肝癌條達飲對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及機制研究

【摘要】目的 探討肝癌條達飲對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及對B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達的影響。方法 將50只無特定病原體級（SPF）雄性小鼠建立H22荷瘤小鼠模型，按隨機數(shù)字表法分成正常組、模型組及肝癌條達飲低、中、高劑量組，每組10只。對比各組小鼠腫瘤體積、平均腫瘤質(zhì)量、抑瘤率，Bax、Caspase-3、Bcl-2 mRNA及蛋白相對表達量；蘇木精 - 伊紅（HE）染色觀察各組小鼠腫瘤組織病理學變化。結(jié)果 與模型組比，肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠平均腫瘤體積均更小，平均腫瘤質(zhì)量更低，且高劑量組小鼠平均腫瘤質(zhì)量均顯著低于低、中劑量組（均Plt;0.05）；肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠抑瘤率均呈升高趨勢；與模型組比，肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均呈逐漸升高趨勢，Bcl-2 mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均呈逐漸降低趨勢，且任意兩組間經(jīng)比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05）。結(jié)論 肝癌條達飲有較好的抑制腫瘤作用，其機制可能與上調(diào)Bax、Caspase-3表達，下調(diào)Bcl-2表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】肝癌調(diào)達飲 ; 荷瘤小鼠 ; 腫瘤體積 ; 平均腫瘤質(zhì)量 ; 抑瘤率

【中圖分類號】R735.7 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-3718.2023.09.0036.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-3718.2023.09.012

以肝細胞癌為主的原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma， HCC）為常見的惡性腫瘤，該病早期不易被發(fā)現(xiàn)，病情進展迅速，一經(jīng)發(fā)現(xiàn)多數(shù)患者都處于中晚期，且病情不穩(wěn)定易復發(fā)轉(zhuǎn)移。相關(guān)研究顯示， HCC全球每年新發(fā)病例85.4萬，中國46.6萬，占比達55%，是國內(nèi)第4位常見惡性腫瘤及第2位腫瘤致死病因，嚴重影響患者生活質(zhì)量及生存率[1]。目前化療藥物在HCC的防治中未見突破，并且肝功能障礙導致藥物代謝異常，放大了化療藥物的不良反應(yīng)，甚至產(chǎn)生耐藥性[2]。 HCC屬于中醫(yī)學的“積聚”“癥瘕”“黃疸”等范疇，是由于七情內(nèi)傷、飲食勞倦，或邪毒內(nèi)侵等，致臟腑氣血虧虛，脾虛不運，氣滯、血瘀、濕熱、痰毒等互結(jié)于肝所致[3]。肝癌條達飲是江蘇省名中醫(yī)嚴冰治療肝癌的經(jīng)驗方，提出健脾扶正、清熱解毒、活血化瘀、化痰散結(jié)、利水消腫等五種治療大法，即以“健脾扶正，五法統(tǒng)一”為原則自擬的方劑，包括黃芪、蛇莓、夏枯草等中藥，但目前其應(yīng)用于肝癌的相關(guān)研究較少。因此，本研究旨在探討肝癌條達飲對H22荷瘤小鼠的抗腫瘤作用及B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3） mRNA及蛋白表達的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑、主要藥物及儀器

1.1.1 實驗動物 選擇健康雄性無特定病原體級（SPF）小鼠50只，由上海靈暢生物科技有限公司提供，合格證號：SYXK（蘇）2017-0040。動物飼養(yǎng)在SPF級動物房，溫度20～25 ℃，相對濕度50%～60%。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后開始實驗。實驗過程中對動物的處置需符合《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》 [4]中的要求。

