示。當(dāng)游離酶液用量為1.0 mg/g時，PpoLAI固定化酶活力達(dá)到峰值；當(dāng)酶用量大于1.0 mg/g時，PpoLAI固定化酶活力開始減小。

2.5.3 戊二醛的體積分?jǐn)?shù)

由于殼聚糖包埋酶可能導(dǎo)致酶固定不牢固，容易脫落，因此經(jīng)常與戊二醛交聯(lián)法聯(lián)用，提高固定化效率。戊二醛的體積分?jǐn)?shù)對PpoLAI固定化的影響如圖6所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為1%～3%時，PpoLAI固定化酶活力隨戊二醛體積分?jǐn)?shù)增大而顯著增大；當(dāng)戊二醛的體積分?jǐn)?shù)大于3%時，PpoLAI固定化酶活力逐步減小。

2.5.4 吸附溫度

吸附溫度不僅能夠影響酶的吸附效率，對于酶的穩(wěn)定性也會造成一定影響。圖7所示為吸附溫度對PpoLAI固定化的影響。由圖可看出，吸附溫度為25 ℃時，PpoLAI固定化酶活力最大。

2.5.5 吸附時間

吸附時間對PpoLAI固定化的影響如圖8所示。由圖可以看出：吸附時間為4 h時，PpoLAI固定化酶活力最大；吸附時間超過4 h后，PpoLAI固定化酶活力呈現(xiàn)減小趨勢。

2.6 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)

Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表4，各因素顯著性檢驗(yàn)結(jié)果見表5。結(jié)果顯示，殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 戊二醛體積分?jǐn)?shù)及游離酶用量對PpoLAI固定化的影響較大，顯著性水平Plt;0.05。殼聚糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)和游離酶用量的回歸參數(shù)的顯著性檢驗(yàn)T值大于0，說明這2個因素對PpoLAI固定化效果具有正效應(yīng)；而戊二醛體積分?jǐn)?shù)的T值小于0，說明戊二醛體積分?jǐn)?shù)對PpoLAI固定化效應(yīng)具有負(fù)效應(yīng)。

2.7 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)

最陡爬坡實(shí)驗(yàn)是確定響應(yīng)面分析的中心， 能夠確定步長。 最陡爬坡實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表6。 結(jié)果顯示， 殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、 戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為3.5%、 游離酶用量為0.9 mg/g的組合的PpoLAI酶活力最大。

2.8 響應(yīng)面分析

2.8.1 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)

Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計及PpoLAI固定化酶活結(jié)果如表7所示。

2.8.2 BBD實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在Design Expert 8.0軟件中對BBD試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多重回歸方差分析，得到影響固定化效率的二次回歸方程： Y=0.68-0.04X1+0.018X2+0.028X3-0.028X1X2-1.25×10-3X1X3-1.5×10-3X2X3-0.1X21-0.092X22-0.044X23，其中Y為相對酶活力， X1、 X2和X3分別為殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)、 戊二醛的體積分?jǐn)?shù)及游離酶用量）。 對該模型進(jìn)行回歸方程方差分析，該模型在原假設(shè)為真時獲得檢驗(yàn)統(tǒng)計量的觀測值及更不支持原假設(shè)的其他值的概率p=0.009＜0.01，說明該模型具有顯著性；失擬項(xiàng)的p=0.631 7＞0.05， 即失擬項(xiàng)不具有顯著性。模型的決定系數(shù)R2為0.981 8，調(diào)整后的R2adj為0.958 5，說明該模型擬合程度良好，可信度高。

2.8.3 三維曲面響應(yīng)及驗(yàn)證

圖9所示的三維響應(yīng)曲面圖能反映2個因素之間的交互關(guān)系。 利用回歸模型預(yù)測最優(yōu)條件為：殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，戊二醛的體積分?jǐn)?shù)為3%，游離酶用量為0.9 mg/g。在此條件下進(jìn)行3次平行實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證相對酶活力平均值為0.821，與相對酶活力預(yù)測值0.862 7接近，說明該模型可信度較高，對PpoLAI固定化具有一定的指導(dǎo)意義。在此條件下，計算固定化酶的固定化率為80.12%，固定化PpoLAI轉(zhuǎn)化D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率為56.8%，稍高于PpoLAI游離酶對D-半乳糖的轉(zhuǎn)化率，說明固定化PpoLAI的過程有利于D-半乳糖的異構(gòu)化。

