易栓癥分子遺傳學(xué)研究進(jìn)展

楊旭虎,徐 伍,劉建成,楊海霞,馬 鑫,李玉潔,范 進(jìn),裴海峰

(1.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,四川 成都 610083;2.南方醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院泌尿外科,廣東 廣州510900;3.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院康復(fù)科,四川 成都 610083;4.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院兒科,四川 成都 610083;5.西部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院心內(nèi)科,四川 成都 610083)

易栓癥的發(fā)生與凝血系統(tǒng)、抗凝系統(tǒng)及纖溶系統(tǒng)密切相關(guān),當(dāng)多種遺傳或獲得性因素使得三者穩(wěn)態(tài)失衡,導(dǎo)致機(jī)體出現(xiàn)容易發(fā)生血栓栓塞的疾病或狀態(tài),即易栓癥。易栓癥最早是在報(bào)道家族性抗凝血酶缺陷時(shí)提出[1],突出表現(xiàn)為靜脈血栓栓塞(Venous thromboembolism,VTE),常見為下肢深靜脈血栓(Deep venous thrombosis,DVT)形成。DVT患者肺梗死的發(fā)生率約為30%,嚴(yán)重威脅人類生命健康。有研究表明,外源性損傷如脾臟破裂程度越嚴(yán)重,對(duì)凝血功能的影響越嚴(yán)重[2];部分凝血相關(guān)因子聯(lián)合心肌標(biāo)志物,還可應(yīng)用于冠心病的診斷[3]。而隨著對(duì)易栓癥研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)遺傳性因素在其發(fā)生中起著重要作用。通過分析國內(nèi)外有關(guān)易栓癥的分子遺傳學(xué)研究,總結(jié)遺傳性易栓癥相關(guān)基因特征的研究進(jìn)展,以期為進(jìn)一步的研究提供思路。

1 易栓癥發(fā)病的人群特征

遺傳性易栓癥是一種常染色體顯性遺傳病,群體發(fā)病率約為7%,該病的患者VTE發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)是普通人群的3～20倍[4]。根據(jù)凝血系統(tǒng)和抗凝、纖溶系統(tǒng)不同的生理功能及各自基因突變產(chǎn)生的影響,可將易栓癥的分子遺傳學(xué)因素歸為兩大類:凝血相關(guān)因子和抗凝相關(guān)因子的基因突變或多態(tài)性。其發(fā)病特點(diǎn),有著明顯的種族和地域差異:亞洲人群VTE的患病率為8%～30%,而高加索人群為1%～2%。其中,凝血因子Ⅴ Leiden G1691A 突變(FVL)和凝血因子Ⅱ (FⅡ) G20210A 突變主要見于西方人群,亞洲人群最常見的是抗凝血酶(AT)、蛋白C (PC)、蛋白S (PS)等基因突變[5]。

2 與凝血過程相關(guān)的基因及人群分布特點(diǎn)

人體凝血途徑分為內(nèi)源性和外源性,均是在凝血相關(guān)因子參與下,完成的凝血過程,凝血相關(guān)因子的異常改變將會(huì)對(duì)凝血過程產(chǎn)生重大影響。從分子遺傳學(xué)角度,常見的凝血因子基因突變有FⅤ G1691A突變、FⅡ G20210A 突變等,凝血因子Ⅰ(FⅠ) 、VⅢ(FVⅢ)基因突變也有相關(guān)報(bào)道。此外,亞甲基四氫葉酸還原酶 (MTHFR)的基因多態(tài)性,也會(huì)對(duì)凝血過程產(chǎn)生影響。凝血因子Ⅲ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅹ、Ⅻ及血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(ACE)基因突變,與血栓形成的關(guān)系尚未見有顯著意義的研究成果或觀點(diǎn)尚未形成統(tǒng)一[6]。

