KLK4介導(dǎo)氟誘發(fā)成釉細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制

摘要：目的 探討氟對成釉細(xì)胞中激肽釋放酶4（kallikrein-4，KLK4）表達(dá)和細(xì)胞凋亡的影響及其作用機(jī)制。方法 以不同濃度的氟化鈉（NaF）處理ALC細(xì)胞24 h、48 h，qRT-PCR和Western blotting檢測KLK4 mRNA及蛋白表達(dá)；CCK-8檢測細(xì)胞相對活力；流式細(xì)胞術(shù)、Hoechst 33342染色檢測氟對細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的影響；Western blotting檢測葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose-regulated protein 78，GRP78）、真核生物起始因子2a（eukaryotic initiation factor 2α，eIF2α）、激活轉(zhuǎn)錄因子-4（activating transcription factor 4，ATF4）、C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）的蛋白表達(dá)。結(jié)果 1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h、48 h后，與對照組（0 mmol/L NaF）相比，KLK4 mRNA和蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h、48 h后，漂浮細(xì)胞增加，其中2.0 mmol/L NaF組細(xì)胞相對活力降低，與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。NaF處理細(xì)胞24 h后，與對照組相比，0.1、1.0 mmol/L NaF組G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高（P＜0.05），2.0 mmol/L NaF組G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低（P＜0.05）；NaF處理細(xì)胞48 h后，與對照組相比，2.0 mmol/L NaF組G0/G1期細(xì)胞比例升高，G2/M期細(xì)胞比例降低（P＜0.05）。隨著NaF處理濃度的升高，亮藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，細(xì)胞凋亡率也依次升高，除了0.1 mmol/L NaF 24 h處理組外，其余氟濃度處理組細(xì)胞凋亡率與對照組相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。與對照組相比，0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h后，GRP78和p-eIF2α蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。與對照組相比，1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h，ATF4和CHOP蛋白表達(dá)升高（P＜0.05），0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h，ATF4和CHOP蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。結(jié)論 NaF可能通過上調(diào)GRP78表達(dá)，激活eIF2α/ATF4/CHOP信號通路，從而引起KLK4表達(dá)抑制，誘發(fā)ALC細(xì)胞生長異常。

關(guān)鍵詞：成釉細(xì)胞；氟；激肽釋放酶4（KLK4）；細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期；細(xì)胞凋亡

中圖分類號：R78 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

DOI：10.7652/jdyxb202406006

收稿日期：2024-06-14 修回日期：2024-09-18

基金項目：陜西省重點研發(fā)計劃項目（No. 2023-YBSF-659）；榆林市科技計劃項目（No. YF-2021-44）

Supported by the grants from Shaanxi Province Key Research and Development Program （No. 2023-YBSF-659） and Yulin Science and Technology Project （No. YF-2021-44）

通信作者：阮建平，教授，博士生導(dǎo)師. E-mail： ruanjp@xjtu.edu.cn

網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：//kns.cnki.net/kcms/detail/61.1399.R.20240929.1701.005.html （2024-09-30）

The mechanism of fluoride-induced apoptosis of ameloblasts mediated by KLK4

LIU Xiaojing¹，GAO Meili²，RUAN Jianping³

（1. Department of Stomatology， the First Hospital of Yulin， Yulin 719000; 2. Key Laboratory of Biomedical Information Engineering of Ministry of Education， School of Life Science and Technology， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710049; 3. Clinical Research Center of Shaanxi Province for Dental and Maxillofacial Diseases; Department of Preventive Dentistry， College of Stomatology， Xi’an Jiaotong University， Xi’an 710004， China）

