益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味對糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖抑制作用的實驗研究

【摘要】目的 觀察益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味對糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）大鼠視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖抑制作用的影響。方法 取SPF級SD雄性大鼠80只，依據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法分為對照組、模型組、干預(yù)一組及干預(yù)二組，每組20只。對照組大鼠給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組、干預(yù)一組及干預(yù)二組大鼠均予建立DR模型。建模成功后對照組、模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃，干預(yù)一組大鼠給予參芪四物湯加味灌胃、干預(yù)二組大鼠給予益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味灌胃，持續(xù)干預(yù)4周。比較4組大鼠雙眼視網(wǎng)膜血流相關(guān)指標(biāo)、細(xì)胞凋亡率及血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）水平。結(jié)果 模型組、干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值低于對照組，阻力指數(shù)高于對照組（Plt;0.05）；干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于模型組，阻力指數(shù)低于模型組（Plt;0.05）；干預(yù)二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于干預(yù)一組，阻力指數(shù)低于干預(yù)一組（Plt;0.05）；模型組、干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠的視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡率高于對照組，干預(yù)一組、干預(yù)二組低于模型組，干預(yù)二組低于干預(yù)一組（Plt;0.05）；模型組、干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠的VEGF表達(dá)水平高于對照組，干預(yù)一組、干預(yù)二組低于模型組，干預(yù)二組低于干預(yù)一組（Plt;0.05）。結(jié)論 益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味用于治療DR大鼠有良好的治療作用。

【關(guān)鍵詞】糖尿病視網(wǎng)膜病變；益智仁；參芪四物湯；細(xì)胞增殖；細(xì)胞凋亡

【中圖分類號】R276.7 【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A 【文章編號】2096-2665.2023.11.0137.04

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.11.046

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病微血管疾病的并發(fā)癥之一，因其發(fā)病機(jī)制尚未明確，臨床治療效果欠佳，因此尋找有效的治療方法，對DR患者的身體健康具有重要的意義[1]。有研究認(rèn)為，DR發(fā)生發(fā)展過程的核心機(jī)制為氣陰兩虛、血行瘀滯，導(dǎo)致患者氣血不能上聚于目，出現(xiàn)目視不清、眼睛干澀等癥狀[2]。參芪四物湯具有益氣補(bǔ)血、活血化瘀之功效[3]。益智仁具有溫補(bǔ)腎氣之功效，能夠降血糖及尿中微量白蛋白的排泄量，進(jìn)而對腎臟起保護(hù)作用[4]。但臨床關(guān)于益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味治療DR機(jī)制的研究較少，本研究主要觀察益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味對DR模型大鼠的眼部血液流變性及血流動力學(xué)的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 取SPF級SD雄性大鼠80只[北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2012-0001]，飼養(yǎng)于溫度為20～25 ℃、濕度為40%～70%的動物室，確保大鼠的生存環(huán)境干燥，飼養(yǎng)期間大鼠可以自由飲水，日夜交替12 h，適宜喂食1周。本實驗經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院中醫(yī)學(xué)院動物實驗倫理審查批準(zhǔn)。

1.2 主要實驗試劑 高糖高脂飼料（北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司）、鏈脲佐菌素（美國Sigma公司）、磷酸鹽緩沖液（PBS）（上海研生實業(yè)有限公司）、蘇木精伊紅（HE）試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）、二甲苯（北京化學(xué)試劑公司）、蛋白酶K（上海源葉生物）、4%多聚甲醛組織固定液[康迪斯化工（湖北）有限公司]、3%H2O2-甲醇封閉液（Bioss公司）、原位末端標(biāo)記法（TUNEL）試劑盒、Coveter-POD液（瑞士Roche公司）、蛋白裂解液（RIPA裂解液）（北京諾博萊德科技有限公司）、蛋白定量試劑盒（碧云天生物技術(shù)研究所）、山羊抗兔IgG二抗（北京中杉金橋生物）。

1.3 實驗儀器 多普勒激光血流儀（Moor公司，型號：VMS-LDF1型）、光學(xué)顯微鏡（日本Olympus公司，型號：OLYMPUS-BH2）、脫色搖床（海門市其林貝爾儀器制造有限公司，型號：TS-2000A型）、電泳儀（thermo公司，型號：EC250-90型）、低溫高速離心機(jī)（長沙湘智離心機(jī)儀器有限公司，型號：TGL16型）、凝膠成像系統(tǒng)（thermo公司，型號：CA91786U.S.A UVP GDS-8000System）、酶標(biāo)儀（深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司，型號：RT-6100型）。