1.1.2 試劑與主要藥物 蘇木素 - 伊紅（HE）染色試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，批號：KGA224）；TRIzol試劑盒（美國Invitrogen公司，批號：15596-026）；cDNA第一鏈合成試劑盒（立陶宛Fermentas有限公司，批號：K1622）；全蛋白抽提試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展生物有限公司，批號：KGP2100-025H01）；雙辛丁酸（BCA）蛋白含量檢測試劑盒（南京凱基生物科技發(fā)展生物有限公司，批號：KGP903-691K32）；電化學發(fā)光（ECL）檢測試劑盒（南京先一行生物技術(shù)有限公司，批號：P0018-542C）；一抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：P0023A）；二抗稀釋液（上海碧云天生物技術(shù)公司，批號：P0023D）等。肝癌條達飲由安徽亳州市永剛飲片廠有限公司提供，經(jīng)過淮安市中醫(yī)院藥學部鑒定為正品，符合2020版《中國藥典》規(guī)定，藥方組成：黃芪、蛇莓、夏枯草、澤漆、半邊蓮、石見穿各30 g，莪術(shù)15 g，白術(shù)、郁金各12 g，炙水蛭10 g，甘草6 g。

1.1.3 主要儀器 全自動脫水機（德國Leica公司，型號：ASP300S），半自動切片機（德國Leica公司，型號：RM2255），全自動染色機（德國Leica公司，型號：TS5015）；奧林巴斯光學顯微鏡（上海通灝光電科技有限公司，型號：CX23）；Centrifuge高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司，型號：5804R）；紫外光度儀（日本SHIMADZU，型號：UV-2450）；熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）循環(huán)儀（中國中山達安，型號：MDA7600）；凝膠成像儀（美國BIO-RAD公司，型號：Gel Doc XR）；分光光度計（日本SHIMADZ公司，型號：UV-2540）；高速冷凍離心機（美國科俊儀器公司，型號：SH03014）；Western電泳儀（美國BIO-RAD公司，型號：164-5051）。

1.2 分組與造模方法 取生長狀態(tài)良好的H22細胞，將細胞懸液（1×107個/mL）接種于小鼠腹腔（0.2 mL/只），腹水傳代3次。脫頸處死已接種H22瘤種11 d、腹部隆起明顯的第3代腹水瘤小鼠，取腹腔瘤液（無明顯血性，呈乳白色），生理鹽水稀釋，800 r/min離心5 min，棄上清得腫瘤細胞，生理鹽水制備細胞懸液（1.0×107個/mL），接種于小鼠右腋皮下（0.2 mL/只），第4天后摸到小鼠腋下約綠豆大小的硬塊則為造模成功。造模完成后，將小鼠隨機分成正常組、模型組及肝癌條達飲低、中、高劑量組，各10只，肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠分別予以16、32、64 g/kg體質(zhì)量肝癌條達飲灌胃，1次/d，正常組和模型組則每天給予同等體積的生理鹽水灌胃，各組均連續(xù)干預15 d。

1.3 觀察指標 ①各組小鼠腫瘤生長指標。小鼠采血后，頸椎脫臼處死，剝離腫瘤，分析天平稱重，計算各組小鼠腫瘤體積與抑瘤率。抑瘤率（%） = （模型組平均瘤重 － 給藥組平均瘤重） / 模型組平均瘤重×100%。②各組小鼠腫瘤組織病理變化。建模完成，每組隨機取1只小鼠，經(jīng)二氧化碳處死，進行腫瘤組織病理切片，10%中性福爾馬林溶液固定，石蠟包埋，4 μm切片，HE染色觀察腫瘤組織病理學變化。③熒光定量PCR法及蛋白免疫印跡法（WB）法分別監(jiān)測小鼠肝臟組織Bcl-2、Bax、Caspase-3 mRNA及蛋白的表達；取小鼠肝臟通過Rrizol法提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，定量PCR，反應(yīng)條件為預變性95 ℃、5 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，40個循環(huán)，PCR儀采集熒光信號，計算2-ΔΔCt值表示mRNA的相對表達含量。放射免疫沉淀試驗（RIPA）裂解法提取肝臟總蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，SDA-PAGE凝膠電泳，將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯（PVDF）膜后，封閉1 h（5%脫脂奶粉），一抗稀釋1 000倍，β-actin抗體稀釋4 000倍，4 ℃搖床搖蕩孵育過夜，聚丁二酸對苯二甲酸丁二醇共聚酯（PBST）漂洗濾膜4次，5 min/次；將二抗稀釋5 000倍，室溫下?lián)u蕩孵育1～2 h，然后用PBST充分洗膜，漂洗5次，5 min/次，然后進行曝光，直至出現(xiàn)最佳條帶。規(guī)定以模型組數(shù)值為參照，以模型組的表達量為1，其他組的蛋白表達量除以模型組蛋白表達量，計算下面3個劑量組的數(shù)值。