ABSTRACT： Objective To investigate the effects of fluoride on kallikrein-4 （KLK4） and cell apoptosis as well as the possible mechanisms in ALC cells. Methods ALC cells were treated with different concentrations of fluoride for 24 and 48 hours. The effects on cell viability， cell cycle and cell apoptosis were detected using CCK-8， flow cytometry and hoechst 33342， respectively. KLK4 expression was detected by qRT-PCR and Western blotting， and the protein expressions of glucose-regulated protein 78 （GRP78）， p-eukaryotic initiation factor 2α （eIF2α）， activating transcription factor 4 （ATF4）， and C/EBP homologous protein （CHOP） were detected by Western blotting. Results The results showed that the expression of KLK4 was significantly reduced after treatment with 1.0 and 2.0 mmol/L NaF for 24 and 48 hours （P＜0.05）. The difference was statistically significant in cell activity between 2.0 mmol/L NaF treatment group and the control group （P＜0.05）. The G0/G1 phase cells significantly reduced and the S phase cells significantly increased after treatment with 0.1 and 1.0 mmol/L NaF for 24 hours （P＜0.05）， while the G0/G1 phase cells significantly increased and the S phase cells significantly reduced in the 2.0 mmol/L NaF treatment cells （P＜0.05）. The G0/G1 phase cells significantly increased and G2/M phase cells significantly reduced after treatment with 2.0 mmol/L NaF for 48 hours （P＜0.05）. With the increase of NaF treatment concentration， the number of bright blue cells gradually increased， and the percentage of apoptosis also increased successively. Except for the cells treated with 0.1 mmol/L NaF for 24 hours， the apoptosis rate of the other fluoride treatment groups was statistically significant compared with the control group （P＜0.05）. The expressions of GRP78 and p-eIF2α were significantly increased after treatment with 0.1， 1.0， and 2.0 mmol/L NaF for 24 hours （P＜0.05）. The expressions of ATF4 and CHOP were significantly increased after treatment with 1.0 and 2.0 mmol/L NaF for 24 hours （P＜0.05）. The expressions of ATF4 and CHOP were significantly increased after treatment with 0.1， 1.0， and 2.0 mmol/L NaF for 48 hours （P＜0.05）. Conclusion Sodium fluoride may result in

inhibition of KLK4 expression and abnormal cell growth， possibly by inducing GRP78 expression and activating eIF2α/ATF4/CHOP signaling pathway in ALC ameloblasts.

KEY WORDS： ameloblast; fluoride; kallikrein-4 （KLK4）; cell proliferation; cell cycle; cell apoptosis

氟牙癥是牙齒在發(fā)育過程中機(jī)體攝入過量的氟導(dǎo)致的牙釉質(zhì)礦化和發(fā)育異常^［1］。氟主要損傷釉質(zhì)發(fā)育期的成釉細(xì)胞^［2］。成釉細(xì)胞在釉質(zhì)形成過程中起著關(guān)鍵的作用，它通過合成、分泌、吸收和降解釉基質(zhì)蛋白來調(diào)控釉質(zhì)礦化^［3］。激肽釋放酶4（KLK4）是一種糖基化的糜蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶，由成熟期成釉細(xì)胞分泌和表達(dá)，KLK4在釉質(zhì)成熟過程中降解釉基質(zhì)蛋白以形成完全礦化的成熟釉質(zhì)^［4-5］。在小鼠中敲除KLK4后導(dǎo)致釉質(zhì)硬度降低，蛋白含量高于正常值^［6］。據(jù)報道，在氟化鈉（NaF）處理 LS8細(xì)胞后，叉頭轉(zhuǎn)錄因子O1（forkhead transcription factor，F(xiàn)oxO1）激活使KLK4上調(diào)，F(xiàn)oxO1基因敲除降低了KLK4的mRNA表達(dá)，與NaF聯(lián)合使用時，對KLK4的抑制作用增強(qiáng)，而成釉細(xì)胞內(nèi)FOXO1缺失導(dǎo)致形成的釉質(zhì)礦化程度降低^［7］。

研究氟對成釉細(xì)胞中KLK4的影響及作用機(jī)制有助于揭示氟牙癥的發(fā)病機(jī)制，尋找新的治療靶點和策略。因此，本研究采用不同濃度的氟作用于體外培養(yǎng)的成釉細(xì)胞株ALC細(xì)胞，分析氟對ALC細(xì)胞中KLK4表達(dá)的影響，檢測對細(xì)胞活性、細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響并分析其可能的作用機(jī)制，以期為進(jìn)一步探討氟牙癥的治療提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

