宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)在支氣管擴(kuò)張病原學(xué)診斷中的比較

【摘要】目的 研究宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)（mNGS）與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)在支氣管擴(kuò)張病原學(xué)診斷中的價(jià)值，為臨床提供參考。方法 選取百色市人民醫(yī)院2021年9月至2022年10月收治的170例支氣管擴(kuò)張癥患者為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，根據(jù)檢測(cè)方法不同分為mNGS組（65例）和實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組（105例）。根據(jù)患者自我選擇用藥情況將需調(diào)整抗生素使用的 43 例患者分為 mNGS1 組（ 22 例）、傳統(tǒng)培養(yǎng)組（ 12 例） 及經(jīng)驗(yàn)組（ 9 例）。收集其經(jīng)纖維支氣管鏡防污染-肺泡灌洗液的常規(guī)微生物檢查結(jié)果，分離培養(yǎng)檢查結(jié)果及臨床宏基因?qū)W組檢測(cè)結(jié)果等臨床資料，比較實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率及不同用藥狀態(tài)下患者轉(zhuǎn)歸情況。結(jié)果 mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率高于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)（Plt;0.05）。mNGS1組患者平均住院時(shí)間短于傳統(tǒng)培養(yǎng)組、經(jīng)驗(yàn)組，mNGS1組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞介素-6水平低于傳統(tǒng)培養(yǎng)組、經(jīng)驗(yàn)組（Plt;0.05）。結(jié)論 mNGS在支氣管擴(kuò)張病原學(xué)診斷中具有一定優(yōu)勢(shì)，診斷陽(yáng)性率更高，對(duì)患者經(jīng)驗(yàn)用藥具有一定幫助，能夠縮短住院時(shí)間，降低炎癥因子水平，值得臨床應(yīng)用。

【關(guān)鍵詞】宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)；實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)；支氣管擴(kuò)張；診斷

【中圖分類號(hào)】R562.2+2 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A 【文章編號(hào)】2096-2665.2023.11.0098.03

DOI：10.3969/j.issn.2096-2665.2023.11.033

支氣管擴(kuò)張是由呼吸道感染、氣道阻塞或先天遺傳等因素引起的支氣管及其周圍肺組織出現(xiàn)纖維化，導(dǎo)致機(jī)體支氣管壁的肌肉與彈性組織被破壞，使支氣管出現(xiàn)永久性擴(kuò)張及變形[1]。下呼吸道感染是支氣管擴(kuò)張的常見病因，其病原體較多，包括細(xì)菌、病毒及支原體等[2]。支氣管擴(kuò)張反復(fù)急性發(fā)作及發(fā)展的主要因素是各種致病菌感染，對(duì)臨床醫(yī)師來說，明確病原體是精準(zhǔn)治療的關(guān)鍵，以往對(duì)抗生素使用僅僅局限于廣譜抗生素經(jīng)驗(yàn)性治療，近年來抗生素的濫用導(dǎo)致了多重耐藥菌明顯增加，故精準(zhǔn)使用抗生素顯得尤為重要[3]。傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)存在一定弊端，陽(yáng)性率低且耗時(shí)長(zhǎng)，難以快速診斷，對(duì)于危重患者感染難以做到早期精準(zhǔn)治療，無法滿足臨床需求。臨床宏基因組學(xué)第二代測(cè)序技術(shù)（mNGS）通過高通量測(cè)序技術(shù)，能夠縮短檢測(cè)時(shí)間，提高病原檢測(cè)敏感度[4]。因此，本研究將mNGS與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)一步尋找病原學(xué)診斷的最佳方式，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取百色市人民醫(yī)院2021年9月至2022年10月收治的170例支氣管擴(kuò)張癥患者為研究對(duì)象進(jìn)行回顧性分析，根據(jù)檢測(cè)方法不同分為實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組（105例）和mNGS組（65例）。實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)組患者男性41例，女性64例；年齡42～68歲，平均年齡（57.00±4.58）歲；白細(xì)胞計(jì)數(shù)（5.50～10.54）×109/L，平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)（8.25±1.87）×109/L；中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)4.00%～7.68%，平均中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（5.58±1.54）%；C反應(yīng)蛋白水平23.05～35.65 mg/L，平均C反應(yīng)蛋白水平（28.13±4.36）mg/L；白細(xì)胞介素-6水平22.01～26.55 pg/mL，平均白細(xì)胞介素-6水平（22.57±2.14）pg/mL。mNGS組患者中男性21例，女性44例；年齡42～69歲，平均年齡（57.22±4.54）歲；白細(xì)胞計(jì)數(shù)（5.51～10.51）×109/L，平均白細(xì)胞計(jì)數(shù)（8.34±1.72）×109/L；中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)4.00%～7.70%，平均中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（5.45±1.56）%；C反應(yīng)蛋白水平23.00～35.85 mg/L，平均C反應(yīng)蛋白水平（28.55±5.33）mg/L；白細(xì)胞介素-6水平22.05～26.69 pg/mL，平均白細(xì)胞介素-6水平（22.14±2.55）pg/mL。兩組患者一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05），組間具有可比性。本研究經(jīng)百色市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合《中國(guó)成人支氣管擴(kuò)張癥診斷與治療專家共識(shí)》[4]中支氣管擴(kuò)張的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②可耐受電子支氣管鏡檢查。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴嚴(yán)重心臟疾病或呼吸循環(huán)衰竭疾病者；②有嚴(yán)重精神障礙者；③合并其他肺部疾病如胸腔積液者。

