高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鯉魚中硝基呋喃類代謝物的不確定度評(píng)估

摘要：為應(yīng)對(duì)自治區(qū)水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物殘留檢測(cè)的能力驗(yàn)證工作，保證基于國標(biāo)方法的科學(xué)準(zhǔn)確。通過建立數(shù)學(xué)模型對(duì)鯉魚中硝基呋喃類代謝物含量進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)對(duì)不確定度進(jìn)行評(píng)估。結(jié)果表明在6類主要不確定來源分量當(dāng)中，隨機(jī)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和加標(biāo)回收為本實(shí)驗(yàn)不確定度的主要來源。經(jīng)評(píng)定在K=2情況下鯉魚中硝基呋喃類代謝物檢測(cè)含量為：AHD（5.157±0.631 0 μg/kg），AMOZ（4.813±0.487 7 μg/kg），AOZ（5.165±0.615 9 μg/kg），SEM（4.974±0.761 6 μg/kg）。

關(guān)鍵詞：高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；硝基呋喃類代謝物；鯉魚；不確定度

中圖分類號(hào)：TS207 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

作者簡(jiǎn)介：王佳琪（1992—），男，工程師，碩士，研究方向：農(nóng)畜水產(chǎn)品藥物殘留檢測(cè)。E-mail：1396531031@qq.com

*通訊作者：李劍軍（1966—），男，研究員。E-mail：624062376@qq.com

本文研究對(duì)象為4種硝基呋喃類代謝物，具體包括3-氨基-2-噁唑烷基酮（3-amino-2-oxazolidinone，AOZ）、5-嗎啉甲基3-氨基-2-噁唑烷基酮（5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidinone，AMOZ）、1-氨基-2-內(nèi)酰脲（1-aminohydantoin，AHD）和氨基脲（semicarbazide，SEM），它們作為一類人工合成的廣譜類抗菌藥物被廣泛用于飼料添加和水產(chǎn)養(yǎng)殖過程中^［1］。但是眾多研究表明，該類藥物具有非常強(qiáng)的致畸、致癌、致突變等毒副作用^［2］，并且由于其在環(huán)境和機(jī)體內(nèi)半衰期長(zhǎng)的特點(diǎn)^［3-6］，不僅對(duì)自然環(huán)境有害，并且嚴(yán)重威脅人類健康。因此，歐盟、日本和中國已經(jīng)將硝基呋喃類代謝物作為禁用藥物被禁止使用，并將該類藥物作為動(dòng)物源食品必檢項(xiàng)目列入檢測(cè)計(jì)劃。

硝基呋喃藥物原體極不穩(wěn)定，在機(jī)體中通常短時(shí)間內(nèi)被代謝，無法被及時(shí)采集并檢測(cè)，但其代謝物能夠與蛋白質(zhì)穩(wěn)定結(jié)合。因此，檢測(cè)硝基呋喃類代謝物可以間接代表硝基呋喃類原藥的殘留狀況^［7］。當(dāng)前，液相色譜（LC）和液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法，作為比較常規(guī)的檢測(cè)硝基呋喃類代謝物的檢測(cè)手段，在基層檢測(cè)站和市縣級(jí)檢測(cè)中心應(yīng)用非常普遍，但由于質(zhì)譜法定性定量更準(zhǔn)確、檢出限更低而成為該類藥物主流的檢測(cè)方法。不確定度通常用來衡量檢測(cè)過程中由于測(cè)量誤差的存在，造成的與被測(cè)量真實(shí)值之間的偏離程度，這種偏離程度一般用量值范圍來表示，通過這種方式來真實(shí)的反映被測(cè)量值的可信度。在檢測(cè)過程中不確定度會(huì)存在于每一個(gè)實(shí)驗(yàn)步驟和所使用的實(shí)驗(yàn)材料當(dāng)中。因此，評(píng)估不確定度對(duì)于提高檢測(cè)結(jié)果可信度，以及檢測(cè)數(shù)值的判定具有現(xiàn)實(shí)意義。本文利用《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》（JJF 1059.1—2012）對(duì)基于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 水產(chǎn)品中硝基呋喃類代謝物多殘留的測(cè)定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》（GB 31656.13—2021）的優(yōu)化方法，在鯉魚硝基呋喃類代謝物殘留檢測(cè)的過程中進(jìn)行不確定度的評(píng)定，旨在明確不確定度的主要來源，并在接下來自治區(qū)水產(chǎn)中硝基呋喃類代謝物藥物殘留檢測(cè)（盲樣考核）的檢測(cè)流程中有目的的降低有關(guān)不確定度的影響，從而保證檢測(cè)結(jié)果的可靠性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