成釉細(xì)胞株ALC細(xì)胞由濱州醫(yī)學(xué)院高玉光教授饋贈。NaF（天津市天力化學(xué)試劑有限公司）；高糖DMEM培養(yǎng)基（SH30243.01，美國Hyclone公司）；胎牛血清（04-001-1ACS，以色列BI公司）；Hoechst 33342試劑盒（C1027，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；CCK-8試劑盒（BS350A，Biosharp生物科技有限公司）；細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、細(xì)胞周期檢測試劑盒（KGA105、KGA511，江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；β-actin抗體、ATF4抗體、CHOP抗體（20536-1-AP、10835-1-AP、15204-1-AP，武漢三鷹生物技術(shù)有限公司）；KLK4抗體、GRP78抗體（ab231048、ab21685，英國Abcam公司）；p-eIF2α（#3398，美國CST公司）；HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體（bs-0295G-HRP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37 ℃、50 mL/L CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)ALC細(xì)胞。細(xì)胞融合到培養(yǎng)皿的80%時，2.5 g/L胰酶消化細(xì)胞，傳代培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，加入含有不同濃度NaF（0、0.1、1.0、2.0 mmol/L）培養(yǎng)液，分別干預(yù)24 h、48 h后，光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3 CCK-8檢測細(xì)胞活力

將ALC細(xì)胞以2 × 10³個/孔接種于96孔板中，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，吸出舊培養(yǎng)液，每孔中加入含有不同濃度NaF（0、0.01、0.1、1.0、2.0 mmol/L）培養(yǎng)液100 μL，培養(yǎng)24 h、48 h后，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培養(yǎng)箱中孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測450 nm波長處吸光度值。

1.4 Hoechst 33342染色

將ALC細(xì)胞以3 × 10⁵個/mL接種于6孔板中，待細(xì)胞貼壁穩(wěn)定后，吸棄舊培養(yǎng)液，每孔中加入含有不同濃度NaF（0、0.1、1.0、2.0 mmol/L）培養(yǎng)液2 mL，培養(yǎng)24 h、48 h后，吸出舊培養(yǎng)液，加入Hoechst 33342染料，使其終質(zhì)量濃度為5 μg/mL，培養(yǎng)箱中避光染色15 min。吸棄染液，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核型變化。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期

細(xì)胞加藥處理同1.4項。培養(yǎng)24 h、48 h后，消化收集細(xì)胞到1.5 mL離心管中，離心，棄上清液，重懸細(xì)胞于0.2 mL PBS中，加入0.8 mL 70%的預(yù)冷乙醇，4 ℃固定過夜。檢測前，棄乙醇，每個離心管中加入RNA酶（50 μg/mL）和碘化丙啶PI染料（50 μg/mL）混合液500 μL，避光染色30 min。流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞DNA含量變化，記錄細(xì)胞周期各時相的比例。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡

細(xì)胞加藥處理同1.4項。培養(yǎng)24 h、48 h后，消化收集細(xì)胞，4 ℃、1 000 r/min，離心5 min棄上清，Binding Buffer液重懸細(xì)胞，分別加入Annexin V-FITC和PI染液各5 μL，混合均勻，避光染色10 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

1.7 qRT-PCR檢測KLK4 mRNA表達(dá)

Trizol法提取細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作將RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，qRT-PCR檢測KLK4基因表達(dá)變化，以β-actin作為內(nèi)參基因，采用2^-ΔΔCT法計算目的基因的相對表達(dá)量，引物序列見表1。

提取細(xì)胞總蛋白，BCA法進(jìn)行蛋白定量。蛋白等量上樣、SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、50 mL/L的脫脂牛奶封閉。分別加入一抗工作液KLK4（1∶500）、GRP78（1∶1 000）、p-eIF2α（1∶1 000）、ATF4（1∶1 000）、CHOP（1∶1 000），4 ℃慢速搖床孵育過夜，洗膜3次，加入二抗工作液（1∶5 000），室溫孵育2 h，將膜放入ECL顯色液中，發(fā)光顯影，采用Quantity One軟件分析灰度值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；不同時間點的組間比較采用重復(fù)測量方差分析。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 氟對ALC細(xì)胞中KLK4 mRNA和蛋白表達(dá)的影響