1.2 研究方法 完善患者肺部 CT、血?dú)夥治黾澳δ艿瘸Ｒ?guī)檢查。經(jīng)臨床醫(yī)師評(píng)估及患者同意后，由有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)師行電子支氣管鏡（福建康百納醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：BF-1TQ290）檢查，并根據(jù)肺部CT提示的擴(kuò)張部位用 37 ℃生理鹽水進(jìn)行灌洗，回收部分灌洗液，獲取防污染支氣管-肺泡灌洗液20 mL送檢。將支氣管-肺泡灌洗液分成2管，每管不少于3 mL，在室溫下放置不超過2 h，立即送百色市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行細(xì)菌、真菌及L型細(xì)菌培養(yǎng)，同時(shí)通過冷鏈運(yùn)送至第三方檢驗(yàn)公司（金域檢驗(yàn)公司）進(jìn)行mNGS檢測(cè)。進(jìn)行電子支氣管鏡檢查并獲取防污染肺泡灌洗液后，立即進(jìn)行經(jīng)驗(yàn)性抗生素治療，病原體陽(yáng)性的根據(jù)藥敏調(diào)整抗生素，病原體檢測(cè)陰性的根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥（口服三代頭孢菌素類藥物、半合成青霉素或氟沙星類藥物、氧氟沙星、左氧氟沙星和洛美沙星；結(jié)合化痰藥止咳）。

1.3 觀察指標(biāo) ①比較實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與mNGS檢測(cè)的陽(yáng)性率。 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)以培養(yǎng)出病原菌為陽(yáng)性，mNGS檢出特異序列即可判為陽(yáng)性。②比較mNGS1組、傳統(tǒng)培養(yǎng)組和經(jīng)驗(yàn)用藥患者的轉(zhuǎn)歸情況。所有患者中有6例未使用抗生素，抗生素未調(diào)整121例，剩下43例患者均調(diào)整抗生素使用，其中有22例根據(jù)mNGS病原體結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，為mNGS1組；有12例根據(jù)病原體結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，為傳統(tǒng)培養(yǎng)組；有9例未根據(jù)mNGS結(jié)果或培養(yǎng)結(jié)果進(jìn)行調(diào)整，為經(jīng)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)歸情況包括呼吸困難加重、反復(fù)咳嗽咳痰、咯血及住院時(shí)間，同時(shí)采集患者空腹靜脈血2 mL，抗凝后置入離心機(jī)（北京海富達(dá)科技有限公司，型號(hào)：BY/TD-3A），以3 000 r/min離心10 min，去除上清液，取下層血漿置于-15 ℃冷凍保存，使用全自動(dòng)免疫分析儀[強(qiáng)生上海醫(yī)療器材有限公司，注冊(cè)號(hào)國(guó)食藥監(jiān)械（進(jìn)）字2010第3400145號(hào)，型號(hào)：5600]與配套試劑檢測(cè)白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞介素-6水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以（x）表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以[例（%）]表示，兩組間比較采用χ2檢驗(yàn)，多組間比較采用Bonferroni" χ2檢驗(yàn)。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)與mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率比較 mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率高于實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表1。

2.2 mNGS1組、傳統(tǒng)培養(yǎng)組和經(jīng)驗(yàn)組患者轉(zhuǎn)歸情況比較 mNGS1組患者住院時(shí)間短于傳統(tǒng)培養(yǎng)組、經(jīng)驗(yàn)組，白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞介素-6水平低于傳統(tǒng)培養(yǎng)組、經(jīng)驗(yàn)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Plt;0.05），見表2。