2.1 凝血因子

2.1.1 凝血因子Ⅴ:FV是由肝臟產(chǎn)生的一種糖蛋白,為體內(nèi)凝血酶原最主要的激活物,其編碼基因位于1號(hào)染色體長臂2區(qū)3帶(1q23)位點(diǎn)。變異后的FV即FVL,在1 q23染色體上第1691位點(diǎn)DNA核苷酸發(fā)生G→A突變,引起氨基酸序列出現(xiàn) Arg506- Glu改變,抗活化蛋白C (APC)的裂解。這導(dǎo)致凝血酶原片段F1+D-二聚體(D-D)以及其他活化的凝血標(biāo)志物水平升高,表現(xiàn)為輕度血栓形成前狀態(tài),發(fā)生VTE的風(fēng)險(xiǎn)增加了2～5倍,是易栓癥的主要遺傳危險(xiǎn)因素之一[7]。此外,在創(chuàng)傷、手術(shù)、妊娠和激素替代治療的患者中,FVL可能延長住院時(shí)間、增大復(fù)發(fā)可能。FVL突變占遺傳性易栓癥病例的40%～50%,在不同國家和地區(qū)的人群中其發(fā)生率差異較大,在歐美地區(qū)的發(fā)生率高于亞洲、非洲和澳大利亞地區(qū),但FVL突變與地區(qū)的相關(guān)性也不是絕對(duì)的[8]。

2.1.2 凝血因子Ⅱ:FⅡ,即凝血酶原,在凝血過程中被激活形成凝血酶,導(dǎo)致血小板的活化。FⅡG20210A 突變,是指11pl1-11q12 20210位發(fā)生G→A突變,凝血酶原水平增加,引起VTE風(fēng)險(xiǎn)增加約3倍。而同時(shí)存在FⅤ G1691A和FⅡ G20210A突變的攜帶者,VTE風(fēng)險(xiǎn)增加約16倍。FⅡG20210A 突變?cè)谀蠚W常見(3%),北歐次之(1.7%),希族塞人的患病率(7.8%)比歐洲人高2.2倍,而在亞洲和非洲人群中非常罕見[9]。

2.1.3 凝血因子Ⅰ (FⅠ)、Ⅷ (FⅧ):FⅠ(即纖維蛋白原)分子量為340 kD,是由三條對(duì)稱分布的肽鏈(Aα,Bβ,γ)組成的糖蛋白二聚體,其由三個(gè)纖維蛋白原基因(FGA、FGB和FGG)編碼,均位于4q23-4q32。Salomon等[10]研究表明,在FGA 基因中 c.259A>C 突變與易栓癥密切相關(guān)。FⅧ分子量為300 kD,基因定位于Xq28,外顯子數(shù)26。血漿中FⅧ由兩條肽鏈組成,重鏈由A1-A2-B或A1-A2結(jié)構(gòu)域組成,分子量為90～200 kD不等; 輕鏈由A3-C1-C2所組成,分子量為80 kD,二條肽鏈間由Ca2+連接;有研究發(fā)現(xiàn)FⅧ與妊娠早期絨毛膜下血腫(SCH)相關(guān)[11]。凝血因子FⅢ、FⅦ、FⅨ、FⅩ、FⅫ等與血栓形成的關(guān)系目前尚未見有意義的研究成果。

2.2 其他凝血相關(guān)因子 亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)可使高半胱氨酸水平升高,增加VTE風(fēng)險(xiǎn)。其基因位于1p36.3位置,全長20374 kb,共有11個(gè)外顯子,mRNA全長7,150 bp,編碼656個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白,外顯子5和6具有最多的突變[12]。MTHFR催化5,10-亞甲基四氫葉酸還原為5-甲基四氫葉酸,將甲基供體轉(zhuǎn)化為甲硫氨酸的高半胱氨酸。MTHFR基因主要由C677T和A1298C兩個(gè)多態(tài)性變異組成。C677T多態(tài)性位于第4外顯子,密碼子222處的丙氨酸轉(zhuǎn)化為纈氨酸,該區(qū)域是MTHFR輔助因子黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的堿基結(jié)合位點(diǎn)。A1298C多態(tài)性位于第7外顯子,谷氨酸在密碼子429處轉(zhuǎn)化為丙氨酸。MTHFR基因多態(tài)性會(huì)引起其構(gòu)象變化,改變酶的活性[13]。在歐洲,MTHFR C677T等位基因的患病率很高,西西里島和意大利發(fā)病率高達(dá)47.3%和45%,非洲和非裔美國人中C677T等位基因的發(fā)生率(3%)明顯較低[14]。ACE基因突變是指ACE基因內(nèi)含子16的287堿基對(duì)片段的插入(I)或缺失(D)組成的多態(tài)性。導(dǎo)致三種基因型:D/D和I/I純合子和I/D雜合子。ACE是腎素-血管緊張素系統(tǒng)的關(guān)鍵酶,血管緊張素Ⅱ?qū)w溶系統(tǒng)的影響通過增加纖溶酶原激活劑1的水平而實(shí)現(xiàn)。