不同濃度 NaF處理ALC細(xì)胞24 h、48 h后，各組間KLK4 mRNA表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=26.2，P=0.000 2；F=30.14，P=0.000 1）。組間兩兩比較結(jié)果見圖1A、1C，與對照組相比，1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h、48 h后，KLK4 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，與24 h組相比，0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，KLK4 mRNA表達(dá)降低（P＜0.05）。

不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞24 h、48 h后，各組間KLK4蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=38.15，P=0.002；F=25.27，P=0.005）。組間兩兩比較結(jié)果見圖1B、1D，與對照組相比，0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h后，KLK4 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）；1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，KLK4蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，與24 h組相比，0.1 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，KLK4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

2.2 氟對ALC細(xì)胞形態(tài)及細(xì)胞活力的影響

2.2.1 氟對ALC細(xì)胞形態(tài)的影響

不同濃度的NaF處理ALC細(xì)胞，觀察細(xì)胞形態(tài)變化（圖2）。正常ALC細(xì)胞呈“鋪路石”狀，橢圓形或多邊形，成簇排列，彼此緊密相連。隨著氟濃度的增加，ALC細(xì)胞形態(tài)無明顯改變，但1.0、2.0 mmol/L NaF處理組中，漂浮細(xì)胞增加，說明氟處理導(dǎo)致ALC細(xì)胞黏附性降低，細(xì)胞狀態(tài)受到一定的影響。

2.2.2 氟對ALC細(xì)胞活力的影響

不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞24 h、48 h后，各組間細(xì)胞相對活力差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=7.54，P=0.005；F=14.34，P=0.000 4）。組間兩兩比較結(jié)果見圖3，與0、0.01、0.1、1.0 mmol/L NaF組相比，2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h和48 h后，細(xì)胞相對活力均降低（P＜0.05）。與對照組相比，1.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞相對活力降低（P＜0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，在24 h和48 h，細(xì)胞相對活力差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 氟對ALC細(xì)胞周期的影響

細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)密切相關(guān)，因此進(jìn)一步檢測了不同濃度氟處理后對ALC細(xì)胞周期的影響，見圖4。結(jié)果顯示，NaF處理細(xì)胞24 h后，與對照組相比，0.1、1.0 mmol/L NaF組G0/G1期細(xì)胞比例降低，S期細(xì)胞比例升高（P＜0.05），2.0 mmol/L NaF組G0/G1期細(xì)胞比例升高，S期細(xì)胞比例降低（P＜0.05）。NaF處理細(xì)胞48 h后，與對照組相比，2.0 mmol/L NaF組G0/G1期細(xì)胞比例升高，G2/M期細(xì)胞比例降低（P＜0.05）。這些結(jié)果表明不同濃度的氟將細(xì)胞阻滯在不同的時期，使細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)異常。

2.4 氟對ALC細(xì)胞凋亡的影響

2.4.1 Hoechst 33342染色對細(xì)胞核的影響分析

不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞，Hoechst 33342染色觀察氟對細(xì)胞凋亡的影響，見圖5。結(jié)果顯示，隨著氟處理濃度的增大，出現(xiàn)亮藍(lán)色的細(xì)胞數(shù)量逐漸增多，在1.0、2.0 mmol/L NaF 48 h處理組更明顯，可觀察到細(xì)胞核碎塊狀染色，說明氟促使ALC細(xì)胞發(fā)生凋亡，且隨著濃度的增大，促凋亡效果越明顯，并且具有一定的時間依賴性。

2.4.2 Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡分析

不同濃度 NaF處理ALC細(xì)胞24 h、48 h 后，各組間細(xì)胞凋亡率差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=10.39，P=0.004；F =13.13，P=0.002）。組間兩兩比較結(jié)果見圖6，與對照組相比，1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h后，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）；0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，細(xì)胞凋亡率升高（P＜0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，在24 h和48 h，細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5 氟對ALC細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激分子GRP78蛋白表達(dá)的影響