1.4 實驗組方 益智仁15 g。參芪四物湯基本組方：黨參15 g、黃芪30 g、當(dāng)歸15 g、熟地20 g、川芎10 g、白芍15 g；加味：密蒙花10 g，谷精草10 g。均購自于海南省海南醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科。

1.5 動物模型的建立、分組及給藥方法 80只SD大鼠依據(jù)隨機(jī)數(shù)字法將其分為對照組、模型組、干預(yù)一組及干預(yù)二組，每組20只。對照組大鼠予以基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，模型組和干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠給予高糖高脂飼料喂養(yǎng)8周。8周后，對照組大鼠注射等體積生理鹽水，模型組和干預(yù)組大鼠經(jīng)腹腔注射40 mg/kg的鏈脲佐菌素建立DR大鼠模型。于3 d后取大鼠尾部靜脈血檢測其血糖，糖尿病大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)為[5]：血糖≥16.7 mmol /L，尿糖3+以上。糖尿病大鼠造模成功后繼續(xù)喂養(yǎng)4周，對照組及模型組大鼠給予等體積生理鹽水灌胃；干預(yù)一組大鼠給予參芪四物湯加味灌胃，根據(jù)大鼠與人體表面積轉(zhuǎn)換公式，參芪四物湯加味劑量為9.2 g/kg，藥體積10 mL/kg；干預(yù)二組大鼠給予益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味灌胃，益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味為9.2 g/kg，各組1次/d。4周后進(jìn)行眼底血管熒光造影檢查。4 周后做眼底血管造影，DR大鼠造模成功標(biāo)準(zhǔn)[6]：血管迂曲擴(kuò)張、背景熒光增強(qiáng)和新生血管熒光滲漏等癥狀。

1.6 大鼠眼部血流測定 采用激光血流儀檢測各組大鼠視網(wǎng)膜血流，包括收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值及阻力指數(shù)，阻力指數(shù)=（收縮期血流速度峰值-舒張期血流速度峰值）/收縮期血流速度峰值。

1.7 實驗動物標(biāo)本收集 實驗4周，在最后一次測量大鼠眼部血流并加以記錄后，收集大鼠視網(wǎng)膜。采用水合氯醛腹腔麻醉，大鼠全眼球切除，并取全視網(wǎng)膜。用無菌磷酸緩沖鹽清洗，4%甲醛固定24 h后，常規(guī)脫水透明，石蠟包裹，切片4 μm，在-80 ℃下貯存，進(jìn)行細(xì)胞凋亡實驗檢測。另外，在80 ℃下，取一部分視網(wǎng)膜組織進(jìn)行免疫印跡分析。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測 取大鼠視網(wǎng)膜組織切片，用二甲基苯浸膏脫蠟，用乙醇進(jìn)行梯度水化，HE染色。PBS漂洗3次，每次5 min。加入2 μg/mL蛋白酶K于37 ℃條件下進(jìn)行30 min的孵育，PBS沖洗3次，每次5 min。添加2 μg/mL的蛋白酶K后在37 ℃育溫箱中靜置30 min，再次PBS漂洗3次，每次5 min。加入4%多聚甲醛組織固定液后在37 ℃育溫箱中靜置30 min，再次PBS漂洗3次。加入3%H2O2-甲醇封閉液在室溫下封閉30 min，再次PBS漂洗3次。取TUNEL試劑盒，配置結(jié)合緩沖液，加蓋玻片，37 ℃下孵育1 h，PBS漂洗3次。在DAB室溫避光顯色10 min后，用蒸餾水沖洗，封片。400倍光學(xué)顯微鏡下，選取7種不同的視野，各區(qū)域?qū)?00個細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，并測定其細(xì)胞凋亡率。