Agilent 1290-6470三重四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）；3-18KS低溫高速離心機(jī)（德國Sigma Laborzentrifugen 公司）；IKA HS 260 basic型震蕩儀（德國IKA公司）；IKA MS 3 basic渦旋震蕩儀（德國IKA公司）；N-EVAP 116氮吹儀（美國Organomation公司）；TD-C系列電子天平（天津天馬衡基儀器有限公司）；FiveEasy Plus FP20酸度計(jì)［梅特勒托利多科技（中國）有限公司］。

乙腈、甲醇、甲酸（色譜純，北京邁瑞達(dá)科技有限公司）；純化水為屈臣氏蒸餾水（屈臣氏商標(biāo)有限公司）；0.22 μm微孔濾膜（上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司）。

乙腈中4種硝基呋喃類代謝物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）、甲醇中4種硝基呋喃類代謝物內(nèi)標(biāo)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100 mg/L）含量均≥98.0%（購自天津阿爾塔科技有限公司）

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 前處理過程

取鯉魚背部肌肉500 g用組織勻漿機(jī)充分勻漿，于自封袋中-18 ℃避光保存。取2 g勻漿組織（精確到±0.01 g）于50 mL離心管中加入100 μg/L的內(nèi)標(biāo)工作液50 μL，渦勻，加入5 mL鹽酸溶液（0.5 mol/L）和150 μL的2-硝基苯甲醛溶液（0.05 mol/L），渦勻1 min，置于恒溫振蕩器中，37 ℃震蕩16 h。

離心管冷卻到室溫后，用磷酸氫二鉀溶液（1.0 mol/L）調(diào)節(jié)pH至7.0～7.5，再加入乙酸乙酯10 mL，渦勻2 min，10000 r/min離心5 min，準(zhǔn)確分取5 mL上層有機(jī)相于玻璃管中，40 ℃水浴氮?dú)獯蹈?，?.0 mL的甲醇溶液（5%）溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至1.5 mL離心管中，在4 ℃冰箱或離心機(jī)中冷藏2 h，14000 r/min離心10 min，取上清液過0.22 um濾膜，上機(jī)測(cè)試。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的配制

標(biāo)準(zhǔn)品母液的濃度為100 mg/L，稀釋溶劑為色譜級(jí)甲醇，量取量具為1 mL的A級(jí)移液管，定容量具為10 mL棕色容量瓶，保存溫度為-18 ℃。標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液、中間液和工作液的配制情況詳見表1，標(biāo)準(zhǔn)品工作液現(xiàn)用現(xiàn)配。

分別準(zhǔn)確量取適量0.1 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液1和0.01 mg/L混合標(biāo)準(zhǔn)工作液2于10 mL容量瓶中，按照1.2.1前處理流程操作，制得終濃度分別為0.5 μg/L、1.0 μg/L、2.0 μg/L、5.0 μg/L和10.0 μg/L的標(biāo)準(zhǔn)曲線，以內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，詳見表2。

1.2.3 液相色譜條件

色譜柱：InfinityLab Proroshell 120 EC-C18柱（2.1 mm×50 mm×1.9 μm），流速0.300 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，柱溫30.0 ℃，流動(dòng)相A：0.05%甲酸水，B：乙腈。梯度洗脫程序見表3。

1.2.4 質(zhì)譜條件

配備Agilent Jet Streat的電噴霧離子源（Electrospray ionization，ESI）。目標(biāo)物質(zhì)在正離子條件下，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式（DMRM）下采集參數(shù)，離子源條件、目標(biāo)化合物質(zhì)譜相關(guān)參數(shù)見表4、表5。

1.3 不確定度數(shù)學(xué)模型的建立

測(cè)定鯉魚中硝基呋喃類代謝物含量的數(shù)學(xué)模型為：

X=ρ×V₁×V₃×1000V₂×m×1000（1）

式中：X為試樣中硝基呋喃類代謝物的含量（μg/kg）；ρ為試樣中硝基呋喃類代謝物按內(nèi)標(biāo)法在標(biāo)準(zhǔn)曲線中對(duì)應(yīng)的質(zhì)量濃度（μg/L）；V₁為提取液體積（mL）；V₂為用于濃縮的提取液體積（mL）；V₃為試樣最終定容體積（mL）；m為試樣稱樣質(zhì)量（g）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度來源分析