3 抗凝相關(guān)因子基因及人群分布特點(diǎn)

人體抗凝系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)分別起到抑制凝血過程和清除已形成血栓的作用?？鼓到y(tǒng)中,抗凝血酶Ⅲ(AT-3)、肝素、蛋白C(PC)和組織因子途徑抑制物等物質(zhì)抑制血凝過程。纖溶系統(tǒng)中,纖溶酶可清除纖維蛋白凝塊和血管內(nèi)的血栓,保證血液在血管內(nèi)的暢通。在抗凝系統(tǒng)中,PS、PC、AT占比分別為7.3%、3.2%、0.5%,三者是目前研究最多的抗凝因子,亦是中國人群最主要的遺傳性易栓危險(xiǎn)因素[15]。其中,AT-3與PC基因的突變頻率相當(dāng),PS基因突變較少[16]。此外,血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM) THBD基因突變和狼瘡抗凝物(LA) APOH基因突變也有所報(bào)道。

3.1 蛋白S(PS)相關(guān)基因 PS是一種重要的抗凝血?jiǎng)?也是APC的非酶輔助因子。PS缺乏被定義為低血漿PS水平,其改變與VTE的可變風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)。目前已知的PS基因在人類基因組中共有2個(gè),均定位于 3q11.1-3q11.2:一個(gè)是 PSα 或 PR0S1,具有活性,基因長度約為80 kb,包含15個(gè)外顯子和14個(gè)內(nèi)含子;另一個(gè)是 PSβ 或 PROS2,無活性[17]。 PS主要在肝臟中合成,也可見于血管內(nèi)皮細(xì)胞和血小板α顆粒,是一種維生素K依賴性的抗凝血蛋白,分子量為71 kD,由多個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域組成[18]。PS作為APC的一個(gè)非酶性的輔因子結(jié)合在磷脂表面,能加速APC滅活FⅤ、FⅧ,亦能使凝血酶和FX的活性有所減弱,使APC的抗凝活性增強(qiáng)。PS常以兩種形式存在于血漿中:游離型占40%,具有APC輔因子的活性;無活性的結(jié)合型與經(jīng)典補(bǔ)體途徑中的補(bǔ)體4 結(jié)合蛋白以 1∶1 的比例形成復(fù)合物,約占60%。在我國,約50%VTE患者PS活性降低,但中國人群PS缺乏癥的遺傳學(xué)背景具有明顯的異質(zhì)性,不存在引起易栓癥的優(yōu)勢(shì)變異[4]。

3.2 蛋白C(PC)相關(guān)基因 PC是一種在肝臟中合成的維生素K依賴性抗凝蛋白。凝血酶和血栓調(diào)節(jié)蛋白的復(fù)合物將PC激活為活化PC (APC),APC對(duì)內(nèi)皮表面發(fā)揮重要的抗凝作用。APC及其輔因子PS通過滅活FⅤa和FⅧa抑制凝血酶的生成。健康人PC缺乏癥的發(fā)病率約為0.2%～0.5%,VTE風(fēng)險(xiǎn)增加,凝血控制能力受損。PC的基因位于染色體2q13-2q14上,包括9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子,常見為C6152T突變(位于第7外顯子),其中錯(cuò)義和無義變異最為常見。較為嚴(yán)重的雜合子PC缺乏,可導(dǎo)致新生兒暴發(fā)性紫癜或彌散性血管內(nèi)凝血(DIC)等危及生命的疾病。雜合子PC缺乏可分為兩種類型,Ⅰ型是PC的定量缺陷,抗原水平低和活性降低,占比75%～80%;Ⅱ型是一種定性缺陷,抗原水平正常,但PC活性降低[19]。

