免疫親和柱凈化柱后光化學衍生高效液相色譜-熒光檢測法同時測定制馬腎中4種黃曲霉毒素

孫艷杰　趙磊　李正剛　王路宏

【摘 要】 目的：建立免疫親和柱凈化柱后光化學衍生高效液相色譜-熒光檢測法同時測定制馬腎中黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2的含量。方法：樣品采用70％甲醇作為提取溶劑，經(jīng)免疫親和柱凈化、高效液相色譜分離、光化學柱后衍生后，通過熒光檢測器測定其中黃曲霉毒素的含量。結(jié)果：黃曲霉毒素B1的線性范圍為0.0104～0.0520 ng（r=0.999 9）、黃曲霉毒素B2的線性范圍為0.0038～0.0190 ng（r=0.999 8）、黃曲霉毒素G1的線性范圍為0.0108～0.0540 ng（r=0.999 8）、黃曲霉毒素G2的線性范圍為0.0038～0.0190 ng（r=0.9998），線性關(guān)系良好，回收率在89.68%～101.44％之間，RSD≤3.5%。結(jié)論：該方法操作簡便，靈敏度高、重復性好、結(jié)果準確，可用于制馬腎中黃曲霉毒素的測定。

【關(guān)鍵詞】 制馬腎；免疫親和柱；光化學衍生；高效液相色譜-熒光檢測器；黃曲霉毒素

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A【文章編號】1007-8517（2023）23-0019-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.23.zgmzmjyyzz202323005

Simultaneous Determination of Content of Four Aflatoxins in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by Mmunoaffinity Column Clean-up and HPLC-FLD with Post-column Photochemical Derivatization

SUN Yanjie ZHAO Lei LI Zhenggang WANG Luhong*

Siping Institute for Food and Drug Control，Siping 13600，China

Abstract：Objective To establish the contamination method of aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in EQUI PENIS ET TESTIVULUS by immunoaffinity column clean-up and HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization．Methods? After extraction with 70% Methanol and purification by immunoaffinity columns，aflatoxin B1，B2，G1 and G2 in samples were anlyzed by HPLC-FLD with post-column photochemical derivatization.Results The linearity of Aflatoxin B1 was at 0.0104-0.0520 ng（r=0.9999）， Aflatoxin B2 was at 0.0038-0.0190 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G1 was at 0.0108-0.0540 ng（r=0.9998）， Aflatoxin G2 was at 0.0038～0.0190 ng（r=0.9998）， The average recoveries were within 89.68%-101.44% with RSD≤3.5%. Conclusion The above method has demonstrated convenient operation，good repeatability，highsensitity and accuracy.This method is suitable for the determination of AF in Renshenguipi pills.

Keywords：Equi Penis Et Testivulus；Immunoaffinity Column；Photochemical Derivation；HPLC-FLD；Aflatoxi

