miR-181c-5p通過靶向N-myc下游調(diào)控基因2調(diào)控人膠質(zhì)母細胞瘤生物學行為機制研究

【摘要】目的 探討miR-181c-5p通過靶向N-myc下游調(diào)控基因2（NDRG2）調(diào)控人膠質(zhì)母細胞瘤生物學行為的機制。方法 選取2021年4月至2022年4月海南省第二人民醫(yī)院收治的30例非功能區(qū)膠質(zhì)瘤患者術(shù)中的膠質(zhì)母細胞瘤（GBM）組織標本及鄰近正常腦組織標本進行研究。應(yīng)用實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)（qRT-PCR）檢測GBM組織標本、正常腦組織標本中miR-181c-5p的表達水平；熒光素酶檢測 miR-181c-5p 靶向調(diào)控NDRG2基因情況；應(yīng)用qRT-PCR及免疫印跡試驗（Western Blot）檢測GBM組織標本中 NDRG2 的基因及蛋白表達水平；檢測GBM細胞增殖、遷移和侵襲情況。結(jié)果 GBM組織中NDRG2 mRNA相對表達量高于正常組織標本（Plt;0.05）；雙熒光素酶實驗顯示，miR-181c-5p模擬物（miR-181c-5p mimics）組NDRG2野生型（NDRG2 WT）的相對熒光素酶活性低于模擬物對照（NC-mimics）組（Plt;0.05）；miR-181c-5p抑制劑（miR-181c-5p inhibitor）組U87細胞中NDRG2 mRNA表達和蛋白表達高于抑制劑對照（NC-inhibitor）組（Plt;0.05）；miR-181c-5p mimics組U87細胞中NDRG2 mRNA 表達和蛋白表達顯著低于NC mimics組（Plt;0.05）；細胞增殖-毒性試驗（CCK-8）檢測結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sh-NDRG2（sh-NDRG2）組U87細胞增殖率低于轉(zhuǎn)染sh-NC（sh-NC）組（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2組U87細胞增殖率低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組（Plt;0.05）。Transwell 實驗顯示，sh-NDRG2組U87細胞遷移數(shù)量及侵襲數(shù)量低于sh-NC組（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2組U87細胞遷移數(shù)量及侵襲數(shù)量低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組（Plt;0.05）。結(jié)論 miR-181c-5p能夠通過調(diào)節(jié)NDRG2的表達，進而調(diào)節(jié)人膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

【關(guān)鍵詞】miR-181c-5p；N-myc下游調(diào)控基因2；人膠質(zhì)母細胞瘤；增殖；侵襲；遷移

【中圖分類號】R739.4 【文獻標識碼】A 【文章編號】2096-2665.2023.11.0141.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.11.047

人膠質(zhì)母細胞瘤（glioblastoma，GBM）是最具有侵襲力和致命性的顱腦惡性腫瘤。世界衛(wèi)生組織將GBM分為4個等級，其中Ⅳ級的GBM惡性程度最高，因其具有較高異質(zhì)性和對細胞凋亡的固有抗性導(dǎo)致患者死亡率極高[1]。當前GBM的治療方案為手術(shù)切除、放射治療及化學治療等，但僅能提高患者約20個月的平均生存時間[2]。雖然手術(shù)可將腫瘤完全切除，但因其侵襲性較高，造成切口邊緣不能完全避免復(fù)發(fā)的可能。另外，化學放射治療對GBM細胞無特異殺傷作用，甚至還可能導(dǎo)致中樞神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)生嚴重不良反應(yīng)[3]。目前，由于各種方法的療效均存在不足，導(dǎo)致GBM的治療仍然是一個棘手的問題。因此，進一步明確其作用機制和發(fā)現(xiàn)新的有效靶點仍然是一個重要課題。微小RNA可以通過與下游目標基因3'末端的非編碼區(qū)域結(jié)合，調(diào)控目標基因的表達，從而實現(xiàn)對腫瘤細胞生物學行為的調(diào)控。miR-181c-5p是微小RNA家族的成員，研究表明，miR-181c-5p在GBM中表達異常，通過抑制NDRG2基因表達來調(diào)控GBM的生物學活性[4]。因此，本實驗進一步研究miR-181c-5p抑制NDRG2表達調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞增殖、促進細胞侵襲、遷移等作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本 選取2021年4月至2022年4月收治的30例非功能區(qū)膠質(zhì)瘤患者術(shù)中的GBM組織標本及鄰近正常腦組織標本進行研究，應(yīng)用液氮進行冷凍處理。本研究經(jīng)海南省第二人民醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，取樣時均獲得患者許可同意。