遺傳性PC缺乏是公認(rèn)的VTE危險(xiǎn)因素,歐洲人群中PC缺乏癥的患病率約為0.3%。與非攜帶者相比,雜合子的靜脈血栓形成風(fēng)險(xiǎn)增加約7倍。無癥狀PC缺乏癥發(fā)病率為0.2%～0.5%,而有臨床意義的PC缺乏病發(fā)病率約為0.005%[20]。

PC缺乏癥和PS缺乏癥是亞洲VTE患者主要的遺傳性危險(xiǎn)因素,發(fā)病率分別為8.9%～10.7%和10.7%～17.8%,80%～90%的患者發(fā)生DVT或肺栓塞(PE)。中國VTE患者中,PC基因缺陷可能比AT基因缺陷更為普遍。

3.3 抗凝血酶(AT)相關(guān)基因 AT是一種天然抗凝血?jiǎng)?通過共價(jià)結(jié)合凝血酶的活性絲氨酸和活化因子X使凝血酶失活。AT具有肝素結(jié)合位點(diǎn)在結(jié)合肝素后,其抗凝活性明顯增強(qiáng)。遺傳性AT缺乏癥是一種罕見的與VTE相關(guān)的疾病,表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳,其患病率介于0.2%～0.02%之間。

編碼AT-3的SERPINC1基因位于1q25.1,共包含7個(gè)外顯子區(qū)域。該基因?qū)τ谖⑿〉倪z傳缺陷敏感性高,任何錯(cuò)義突變都可能導(dǎo)致其編碼的AT-3缺陷。臨床上根據(jù)對(duì)編碼的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)/功能影響的不同,分為兩型。Ⅰ型:經(jīng)典型缺乏,患者合成AT-3障礙,血漿AT-3抗原和活性均顯著降低超過50%;Ⅱ型:主要影響與凝血酶或肝素結(jié)合的結(jié)構(gòu)域功能,但血漿AT-3抗原含量正常、活性減弱。其中,錯(cuò)義突變及框內(nèi)缺失和插入所引起的基因改變常引起Ⅱ型AT-3缺陷,且編碼功能異常蛋白的含量正常。最近報(bào)道了一種新的雜合錯(cuò)義突變 c.1385G>A (Cys462Tyr),導(dǎo)致279Cys-462Cys二硫鍵斷裂,引發(fā)Ⅰ型遺傳性AT缺陷[21]。

SERPINC1突變?cè)谌毡净颊咧幸延袌?bào)道,且發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的雜合突變(單核苷酸T插入7916和7917處,Glu 272終止于第4外顯子)。在中國VTE患者中,遺傳變異c.881G>T (p.Arg294Leu)和c.883G>A (p.Val295Met)占主導(dǎo)地位[22]。

3.4 血栓調(diào)節(jié)蛋白(TM)相關(guān)基因 TM 基因THBD由1728個(gè)堿基編碼的575個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成,包括1個(gè)疏水的信號(hào)肽序列,1個(gè)凝集素區(qū)域,6個(gè)表皮生長因子 (EGF)區(qū),1個(gè)低度保守連有硫酸軟骨素鏈的絲氨酸蘇氮酸富集區(qū),1個(gè)跨膜區(qū)和1個(gè)胞質(zhì)尾區(qū),無內(nèi)含子存在。EGF4-6結(jié)合凝血酶并活化PC,EGF 5-6片段也可與凝血酶結(jié)合,但復(fù)合物無法激活PC。凝血酶通過氫鍵與EGF4結(jié)合,同時(shí)通過疏水鍵與EGF5結(jié)合,EGF4和EGF5之間通過一個(gè)短環(huán)相連,Met388位于此短環(huán)之中。Met388的突變或氧化導(dǎo)致EGF4和EGF5四級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,導(dǎo)致TM無法與凝血酶或PC正常結(jié)合,造成凝血異常[23]。