馬腎藥材標準收載在《吉林省中藥材標準》第二冊2019版［1］，為馬科動物成年馬Equus caballus Linnaeus雄性的干燥陰莖及睪丸。制馬腎為馬腎經(jīng)過滑石粉炒，祛除其腥味，便于保存和臨床應用［2］。黃曲霉素（aflatoxins，AF）屬真菌毒素，是黃曲霉和寄生曲霉產(chǎn)生的雙呋喃環(huán)類毒素的次級代謝產(chǎn)物，以AF B1、B2、G1、G2較常見。AF的強致癌性，特別是AFB1，其毒性比氰化物、砷化物和有機農(nóng)藥等的毒性更大，已被世界衛(wèi)生組織癌癥研究機構(gòu)列為Ⅰ類致癌物質(zhì)［3-7］。黃曲霉性喜濕熱，中藥材及飲片潮濕季節(jié)，保存不當，容易造成黃曲霉毒素污染，特別是含蛋白質(zhì)，油脂類的動物類藥材更容易黃曲霉毒素超標?！吨袊幍洹?020版一部中有較多動物類藥材和飲片品種進行了AF的限量控制，如地龍、蜂房、土鱉蟲等［8-10］。經(jīng)查閱文獻，未發(fā)現(xiàn)有關(guān)于馬腎相關(guān)真菌毒素的研究報道。為保證制馬腎的用藥安全，本次研究采用檢測靈敏度較高的免疫親和柱，柱后光化學衍生，高效液相色譜-熒光檢測法同時測定制馬腎中AF B1、B2、G1、G2的含量，并進行了方法考察研究，驗證測定方法的可靠性，為臨床用藥安全提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器 BT125D型電子天平（北京賽多利斯儀器天平有限公司），Agilent LC 1260型高效液相色譜儀（配Agilent LC1260II型熒光檢測器，安捷倫科技有限公司），KRC-25型光化學柱后衍生器（青島普瑞邦生物工程有限公司），TDL-5-A型離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試驗材料 黃曲霉混合對照品溶液（AF B1、B2、G1、G2標示濃度分別為（1.04 μg/mL、0.38 μg/mL、1.08 μg/mL、0.38 μg/mL，批號：610001-202006，中國食品藥品檢定研究院）。10批制馬腎來源于炮制中式樣品。免疫親和柱（青島普瑞邦生物工程有限公司）。甲醇和乙腈（Flsher Scientific，色譜純），純化水為自制，其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液的制備

2.1.1 黃曲霉混合對照品工作溶液的制備 精密量取黃曲霉混合對照品溶液0.5 mL，置10 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，作為貯備溶液。精密量取貯備溶液1 mL，置25 mL量瓶中，用70%甲醇稀釋至刻度，即得黃曲霉混合對照品工作溶液。

2.1.2 供試品溶液的制備 取供試品約15 g（剪碎），精密稱定，置于均質(zhì)瓶中，加入氯化鈉3 g，精密加入70%甲醇溶液75 mL，12000 r/min高速攪拌2 min，4500 r/min離心5 min，精密量取上清液15 mL，置50 mL量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，4500 r/min離心10 min，精密量取續(xù)濾液10.0 mL，通過免疫親合柱，流速每分鐘3 mL，用水20 mL洗脫，洗脫液棄去，使空氣進入，將水擠出免疫親合柱，再用適量甲醇洗脫，收集洗脫液，置2 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，用微孔濾膜（0.22 μm）濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 色譜條件及測定方法 采用Agilent ZORBAX SB-C18，5 μm，250 mm×4.6 mm；流動相為：甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速為1.0 mL/min；柱溫為25 ℃；采用柱后光化學衍生法（254 nm），以熒光檢測器檢測，激發(fā)波長λex = 360 nm，發(fā)射波長λex = 450 nm。分別精密吸取“2.1.1”項下黃曲霉混合對照品工作溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。另精密吸取“2.1.2”項下供試品溶液20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，從標準曲線上讀出供試品中AF B1、B2、G1、G2的量，進行計算。AF B1、B2、G1、G2的色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，且無雜質(zhì)干擾峰。結(jié)果如圖1所示。

2.3 線性范圍和檢出限 分別精密吸取“2.1.1”項下混合對照品溶液5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積，以進樣量（ng）為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結(jié)果見表1。

取不含黃曲霉的樣品15g，加入適當稀釋的黃曲霉混合對照品溶液，同供試品溶液制備、測定，以信噪比（S/N）為3作為4種黃曲霉毒素的檢出限（limit of detection，LOD）。結(jié)果見表1。

2.4 精密度考察 取黃曲霉混合對照品工作溶液20 μL，注入液相色譜儀，按“2.2”項下色譜條件連續(xù)進樣6次，分別計算黃曲霉B1、B2、G1、G2峰面積的RSD（n=6）分別為1.15%、1.08%、1.07%、1.31%。結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗 取“2.6”項下供試品溶液，分別于0 h、4 h、8 h、16 h、18 h、24 h，按“2.2”色譜條件，進樣20 μL，記錄所測各組分峰面積，黃曲霉 B1、B2、G1、G2峰面積的RSD（n=6）分別為1.82％、2.01％、1.91％、1.93％，結(jié)果表明對照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 重復性試驗及回收率試驗 經(jīng)考察10批制馬腎中均未檢出黃曲霉B1、B2、G1、G2，故本次實驗重復性在加樣回收的6個平行試驗的同時進行考察。取不含黃曲霉的供試品粉末約15 g，各6份，精密稱定，分別置于均質(zhì)瓶中，精密加入黃曲霉混合對照品儲備液75 μL，按“2.1.2”項下操作，按“2.2”項下色譜條件測定，計算回收率。測定結(jié)果見表２。結(jié)果表明方法的重復性良好，準確度達到方法要求。