1.4 統(tǒng)計學方法 通過SPSS 22.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計量資料經(jīng)S-W法檢驗均符合正態(tài)分布且方差齊，以（ x ±s）表示，行t檢驗，多組間比較采用重復測量方差分析；計數(shù)資料以[例（%）]表示，行χ2檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠腫瘤生長指標比較 與模型組比，肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠平均腫瘤體積均顯著減小，平均腫瘤質(zhì)量顯著降低，且高劑量組小鼠平均腫瘤質(zhì)量均顯著低于低、中劑量組，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05）；肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠抑瘤率均呈升高趨勢，見表1。

2.2 各組小鼠腫瘤免疫組織化學染色切片 顯微鏡下HE切片染色結(jié)果可見，正常小鼠正常細胞分布均勻，未見腫瘤細胞，見圖1-A；模型組小鼠呈現(xiàn)大量的腫瘤細胞并顯示腫瘤細胞團體積大，腫瘤細胞排列密集，形態(tài)大小不一，核分裂象多，見圖1-B；肝癌調(diào)達飲低、中、高劑量均顯著促進腫瘤細胞死亡，減少腫瘤細胞數(shù)，且呈濃度依賴性變化，見圖1-C、D、E。

2.3 各組小鼠腫瘤組織Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA及蛋白相對表達量比較 與模型組比，肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠Bax、Caspase-3 mRNA相對表達量及蛋白相對表達量均呈逐漸升高趨勢，Bcl-2 mRNA相對表達量與蛋白相對表達量均呈逐漸降低趨勢，但任意兩組間經(jīng)比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均Plt;0.05），見表2。

3 討論

目前對于HCC的治療仍以外科手術(shù)治療為主，包括肝切除和肝移植術(shù)，但由于肝癌起病隱匿、發(fā)展迅速、惡性程度高，臨床確診時患者已多屬于中、晚期，且常由于肝癌患者肝功能儲備差、肝內(nèi)轉(zhuǎn)移及播散而失去外科手術(shù)治療的機會，而介入治療、局部消融治療、放射治療及生物靶向治療等措施，雖增加了肝癌的治療方式，但其明顯的不良反應(yīng)及應(yīng)用局限無法忽視。

中醫(yī)認為，HCC的主要病機為正虛于內(nèi)，濕、熱、毒、瘀、痰相互膠結(jié)，日久積而成塊；肝、脾、腎虧虛，臟腑功能失調(diào)是肝癌的發(fā)病基礎(chǔ)，治療肝癌首當扶正[5]。肝癌條達飲中黃芪可補氣、解毒排膿、利尿消腫；白術(shù)可補氣健脾、燥濕利水；茯苓可利水消腫、健脾止瀉，郁金可活血止痛、行氣解郁，夏枯草可清瀉肝火、散結(jié)消腫，蛇莓可清熱涼血、消腫解毒；澤漆可行水消腫、解毒；半邊蓮可清熱解毒、利尿消腫；莪術(shù)可消積止痛、行氣破血；炙水蛭可止痛、活血通經(jīng)；石見穿可活血化瘀、清熱解毒；甘草可補脾益氣，清熱解毒，上述藥物聯(lián)用，共奏扶正固本、活血化瘀、化痰散結(jié)、軟堅散結(jié)、活血消腫之功效。相關(guān)研究認為，HCC的病機特點為本虛標實，本虛主要是肝、脾、腎虧虛，標實主要為濕、熱、毒、瘀、痰合而為患，病初在肝脾，當清肝養(yǎng)肝為主，佐以健脾以防變；自擬肝癌條達飲，結(jié)果顯示，肝癌條達飲能夠改善患者中醫(yī)臨床證候，防治癌癥復發(fā)和轉(zhuǎn)移，增強患者的機體免疫力，促進患者康復；同時還可減輕化療所引起的疼痛癥狀，且未見明顯不良反應(yīng)，臨床應(yīng)用安全，療效確切[6]。