2.9 固定化酶與游離酶的酶學(xué)性質(zhì)對比

2.9.1 最適pH及pH穩(wěn)定性

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適pH均在偏堿性范圍［10］。 圖10為固定化PpoLAI與游離酶的最適pH與pH穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 由圖可看出， 固定化PpoLAI與游離酶的最適pH均為7.0， 說明固定化過程并沒有改變PpoLAI的最適反應(yīng)pH。 在pH=4.0～10.0條件下保溫24 h后， 固定化PpoLAI的殘留酶活力均高于相同pH條件下的游離酶的酶活力， 說明固定化的過程提高了PpoLAI的酸穩(wěn)定性。

2.9.2 最適溫度及溫度穩(wěn)定性

固定化PpoLAI與游離酶的最適溫度與溫度穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖11。結(jié)果顯示，PpoLAI在游離狀態(tài)與固定化狀態(tài)的最適反應(yīng)溫度均為50 ℃，說明固定化并沒有改變PpoLAI的最適反應(yīng)溫度，與文獻(xiàn)［10］報道的大部分L-阿拉伯糖異構(gòu)酶的最適溫度都小于60 ℃的結(jié)果相符。

將游離狀態(tài)的PpoLAI與固定化PpoLAI分別在50～70 ℃條件下分別孵育0～60 min，檢測其殘留酶活力， 結(jié)果如圖12所示?？梢钥闯?， 在設(shè)定溫度下固定化酶的殘余酶活力均高于游離酶的酶活力，說明固定化過程大幅提升了PpoLAI的熱穩(wěn)定性。熱穩(wěn)定性是決定酶促反應(yīng)速度和轉(zhuǎn)化率的關(guān)鍵因素之一，固定化PpoLAI的熱穩(wěn)定性提高，使其具有在工業(yè)生產(chǎn)過程中應(yīng)用的潛力。

2.9.3 固定化酶與游離酶的儲存穩(wěn)定性

將游離狀態(tài)的PpoLAI與固定化后PpoLAI放置于4 ℃環(huán)境保存， 每隔2 d 分別測定酶活力， 結(jié)果如圖13所示。 由圖可見， 固定化酶保存14 d后仍能夠保留50%以上的酶活力， 游離狀態(tài)的PpoLAI僅能保留10%左右， 因此， 固定化PpoLAI的儲存穩(wěn)定性比游離狀態(tài)的有所提升， 有利于其在工業(yè)上的應(yīng)用。

2.9.4 固定化酶重復(fù)使用

可重復(fù)使用和與產(chǎn)物分離容易，是固定化酶最具有工業(yè)應(yīng)用潛力的2個優(yōu)勢。本文中對固定化PpoLAI進(jìn)行重復(fù)使用實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖14所示。結(jié)果顯示，重復(fù)使用7次后，固定化PpoLAI仍能保留約40%酶活力，該結(jié)果對于PpoLAI的工業(yè)應(yīng)用具有一定的意義。

3 結(jié)論

L-阿拉伯糖異構(gòu)酶在D-塔格糖的制備中發(fā)揮重要作用。本文中從多粘類芽孢桿菌中成功克隆表達(dá)一個新的L-阿拉伯糖異構(gòu)酶PpoLAI，并對其誘導(dǎo)條件進(jìn)行優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了PpoLAI在大腸桿菌中的穩(wěn)定高效表達(dá)。對重組PpoLAI的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)Mn2+作為PpoLAI的強(qiáng)效激活劑，當(dāng)Mn2+的濃度為0.8 mmol/L時，PpoLAI的酶活性最高。將PpoLAI以戊二醛為交聯(lián)劑在殼聚糖基質(zhì)上進(jìn)行固定，響應(yīng)面分析確定了優(yōu)化的固定化條件，即殼聚糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，戊二醛的體積分?jǐn)?shù)3%，游離酶用量為0.9 mg/g，吸附溫度為25 ℃，吸附時間為4 h。固定化PpoLAI的熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性提升，并可重復(fù)使用，具有優(yōu)異的工業(yè)應(yīng)用潛力。

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