根據(jù)本文實(shí)驗(yàn)方法以及建立的數(shù)學(xué)模型，通過高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鯉魚中硝基呋喃類代謝物殘留的不確定度主要來源于：（1）隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度u_rel（X）；（2）稱樣量引起的不確定度u_rel（m）；（3）標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度u_rel（curev）；（4）標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的不確定度u_rel（c）；（5）樣品定容引起的不確定度u_rel（V）；（6）加標(biāo)回收引入的不確定度u_rel（Rec）。

2.1.1 隨機(jī)效應(yīng)引入的不確定度

在前處理包括制樣過程中的樣品均勻度、提取液和定容液的純度等一系列因素引入的不確定度，我們用平行測(cè)定6次陽性添加樣品（n=6），結(jié)果帶入貝塞爾公式進(jìn)行計(jì)算得到相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，結(jié)果見表6。

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差計(jì)算公式為：s（X）=∑ni=1（X_i－）²n－1（2）

標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式：u（X）=s（X）n（3）

相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式：u_rel（X）=u（X）（4）

2.1.2 稱量樣品引入的不確定度

本實(shí)驗(yàn)室稱量樣品使用百分之一電子天平，根據(jù)檢定校準(zhǔn)說明書最大允許誤差為±0.01 g，取矩形分布k值為3，樣品量平均為2.00 g。稱量樣品過程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：u_rel（m）=0.013×2.00=0.002888。

2.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)曲線采用最小二乘法擬合，設(shè)置5個(gè)濃度梯度，以外標(biāo)響應(yīng)值和內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值Y_i為縱坐標(biāo)，目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，擬合得到各物質(zhì)的線性回歸方程，格式為Y=aX+b。4種目標(biāo)物的擬合曲線分別為：Y_AMOZ=1.409477X+0.004292、Y_SEM=0.762324X+0.005781、Y_AHD=1.606327X－0.005755、Y_AOZ=1.417558X+0.0001549。擬合曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)差能夠表示被測(cè)量估計(jì)值的分散性^［8］。標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合信息和計(jì)算結(jié)果見表7、表8。

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的不確定度計(jì)算公式為：

u（curve）=s_Ra×（_YQ－_STD）²∑5j=1（X_j－_STD）²+1n+1P（5）

殘余標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算公式為：

s_R=∑nj=1［Y_j－（b+aX_j）］²n－2（6）

標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合產(chǎn)生的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

u_rel（curve）=u（curve）_YQ（7）

式中，a為斜率，b為截距；s_R為擬合曲線的殘余標(biāo)準(zhǔn)差；u（curve）為標(biāo)準(zhǔn)不確定度；Y_j為第j個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度外標(biāo)響應(yīng)值比內(nèi)標(biāo)響應(yīng)值的比值；n為標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)個(gè)數(shù)；P為樣品重復(fù)測(cè)定次數(shù)；X_j為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度；_STD為標(biāo)準(zhǔn)曲線各點(diǎn)濃度的平均值；_YQ為測(cè)定樣品平均濃度。

2.1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制引入的不確定度主要來源于4種硝基呋喃類代謝物及其內(nèi)標(biāo)物的純度、標(biāo)準(zhǔn)品定容和稀釋。

2.1.4.1 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度（P）引入的不確定度

4種硝基呋喃類代謝物及其內(nèi)標(biāo)物相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

u（P_ESTD/ISTD）=UP×3（8）

4種硝基呋喃類代謝物及其內(nèi)標(biāo)物合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度計(jì)算公式為：

u_rel（P_i）=u（P_ESTD）²+u（P_ISTD）²（9）

由標(biāo)準(zhǔn)溶液使用說明書查詢相關(guān)信息帶入計(jì)算公式，取矩形分布k值為3，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度引入的不確定度結(jié)果見表9。

2.1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)品定容引入的不確定度

標(biāo)準(zhǔn)品定容使用A級(jí)1.00 mL的移液管和10 mL的容量瓶。因此，該步驟引入的不確定度主要是定容液的膨脹因素和容量瓶的允許誤差。根據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》JJF 1059.1—2012和《常用玻璃量器》JJG 196—2006要求。10 mL的容量瓶允許誤差為±0.02 mL，取矩形分布k值為3。該項(xiàng)引入的不確定度為：u（V_p1）=0.023=0.01155。