1.9 蛋白質(zhì)印跡檢測 將大鼠視網(wǎng)膜組織切片，加入預(yù)冷的細(xì)胞組織快速裂解液（RIPA）中勻漿，離心取上清液，蛋白質(zhì)定量檢測法測蛋白質(zhì)濃度，取20 μg蛋白變性上樣，聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳后轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上，加入一抗孵育過夜，加辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔二抗IgG，搖床孵育120 min，TBST洗膜，顯影后用Image J軟件分析血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）蛋白的相對表達(dá)水平并與以肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參照進(jìn)行比較。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 21.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計量資料以（x）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較行LSD-t檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠雙眼血流相關(guān)指標(biāo)變化情況比較 模型組、干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠的收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值低于對照組，阻力指數(shù)高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠的收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于模型組，阻力指數(shù)低于模型組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05）；干預(yù)二組大鼠收縮期血流速度峰值、舒張期血流速度峰值高于干預(yù)一組，阻力指數(shù)低于干預(yù)一組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡情況比較 模型組、干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率高于對照組，干預(yù)一組、干預(yù)二組低于模型組，干預(yù)二組低于干預(yù)一組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表2、圖1。

2.3 各組大鼠VEGF表達(dá)水平比較 模型組、干預(yù)一組、干預(yù)二組大鼠的VEGF表達(dá)水平高于對照組，干預(yù)一組、干預(yù)二組低于模型組，干預(yù)二組低于干預(yù)一組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（Plt;0.05），見表3、圖2。

3 討論

DR是一種慢性、進(jìn)展性視力損害性疾病，由視網(wǎng)膜微循環(huán)功能紊亂引起[7]。目前，DR的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，但相關(guān)研究表明，視網(wǎng)膜中央動脈的收縮期血流速度和舒張期血流速度在DR早期階段就有明顯變化，隨后視網(wǎng)膜中央動脈血流速度減緩，對眼部血流狀態(tài)造成一定影響[8-9]。另外，細(xì)胞凋亡率升高及存活率降低是DR發(fā)生發(fā)展的主要特征之一，因此，減少視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡，有助于保護(hù)視網(wǎng)膜功能[10]。

本研究結(jié)果顯示，DR大鼠給予益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味灌胃治療后，眼部血流相關(guān)指標(biāo)均優(yōu)于模型組，且干預(yù)二組優(yōu)于干預(yù)一組。劉敏等[11]認(rèn)為，DR的根本原因在于氣血不足，無法將精氣運(yùn)至雙眼，而中氣不足，則無法控制血液，導(dǎo)致血管堵塞。這提示DR與氣虛血少、精液耗損有關(guān)。益智仁能夠溫補(bǔ)腎氣，對尿量增多、尿頻及蛋白尿等癥狀有良好療效[12-13]。參芪四物湯中黨參、黃芪益氣調(diào)中，當(dāng)歸、熟地、川芎、白芍益氣養(yǎng)血、行氣活血，密蒙花、谷精草清熱明目退翳。上述諸藥合用，共奏益氣活血，疏通經(jīng)絡(luò)，滋陰生精，補(bǔ)腎益髓，通竅明目之功效。通過影響眼部的血液循環(huán)，改善毛細(xì)血管阻塞和血瘀癥狀，增加眼前節(jié)及視網(wǎng)膜的血流量，使血管軟化、擴(kuò)張，改善眼部血流動力學(xué)情況，從而使患者視力得到改善[14]。細(xì)胞凋亡參與DR的病理過程，但其具體的通路和機(jī)制尚不明確，且導(dǎo)致視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡的途徑較多。DR患者玻璃體中VEGF水平顯著升高，可以促進(jìn)病理性新生血管形成[15-16]。本研究結(jié)果還顯示，益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味灌胃治療DR大鼠后，視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡率及VEGF水平顯著下降。這提示益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味能夠抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡。原因可能為益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味能夠抑制細(xì)胞凋亡和壞死、增強(qiáng)免疫能力等作用，同時還能抑制VEGF的表達(dá)，從而降低和延遲視網(wǎng)膜新生血管的發(fā)生和發(fā)展。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，益智仁、黃芪具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)血管修復(fù)和再生及改善微循環(huán)灌注的藥理作用，可以抑制細(xì)胞凋亡，改善微循環(huán)灌注，擴(kuò)張血管，清除氧自由基[17-18]。此外，黃芪還能通過作用于Akt-VEGF信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑產(chǎn)生抗炎作用，降低糖尿病性視網(wǎng)膜病變中白細(xì)胞的黏附力，并能抑制其凋亡及基底膜增厚[19-20]。

綜上所述，益智仁聯(lián)合參芪四物湯加味治療能改善糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠視網(wǎng)膜血流，降低VEGF水平，抑制視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡和視網(wǎng)膜血管異常增殖。

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