KLK4表達(dá)的異常與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)密切相關(guān)，GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)志性分子，因此進(jìn)一步分析了GRP78蛋白表達(dá)。不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞24 h后，各組間GRP78蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=38.53，P=0.002）。組間兩兩比較結(jié)果見圖7，與對照組相比，0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h后，GRP78蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；不同濃度 NaF處理ALC細(xì)胞48 h后，各組間GRP78蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，與24 h組相比，0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，GRP78蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

2.6 氟對ALC細(xì)胞中eIF2α/ATF4/CHOP信號通路的影響

為了探索氟處理對細(xì)胞凋亡影響的機(jī)制，進(jìn)一步分析了NaF對ALC細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號通路eIF2α/ATF4/CHOP的影響。不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞24 h后，各組間p-eIF2α蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=34.69，P=0.003）。組間兩兩比較結(jié)果見圖8A，與對照組相比，0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h后，p-eIF2α蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞48 h后，各組間p-eIF2α蛋白表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，與24 h組相比，0、0.1、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，p-eIF2α蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。

不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞24 h和48 h后，各組間ATF4蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=55.23，P=0.001；F=98.00，P=0.0003）。組間兩兩比較結(jié)果見圖8B，與對照組相比，1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h后，ATF4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，ATF4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，與24 h組相比，0.1 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，ATF4蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，ATF4蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

不同濃度NaF處理ALC細(xì)胞24 h后，各組間CHOP蛋白表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=52.66，P=0.001；F=41.96，P=0.002）。組間兩兩比較結(jié)果見圖8C，與對照組相比，1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞24 h后，CHOP蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）；0.1、1.0、2.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，CHOP蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。同一濃度NaF處理ALC細(xì)胞，與24 h組相比，0、1.0 mmol/L NaF處理細(xì)胞48 h后，CHOP蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。

3 討 論

釉質(zhì)發(fā)生始于釉基質(zhì)蛋白的分泌，這些蛋白質(zhì)共同形成有機(jī)基質(zhì)，組成釉質(zhì)的羥基磷灰石晶體，一旦晶體達(dá)到完整長度，成釉細(xì)胞進(jìn)入成熟階段，分泌KLK4以降解釉基質(zhì)蛋白，并被成釉細(xì)胞再吸收和清除，最終形成完全礦化成熟的釉質(zhì)^［8-9］。KLK家族表達(dá)失調(diào)和/或異常激活在各種生理、病理過程中起著重要作用，成為多種疾病發(fā)生的標(biāo)志物，其中KLK4異常是牙釉質(zhì)發(fā)育不全的標(biāo)志^［10］。KLK4表達(dá)降低影響釉基質(zhì)蛋白的降解，使其無法從硬化的牙釉質(zhì)中清除，導(dǎo)致釉質(zhì)發(fā)育不全^［6］。本研究結(jié)果顯示，NaF處理后ALC細(xì)胞中KLK4的表達(dá)顯著降低，提示可能通過影響成釉細(xì)胞功能，進(jìn)而使釉質(zhì)的發(fā)育受到影響。