研究證實(shí)THBD c.1418C>T多態(tài)性與下肢DVT有關(guān),主要發(fā)生在亞洲人群,THBD c.-151G>T變異引起基因的表達(dá)水平下降,在中國人群易栓癥中也較為常見[24]。

3.5 狼瘡抗凝物(LA)相關(guān)基因 LA在體內(nèi)主要通過抑制生理性抗凝物質(zhì)PC的激活和干擾外周血血栓烷A2和前列環(huán)素的變化,促進(jìn)血栓形成。測(cè)序發(fā)現(xiàn)LA的APOH基因中可編碼β2-糖蛋白I的四個(gè)多態(tài)性c.-32C>A、c.422T>C、c.461G>A 和 c.1004G>C,它們處于高度連鎖不平衡狀態(tài),可能導(dǎo)致三種單倍型,即野生型H1、雜合型H2、純合型H3。 H2和H3導(dǎo)致VTE 風(fēng)險(xiǎn)分別增加了大約1.5倍和7倍[25]。

APOH基因單倍型是LA產(chǎn)生的遺傳易感因素,在中國人群中相關(guān)功能測(cè)試表明,其突變型 β2-糖蛋白I延長凝血酶凝固時(shí)間和增加凝血酶生成潛力的能力顯著降低[25]。

3.6 其 他 組織因子途徑抑制物(TFPI)基因突變,有研究認(rèn)為其P1511 L、C-399 T、T287-C、C536 T等基因突變可導(dǎo)致VTE的發(fā)生,但也有研究表明C-399 T多態(tài)性的出現(xiàn)可能與VTE的發(fā)生沒有明顯的相關(guān)性,甚至T-287C和T-33C等位基因突變可能與降低血栓形成風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)。

4 易栓癥的篩查與基因診斷

易栓癥的篩查常常用到血栓形成試驗(yàn),但會(huì)受到許多生物學(xué)和分析變量的影響,如:急性炎癥狀態(tài)或抗凝期間、暫時(shí)性危險(xiǎn)因素(手術(shù)、創(chuàng)傷或長期靜止等),在上述特殊情況下發(fā)生VTE的患者不進(jìn)行血栓形成試驗(yàn),以避免因假陽性誤診,而使患者接受長期抗凝治療,增加出血風(fēng)險(xiǎn)和醫(yī)療費(fèi)用。大多數(shù)VTE管理指南也建議將易栓篩查限制在特定的臨床場(chǎng)景中,以避免試驗(yàn)結(jié)果的偏差對(duì)抗凝治療決定產(chǎn)生重大影響。因此,迫切需要新的易栓癥篩查方法,基因診斷能避免生物學(xué)和分析變量的影響,在易栓癥的診斷中有著廣泛的應(yīng)用前景。在臨床工作中,可以根據(jù)具體場(chǎng)景,分別或先后給予易栓癥的常規(guī)篩查和基因診斷。

4.1 易栓癥的常規(guī)篩查 通?？梢酝ㄟ^凝血篩選試驗(yàn)、特殊因子檢測(cè)進(jìn)行易栓癥的常規(guī)篩查。凝血篩選試驗(yàn)主要包括活化部分凝血活酶時(shí)間(APTT)、凝血酶原時(shí)間和凝血酶時(shí)間。對(duì)于急性VTE,低、中危險(xiǎn)度血栓可能性患者可聯(lián)合D-D檢測(cè),結(jié)果陰性可排除,陽性則可通過影像學(xué)檢查來進(jìn)一步明確。但D-D檢測(cè)的診斷特異度在陳舊性血栓患者和老年人中較差(14%),不具有排除 VTE 的價(jià)值。特殊因子檢測(cè)主要包括抗凝蛋白檢測(cè)、抗磷脂綜合征相關(guān)檢測(cè)以及其他檢測(cè)如血漿同型半胱氨酸,凝血因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ和纖溶蛋白等。常見有血栓形成試驗(yàn)包括PC、PS和AT缺乏的定性分析;FVL和PT G20210A的基因分型;APLA檢測(cè)(血清抗心磷脂和抗β2糖蛋白I抗體檢測(cè)和狼瘡抗凝劑檢測(cè))。