本研究中，與模型組比，肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠平均腫瘤體積均顯著減小，平均腫瘤質(zhì)量顯著降低，且高劑量組小鼠平均腫瘤質(zhì)量均顯著低于低、中劑量組；肝癌條達飲低、中、高劑量組小鼠抑瘤率均呈升高趨勢，提示低、中、高劑量肝癌條達飲對H22荷瘤小鼠均具有明顯的抗腫瘤活性，且其抑瘤作用與劑量呈正相關(guān)。HE染色法對H22荷瘤小鼠的腫瘤組織進行觀察，檢測各小鼠體內(nèi)細胞凋亡的情況，結(jié)果表明，H22荷瘤小鼠模型組腫瘤細胞核清晰且排列緊密，病理性核分裂像多，腫瘤細胞凋亡較少；而肝癌條達飲低、中、高劑量組干預后，均出現(xiàn)了不同程度的核破裂，也提示了肝癌條達飲對H22荷瘤小鼠的抑瘤活性呈劑量依賴性。

有研究表明，HCC存在多種信號通路的異常激活，其中包括表皮生長因子受體、肝細胞生長因子及凋亡信號通路調(diào)控機制紊亂[7-8]。細胞凋亡是細胞在特定條件下，受多種基因調(diào)控發(fā)生的程序化死亡，是機體關(guān)鍵自穩(wěn)調(diào)節(jié)機制，細胞凋亡與凋亡因子密切相關(guān)，Caspase-3是Caspase級聯(lián)反應(yīng)下游的關(guān)鍵凋亡因子，而Bax、Bcl-2均是Bcl-2家族中具有代表性的促進凋亡和抗凋亡的因子。相關(guān)研究顯示，黃芪配伍莪術(shù)可增強促凋亡蛋白Caspases、Bax等的表達，阻礙凋亡蛋白Bcl的表達，抑制端粒酶的活性，誘導堿性磷酸酶和乳酸脫氫酶的表達等[9]。現(xiàn)代藥理學研究表明，蛇莓酚提取物可以抑制肝癌細胞增殖，激發(fā)細胞凋亡，下調(diào)Bcl-2，上調(diào)Bax，活化Caspase-3，誘導細胞凋亡，在體內(nèi)可以抑制腫瘤生長，延長荷瘤鼠生存時間[10]；澤漆乙酸乙酯粗提物可抑制人肝癌細胞中基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、細胞周期蛋白D1（CyclinD1）及Bcl-2的表達，而對Bax、Caspase-3的表達有促進作用，且呈劑量依賴性[11]。為深入探究肝癌條達飲的抑瘤作用機制，本研究用PCR法與WB法對H22荷瘤小鼠腫瘤組織Bax、Casepase3、Bcl-2表達情況進行測定，結(jié)果顯示，肝癌條達飲低、中、高劑量組能提高促凋亡因子Bax、Casepase3表達，降低抗凋亡因子Bcl-2 表達；推測出肝癌條達飲通過控制細胞凋亡相關(guān)重要基因（Bax、Bcl-2、Caspase-3）mRNA及蛋白的表達，起到治療HCC的作用。

綜上，肝癌條達飲可通過上調(diào)Bax、caspase-3，下調(diào)Bcl-2蛋白表達來誘導H22荷瘤小鼠肝癌細胞凋亡，且隨著劑量的增加，抗腫瘤效果更顯著。但目前關(guān)于肝癌條達飲的相關(guān)研究報道較少，其在體內(nèi)的抗腫瘤作用機制也十分復雜，因此仍需進一步開展深入研究。

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