氟牙癥是過量氟化物致釉質(zhì)礦化不足所造成的，而釉質(zhì)的礦化是由成釉細(xì)胞調(diào)控^［11］。本研究結(jié)果顯示，低濃度氟處理ALC細(xì)胞后細(xì)胞活力有所增加，隨著氟濃度的升高細(xì)胞活力明顯下降，細(xì)胞趨于變圓，漂浮細(xì)胞增多，提示過量氟對成釉細(xì)胞的增殖具有抑制效應(yīng)。氟對LS8細(xì)胞、大鼠HAT-7成釉細(xì)胞增殖的影響結(jié)果也顯示類似的效應(yīng)^［11-12］。另有研究發(fā)現(xiàn)，氟的主要毒性效應(yīng)發(fā)生在F^-與細(xì)胞內(nèi)酶相互作用時，一般在微摩爾水平吸收F^-，有利于細(xì)胞生成，被認(rèn)為是一種有效的合成代謝劑，而在毫摩爾水平，氟化物可能抑制許多細(xì)胞酶，如維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的磷酸酶^［13］。該研究結(jié)果提示，對ALC細(xì)胞的增殖抑制可能與抑制相關(guān)的細(xì)胞酶有關(guān)。細(xì)胞增殖是通過細(xì)胞周期實現(xiàn)的，細(xì)胞周期是一系列有序的嚴(yán)格控制的分子調(diào)控過程，包括G0/G1期、S期、G2/M期。目前氟對細(xì)胞周期的影響研究主要見于對動物脾臟細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、肝臟細(xì)胞及成骨細(xì)胞的影響方面。研究發(fā)現(xiàn)，脾臟細(xì)胞的G0/G1期細(xì)胞比例顯著增加，腎細(xì)胞G2/M期細(xì)胞比例顯著增加，肝細(xì)胞S期細(xì)胞比例隨著劑量和時間的增加而增加^［14-16］。這顯示氟可誘發(fā)不同細(xì)胞周期時相阻滯，且對細(xì)胞周期運行的影響與細(xì)胞類型有關(guān)。目前關(guān)于NaF對ALC細(xì)胞周期的影響研究還未見報道。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著濃度和時間的不同，NaF對ALC細(xì)胞周期時相的影響也不同，提示氟擾亂了ALC細(xì)胞周期運行，對細(xì)胞周期的阻滯進(jìn)一步導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。細(xì)胞凋亡是維持正常組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵生物過程，如約25%的成釉細(xì)胞在分泌期后的轉(zhuǎn)化期發(fā)生凋亡，25%的成釉細(xì)胞在成熟期發(fā)生凋亡^［17］。細(xì)胞凋亡可以直接反映氟對成釉細(xì)胞的毒性作用，NaF誘發(fā)HAT-7細(xì)胞、LS8細(xì)胞發(fā)生不同程度的細(xì)胞凋亡^［18-19］。本研究結(jié)果顯示，隨著NaF處理濃度的升高，細(xì)胞凋亡率升高，呈現(xiàn)劑量依賴性，說明過量氟對ALC細(xì)胞有一定的毒性效應(yīng)。

細(xì)胞凋亡是一種受基因控制的復(fù)雜反應(yīng)過程，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）是誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的途徑之一^［20-21］。GRP78是ERS的標(biāo)志性分子，細(xì)胞在非應(yīng)激狀態(tài)時GRP78與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白肌醇跨膜激酶1（inositol-requiring transmembrane kinase 1，IRE1）、雙鏈RNA依賴性蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶（protein kinase RNA-like endoplasmic reticulum kinase，PERK）、激活轉(zhuǎn)錄因子-6（activating transcription factor-6，ATF6）結(jié)合而處于非激活狀態(tài)^［22］。細(xì)胞受到應(yīng)激反應(yīng)時GRP78與PERK等跨膜蛋白分離，釋放到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，GRP78表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而PERK信號通路中eIF2α發(fā)生磷酸化，選擇性激活A(yù)TF4，ATF4是調(diào)節(jié)ERS的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，在長時間的應(yīng)激狀態(tài)下，進(jìn)一步增加與細(xì)胞凋亡相關(guān)的C/EBP同源蛋白CHOP的募集，CHOP在ERS誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡中發(fā)揮促凋亡作用^［23-24］。Wistar大鼠經(jīng)氟化物處理后，甲狀腺組織中GRP78和CHOP表達(dá)顯著升高，顯示過量氟可引起ERS，使未折疊蛋白和錯誤折疊蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)積聚，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡^［25］。本研究結(jié)果顯示，NaF促使ALC細(xì)胞中GRP78蛋白表達(dá)顯著升高，eIF2α/ATF4/CHOP信號通路蛋白表達(dá)上調(diào)，提示氟引起成釉細(xì)胞發(fā)生ERS，eIF2α/ATF4/CHOP信號通路進(jìn)一步參與ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

綜上所述，氟可以引起KLK4表達(dá)抑制，導(dǎo)致ALC細(xì)胞生長異常，包括抑制細(xì)胞增殖、擾亂細(xì)胞周期運轉(zhuǎn)以及促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能是通過促進(jìn)GRP78表達(dá)，激活eIF2α/ATF4/CHOP信號通路從而影響牙釉質(zhì)發(fā)育。

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（編輯 張 敏）