3 討論

支氣管擴(kuò)張作為臨床常見且多發(fā)的疾病，病原體包括細(xì)菌、病毒及支原體等，反復(fù)急性發(fā)作及發(fā)展的因素中最主要的是各種致病菌感染，因此明確病原體是精準(zhǔn)治療的關(guān)鍵[5-6]。既往的治療主要使用廣譜抗生素開展經(jīng)驗(yàn)用藥，隨著抗生素濫用，患者多重耐藥菌明顯上升，精準(zhǔn)使用抗生素顯得尤為重要[7]。但對(duì)于支氣管擴(kuò)張的患者，相當(dāng)一部分有反復(fù)使用抗生素的經(jīng)歷，臨床常用的病因診斷手段如細(xì)菌、真菌培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)等，常常得不到陽(yáng)性結(jié)果[8]。mNGS檢測(cè)結(jié)果中主要為流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌，其中流感嗜血桿菌陽(yáng)性多為呼吸道感染，且該病傳染速度快，因此臨床檢出率較高。銅綠假單胞菌存在于水、空氣、正常人的皮膚、呼吸道和腸道等環(huán)境，在機(jī)體免疫力降低的情況下，感染可發(fā)生于機(jī)體各部位，會(huì)導(dǎo)致檢出率較高的情況。其中銅綠假單胞菌在感染加重期和穩(wěn)定期的原型菌、L型細(xì)菌中均占第一位，提示L型細(xì)菌可能作為潛在的致病菌在支氣管擴(kuò)張癥患者的肺部定植，可導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張癥感染的遷延和反復(fù)發(fā)作[9]。在臨床工作中，發(fā)現(xiàn)支氣管擴(kuò)張癥患者雖在急性加重期痰培養(yǎng)的陽(yáng)性率較穩(wěn)定期高，但總體陽(yáng)性率仍不超過50%，而且近年由于抗生素的濫用等情況，導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張癥急性加重期少見的病原體如諾卡菌、結(jié)核分枝桿菌等也越來越多，但是查閱中外文獻(xiàn)，尚未見到有大規(guī)模的研究證實(shí)常見病原體及少見病原體近年如何變遷[10-11]。

目前多采用痰液作為檢測(cè)標(biāo)本，而痰液標(biāo)本極易受口腔和上呼吸道定植菌污染，影響結(jié)果判斷，對(duì)醫(yī)院該類疾病患者平均住院日的統(tǒng)計(jì)，多為10天以上，患者經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)重，所以提出同時(shí)進(jìn)行防污染支氣管-肺泡灌洗液病原體培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)與病原體mNGS檢測(cè)[12]?；诤昊蚪M的二代測(cè)序技術(shù)具有病原菌陽(yáng)性檢出率高、快速等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為微生物檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。本研究通過分析mNGS與傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)結(jié)果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)mNGS檢測(cè)陽(yáng)性率更高，究其原因主要在于基于mNGS技術(shù)的微生物檢測(cè)方法，對(duì)宏基因組樣本實(shí)施大規(guī)模的完全測(cè)序，得到宏基因組的核酸序列，結(jié)合生物信息學(xué)工具，對(duì)核酸序列數(shù)據(jù)分析，得到微生物基因信息等，具有無需培養(yǎng)樣本、敏感度高、能夠檢測(cè)未知微生物的優(yōu)點(diǎn)，彌補(bǔ)了傳統(tǒng)微生物檢測(cè)方法的不足，為臨床提供了新的決策依據(jù)[13]。根據(jù)病原體結(jié)果進(jìn)行調(diào)整用藥，結(jié)果發(fā)現(xiàn)患者均存在不同的用藥效果，其中mNGS組患者住院時(shí)間更短，結(jié)果中mNGS組患者白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞介素-6低于傳統(tǒng)培養(yǎng)組、經(jīng)驗(yàn)組，在癥狀好轉(zhuǎn)情況上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，證實(shí)mNGS對(duì)臨床經(jīng)驗(yàn)用藥具有一定幫助，在對(duì)用藥情況分析后，患者根據(jù)mNGS病原體結(jié)果調(diào)整，藥物使用更加具有針對(duì)性。絕大部分感染人群是由于病史及理化結(jié)果，經(jīng)驗(yàn)性使用抗生素治療后，病原學(xué)明確后對(duì)抗生素進(jìn)行調(diào)整[14-15]。但本研究中根據(jù)mNGS結(jié)果進(jìn)行抗生素調(diào)整，可減輕患者炎癥反應(yīng)。依據(jù)微生物培養(yǎng)1周后得到的結(jié)果，可見患者大多情況下病原體已經(jīng)出現(xiàn)一定改變，再針對(duì)培養(yǎng)結(jié)果調(diào)整抗生素方案，因此mNGS的快速、高效、實(shí)時(shí)性體現(xiàn)在檢出病原體種類方面。

綜上所述，支氣管擴(kuò)張病原學(xué)檢查期間mNGS能夠提供良好支持，相比傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)室微生物培養(yǎng)速度更快，能夠及時(shí)調(diào)整患者抗生素使用情況，對(duì)患者治療提供一定幫助。

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