2.7 樣品測定 取10批次制馬腎樣品，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下條件進樣測定，結(jié)果均未檢出AF B1、B2、G1、G2。

3 討論

3.1 樣品提取方法考察 本實驗分別采用勻質(zhì)法和超聲提取法進行了制馬腎樣品中黃曲毒素的提取處理，結(jié)果勻質(zhì)提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為96.1%、95.2%、93.8%、94.4%，超聲提取法AF B1、B2、G1、G2平均回收率分別為90.5%、89.1%、91.1%、90.6%?；厥章蕜蛸|(zhì)法優(yōu)于超聲提取法。且樣品的提取采用勻質(zhì)法，12000 r/min 高速攪拌2 min即可完成操作，而超聲提取法需要超聲30 min，提取效率較勻質(zhì)法低。故本次采用勻質(zhì)法進行制馬腎樣品中黃曲霉毒素的提取。

3.2 色譜條件的考察 以甲醇-乙腈-水（40∶18∶42）；流速為1.0 mL/min-1；柱溫為25 ℃為色譜條件，分別考察了Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、YMC-Hydrosphere-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）、Diamonsil C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），3個不同品牌的色譜柱的測定效果。結(jié)果，AF B1、B2、G1、G2的分離度均達到2.0以上，塔板數(shù)均高于8000，表明方法的適用性較好。

3.3 黃曲霉檢測方法選擇 黃曲霉毒素有多種檢測分析方法，包括酶聯(lián)免疫吸附法、高效液相色譜-熒光法、膠體金快速定量法、實時熒光PCR方法、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等［11-13］。其中高效液相色譜-熒光法檢測應用最為廣泛。在4種黃曲霉毒素中，AF B1和G1遇水熒光猝滅，需要先進行柱后衍生化，來提高AF B1和G1的熒光強度，增強其靈敏度。柱后衍生法有碘衍生法和光化學衍生法兩種。碘衍生化法需要配制碘飽和溶液，且衍生劑有一定的腐蝕作用，也會造成基線的漂移，設備成本高。而光化學衍生操作簡便、不需要衍生劑與衍生溫度，延長檢測器壽命，購置成本低，儀器配制簡單，并且可以通過開關(guān)光化學衍生器，AF B1和G1的信號響應值變化來鑒別AF B1和G1假陽性反應，適用性更好。

本研究進行了免疫親和柱凈化柱后光化學衍生高效液相色譜-熒光檢測法同時測定中藥飲片制馬腎中AF B1、B2、G1、G2 4種黃曲霉毒素含量，并進行了方法學各項指標驗證，均滿足分析測定的要求。由于本次僅收集了10個批次樣品，雖然均未檢測出黃曲霉毒素，但馬腎為動物類藥，蛋白質(zhì)含量高，濕熱環(huán)境下非常容易感染黃曲霉毒素，存儲溫度控制不好，會存在非常大的安全風險，故對其進行AF的更多批次樣本和持續(xù)監(jiān)控檢測仍然具有非常大的意義［14-16］。

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（收稿日期：2023-03-02 編輯：劉 斌）

基金項目：吉林省地方中藥炮制規(guī)范項目（JLPZGF-2020-066）。

作者簡介：孫艷杰（1980—），女，漢族，學士，副主任藥師，研究方向為藥品質(zhì)量檢驗。E-mail：383816269@qq.com

通信作者：王路宏（1965—），女，漢族，學士，主任藥師，研究方向為藥品質(zhì)量檢驗。E-mail：517677231@qq.com