1.2 材料 GBM細胞株U87；高糖液體培養(yǎng)基（DMEM）；胎牛血清（FBS）；胰蛋白酶；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑2000（Invitrogen Invitrogen）；雙熒光素酶報告檢驗試劑；細胞增殖-毒性試驗（CCK-8）試劑盒、NDRG2抗體、磷酸甘油醛脫氫酶基因（GAPDH）抗體；Transwell孔板；多聚甲醛（POM）、NDRG2野生型（NDRG2 WT）、NDRG2突變型（NDRG2 MUT）。

1.3 細胞培養(yǎng) GBM細胞系U87在10%的FBS中，37 ℃溫箱中培養(yǎng)，3 d進行一次換液。當細胞為長期生長狀態(tài)即可進行生物學研究。

1.4 質(zhì)粒構(gòu)建和轉(zhuǎn)染 將長期生長狀態(tài)的細胞接種到孔板中，采用轉(zhuǎn)染劑進行轉(zhuǎn)染，根據(jù)實驗設(shè)計分為轉(zhuǎn)染sh-NCsh-NC、sh-NDRG2、NC-mimics、miR-181c-5p mimics、NC-inhibitor、miR-181c-5p inhibitor，將其與相應(yīng)的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑，分別轉(zhuǎn)染至U87細胞，轉(zhuǎn)染結(jié)束后繼續(xù)培養(yǎng)72 h。

1.5 實時熒光定量PCR檢測NDRG2、miR-181c-5p表達 取GBM組織及細胞U87的總RNA，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后根據(jù)試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液，采用LightCycler96PCR系統(tǒng)進行擴增分析。PCR反應(yīng)所用引物的具體序列見表1。NDRG2內(nèi)參：GAPGH，miR-181c-5p內(nèi)參：U6，采用2—△△Ct方法評估NDRG2、miR-181c-5p表達水平。

1.6 免疫印跡試驗（Western Blot）檢測 提取細胞總蛋白并測量其濃度，取20 μg蛋白電泳，以濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯上，封閉1 h，加相對應(yīng)的一抗山羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）工作液，4 ℃冰箱保存一夜。洗膜，加二抗羊抗兔IgG，1 h后曝光顯影及定影處理，進行蛋白條帶灰度值分析和蛋白表達水平計算。

1.7 細胞增殖-毒性試驗（CCK-8）檢測細胞增殖 將細胞接種于96孔板中孵化48 h后加入CCK-8溶液，同時設(shè)置空白對照組。置于37 ℃下孵育1 h，測定450 nm處的吸光度值。

1.8 細胞遷移和侵襲 將U87細胞置于24孔板內(nèi)培養(yǎng)48 h。用胰酶對U87細胞進行消化，然后用無血清培養(yǎng)液進行懸浮，泰盼蘭染色法將細胞濃度調(diào)到2×108/L，在 Transwell小室的上部加入100 μL的細胞懸浮液，然后在 Transwell小室的下部加入500 μL10%的血清完全培養(yǎng)基，在37 ℃的條件下，在遮光24 h后將其取出，用PBS沖洗干凈，棉簽將不會遷移的細胞擦拭干凈。用4%聚甲醛（POM）固定20 min，PBS沖洗3次，0.1%晶體紫法10 min，PBS沖洗，然后隨機選取5個視野，對下腔內(nèi)的細胞進行計數(shù)。

1.9 雙熒光素酶報告實驗 采用micro RNA在線數(shù)據(jù)庫預(yù)測NDRG2與miR-181c-5p的結(jié)合位點，擴增含結(jié)合位點的NDRG2片段，將其插入熒光素酶表達載體中，得到NDRG2野生型載體，并構(gòu)建NDRG2突變型載體，將其分別與miR-181c-5p和miR-NC共轉(zhuǎn)染至內(nèi)皮細胞中，然后按照說明書檢測熒光素酶活性。