4.2 易栓癥的基因診斷 VTE 易感基因存在于5%～10%的普通人群和至少 40%的 VTE 患者中,但并非所有易栓癥患者都需要進(jìn)行基因診斷。例如,在靜脈血栓栓塞的急性期,PC/PS/AT水平可能較低,建議此時(shí)不檢查PC/PS/AT水平,除非出現(xiàn)如暴發(fā)性紫癜的新生兒這類特殊情況。另有研究提出,只有當(dāng)難以達(dá)到治療性抗Xa水平時(shí),才應(yīng)檢查AT水平,此外,在做MTHFR基因分析前,首先應(yīng)篩選患者的同型半胱氨酸水平。因此,易栓癥的基因診斷主要針對(duì)需要采取預(yù)防措施的VTE 患者或者是在 VTE 發(fā)生后需要特定或者長期治療的患者。下面是基因診斷流程:①確定候選者:首先,所有首次自發(fā)性 VTE發(fā)作的患者都不是遺傳性易栓癥篩查的候選者。②基因診斷方法:用外周血血細(xì)胞、體液等生物樣本,采用測(cè)序、對(duì)重點(diǎn)候選基因進(jìn)行定量PCR、Sanger等方法進(jìn)行檢測(cè),并對(duì)患者的直系親屬進(jìn)行相同基因突變位點(diǎn)驗(yàn)證。

此外,Delate等使用國際疾病分類第9版(ICD-9),在易栓癥基因的敏感性、特異性、陽性預(yù)測(cè)值(PPV)和陰性預(yù)測(cè)值,以及95%CI方面,產(chǎn)生最高的 PPV(41.5%,95%CI:26.3%～57.9%)和高特異性(95.9%,95%CI:94.0%～97.4%),為易栓癥的基因診斷,提供了更好的理論依據(jù)。

5 展 望

由于凝血過程的瀑布效應(yīng),任何一個(gè)凝血相關(guān)因子的變化都會(huì)使凝血過程發(fā)生幾何級(jí)的改變,未來可通過基因治療藥物對(duì)易栓癥基因進(jìn)行干擾、修復(fù)等,將對(duì)抑制血栓性疾病的發(fā)生具有重要的意義,但目前需要加強(qiáng)易栓癥基因的篩查、診斷和靶向干預(yù)。

易栓癥基因的篩查目前通常是在沒有明確檢測(cè)指征的患者和結(jié)果可能不可靠的時(shí)候進(jìn)行,未來的研究需要找到更好的評(píng)估方式,以減少不利影響。加強(qiáng)對(duì)不同種族和地域人群易栓癥遺傳易感性的調(diào)查研究,可以使患者血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)更加準(zhǔn)確。易栓癥的基因診斷為明確血栓病因提供了科學(xué)依據(jù),但如何精準(zhǔn)高效地開展值得我們深思。隨著二代測(cè)序技術(shù)的日趨成熟,可對(duì)易栓癥相關(guān)基因進(jìn)行突變檢測(cè),使數(shù)據(jù)更加準(zhǔn)確;CNV plex高通量多重基因拷貝數(shù)檢測(cè)技術(shù),使數(shù)據(jù)更加全面;建立易栓癥基因檢測(cè)Panel,使數(shù)據(jù)的獲取更加快速準(zhǔn)確。但由于易栓癥基因涉及凝血、抗凝血、纖溶、抗纖溶等多個(gè)系統(tǒng),建立同時(shí)涵蓋這些基因的高通量測(cè)序技術(shù),并使其能夠全面和精準(zhǔn)地診斷遺傳性易栓癥,將是未來易栓癥基因診斷的發(fā)展趨勢(shì)。