本實(shí)驗(yàn)條件下實(shí)驗(yàn)室溫度在18～23 ℃浮動(dòng)，定容液甲醇在該溫度范圍體積膨脹系數(shù)為1.2×10^-3/℃，均勻分布下k值為3，由膨脹因素引入的不確定度為：

u（V_p2）=1.2×10^－3×5×103=0.03464。

綜上所述，容量瓶引入的相對(duì)合成不確定度為：

u_rel（STD₁）=u（V_p1）²+u（V_P2）²10=0.001275。

A級(jí)1.00 mL的移液管允許誤差為±0.008 mL，在上述實(shí)驗(yàn)溫度下，定容液為甲醇，考慮體積膨脹系數(shù)，取均勻分布k值為3，標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u（V_P3）=0.0083=0.004619

u（V_P4）=1.00×5×1.2×10^－33=0.003464。

移液管相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u_rel（STD₂）=u（V_P3）²+u（V_P4）²1.00=0.005774。

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定容引入的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u_rel（S_v）=u_rel（STD₁）²+u_rel（STD₂）²=0.01170。

2.1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品稀釋引入的不確定度

實(shí)驗(yàn)使用的標(biāo)準(zhǔn)工作液為外標(biāo)1000 μg/L和100 μg/L，內(nèi)標(biāo)1000 μg/L，稀釋過程中使用到A級(jí)1.00 mL的移液管3次，10 mL的容量瓶3次。根據(jù)（2）中所述條件，由標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋引入的相對(duì)合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u_rel（S_d）=u_rel（STD₁）²×3+u_rel（STD₂）²×3=0.003925。

綜上所述，標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

u_rel（c）=u_rel（P_i）²+u_rel（S_v）²+u_rel（S_d）²。

2.1.5 樣品定容引起的不確定度

樣品定容使用A級(jí)1.00 mL的移液管，允許誤差為±0.008 mL，樣品定容引入的不確定度為：

u（V_P3）=0.0083=0.004619。

定容液為95%的甲醇水，樣品定容不確定度來源于溫度變化時(shí)液體體積的變化，因此僅考慮液體變化情況，用純水膨脹系數(shù)近似代替定容液膨脹系數(shù)，為2.08×10^-4/℃，實(shí)驗(yàn)室溫度變化范圍±5 ℃，取矩形分布k值為3，由膨脹因素引入的不確定度為：

u（V_p5）=1.00×5×2.08×10^－43=0.0006004。

因此，樣品定容相對(duì)合成不確定度為：

u_rel（V）=u（V_P3）²+u（V_P5）²1.00=0.000622。

2.1.6 加標(biāo)回收引入的相對(duì)不確定度

實(shí)驗(yàn)中添加濃度為5.00 μg/kg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測(cè)定6次，加標(biāo)回收相對(duì)不確定度根據(jù)貝塞爾公式計(jì)算結(jié)果見表10。公式為：

u（Rec）=S_Rec6（10）

u_rel（Rec）=u（Rec）（11）

公式中u_rel（Rec）為加標(biāo)回收引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度，為回收率平均值，S_Rec為回收率標(biāo)準(zhǔn)偏差，u（Rec）為加標(biāo)回收引入的標(biāo)準(zhǔn)不確定度。

2.2 合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度、擴(kuò)展不確定度

全過程合成不確定度計(jì)算公式如下，計(jì)算結(jié)果見表11。

u_rel（all）=u_rel（X）²+u_rel（m）²+u_rel（curve）²+u_rel（c）²+u_rel（V）²+u_rel（Rec）²

在置信率為95%時(shí)，包含因子K=2，樣品檢測(cè)結(jié)果平均值，擴(kuò)展不確定度為：

U=u_rel（all）×K×

使用本方法檢測(cè)鯉魚中4種硝基呋喃代謝物檢測(cè)結(jié)果最終報(bào)出為：AHD=5.157±0.631 0 μg/kg，AMOZ=4.813±0.487 7 μg/kg，AOZ=5.165±0.615 9 μg/kg，SEM=4.974±0.761 6 μg/kg。

3 討論與結(jié)論

本研究表明，利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定鯉魚中硝基呋喃類代謝物殘留量的實(shí)驗(yàn)過程中，隨機(jī)效應(yīng)、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制和加標(biāo)回收為本實(shí)驗(yàn)不確定度的主要來源，這一結(jié)果與楊魯群等^［9］、林功師^［10］、張惠峰等^［11］的評(píng)估結(jié)果相似。而在標(biāo)準(zhǔn)溶液配制過程中標(biāo)準(zhǔn)品純度和定容所使用的量器引入的不確定度，遠(yuǎn)高于標(biāo)準(zhǔn)品稀釋。樣品定容、標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合以及稱樣量所帶來的不確定度較小。因此，在日常檢測(cè)中可以通過購買純度更高的標(biāo)準(zhǔn)品、采購精度更高的玻璃量器或者移液器以及避免過多的逐級(jí)稀釋母液的方式來降低檢測(cè)過程中的不確定度，來保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確可靠。

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