1.10 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x）表示，組間比較行獨立樣本t檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 GBM組織標本中 NDRG2 的蛋白表達情況 GBM組織中NDRG2 mRNA相對表達量顯著高于正常腦組織標本，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見圖1。

2.2 GBM組織標本中 NDRG2 的基因水平 雙熒光素酶實驗顯示，miR-181c-5p mimics組NDRG2 WT的相對熒光素酶活性明顯低于NC mimics組（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor組U87細胞中NDRG2 mRNA表達和蛋白表達高于NC inhibitor組（Plt;0.05）； miR-181c-5p mimics組U87細胞中NDRG2 mRNA 表達和蛋白表達顯著低于NC mimics組（Plt;0.05），見圖2、圖3。

2.3 轉(zhuǎn)染后U87細胞增殖、遷移和侵襲情況比較 CCK-8結(jié)果顯示，sh-NDRG2組轉(zhuǎn)染后U87細胞增殖率低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2轉(zhuǎn)染后U87細胞增殖率低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見圖4。Transwell 實驗顯示，sh-NDRG2組轉(zhuǎn)染后U87細胞遷移數(shù)量及侵襲數(shù)量低于sh-NC組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05）；miR-181c-5p inhibitor+sh-NDRG2轉(zhuǎn)染后U87細胞遷移數(shù)量及侵襲數(shù)量低于miR-181c-5p inhibitor+sh-NC組，差異有統(tǒng)計學意義（Plt;0.05），見圖5、圖6。

3 討論

腦膠質(zhì)瘤是臨床上死亡率高、預(yù)后差且難以治愈的惡性腫瘤之一[5]。由于其具有高度的腫瘤異質(zhì)性，因此，精準有效的免疫治療十分重要，而尋找合適的靶點是治療的關(guān)鍵。近年來，隨著腫瘤基礎(chǔ)研究的不斷深入，其分子層面上的研究也取得了長足的進步，但仍有許多癌癥基因或抑制腫瘤基因的功能尚未被挖掘，許多新的基因可能會直接影響細胞的周期進程和凋亡，從而使腫瘤細胞的成長受到抑制。因此，基因治療也與腦膠質(zhì)瘤密切相關(guān)。

miRNA是一種促進或抑制癌癥的基因，參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。miRNA的功能主要是針對特定的基因發(fā)揮作用，若靶基因是腫瘤促進基因，miRNA能夠與mRNA互補結(jié)合抑制目標蛋白，從而達到對mRNA轉(zhuǎn)錄后的調(diào)節(jié)作用。相關(guān)研究顯示，miRNA能通過調(diào)控其下游目標基因的表達來調(diào)節(jié)腫瘤的生物活性[6]。miR-181c-5p是RNA-181家族中的一個重要成員，可以通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄后目標基因的表達來抑制腫瘤細胞的生長。NDRG2是1999年我國學者通過消減雜交法發(fā)現(xiàn)的腦內(nèi)新蛋白，主要分布在哺乳動物大腦中，屬于α/β水解酶超家族，被認為是抑制腫瘤的候選基因，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)[7]。以往研究表明，NDRG2基因在各種惡性腫瘤中均有低水平表達，并且NDRG2隨腫瘤的惡性程度和分化程度的下降而減少[8]。但也有研究顯示，在結(jié)直腸癌患者癌組織中的NDRG2基因呈高水平表達，提示NDRG2作為抑制腫瘤的候選基因，其表達與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展具有相關(guān)性[9]。

本研究結(jié)果顯示，GBM組織中NDRG2 mRNA相對表達量顯著升高；雙熒光素酶實驗證實了U87細胞中miR-181c-5p可以靶向調(diào)控NDRG2的表達。另外，本研究結(jié)果也證實了U87細胞中miR-181c-5p可以靶向調(diào)控NDRG2抑制遷移和侵襲。這提示miR-181c-5p在膠質(zhì)瘤進展過程中通過調(diào)控NDRG2的表達水平來抑制GMB的發(fā)生、發(fā)展[10]。

綜上所述，miR-181c-5p能夠通過調(diào)節(jié)NDRG2基因的表達，進而調(diào)節(jié)人膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖、侵襲及遷移能力。

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