眼表定植菌群分布特征及常見(jiàn)菌耐藥性分析

陳 宇,趙 雅,,王 林

(1.陜西中醫(yī)藥大學(xué),陜西 咸陽(yáng) 712046;2.西安市第一醫(yī)院檢驗(yàn)科,陜西 西安 710002)

眼表是位于上下眼瞼緣灰線(xiàn)之間的眼球表面的全部黏膜上皮,包括角膜上皮、結(jié)膜上皮、淚器、淚道等[1]。眼表本身存在一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的微環(huán)境,能夠刺激機(jī)體啟動(dòng)免疫應(yīng)答對(duì)抗病原菌入侵,成為眼表抗炎防線(xiàn)的主力軍[2]。眼表菌群處在一種動(dòng)態(tài)平衡中,在某些內(nèi)外界因素(包括衰老、佩戴隱形眼鏡、植入角膜假體、局部使用抗生素等)的干擾下,這種平衡狀態(tài)會(huì)被打破,導(dǎo)致定植在眼表的細(xì)菌進(jìn)入眼內(nèi)大量增殖[3],繼而成為感染性眼病的主要病原菌。眼部發(fā)生感染會(huì)給眼球組織帶來(lái)?yè)p傷,損害視覺(jué)功能和嚴(yán)重影響心理健康。因此,明確眼表常見(jiàn)定植菌群分布并且有針對(duì)性的應(yīng)用抗生素對(duì)治療眼部感染至關(guān)重要。本研究收集西安市第一醫(yī)院2021年7月至2022年9月健康體檢人群眼結(jié)膜囊標(biāo)本共93例,通過(guò)對(duì)眼表定植菌群分布特征及常見(jiàn)細(xì)菌抗生素耐藥性進(jìn)行分析,為臨床眼部感染的早期經(jīng)驗(yàn)用藥提供指導(dǎo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取西安市第一醫(yī)院2021年7月至2022年9月93例健康體檢人群作為研究對(duì)象,其中男45例,女48例。納入標(biāo)準(zhǔn):所有研究對(duì)象過(guò)去一個(gè)月未使用抗生素、無(wú)淚道炎、淚囊炎、瞼緣炎等眼部疾病、無(wú)干燥綜合征、糖尿病等影響眼表的全身性疾病;研究對(duì)象對(duì)本研究均知情同意。標(biāo)本由西安市第一醫(yī)院眼科醫(yī)師收集后送至檢驗(yàn)科微生物室進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)、鑒定及體外藥敏試驗(yàn)。

1.2 研究方法

1.2.1 儀器與試劑:基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(德國(guó)布魯克公司),Vitek 2 Compact 全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀(法國(guó)生物梅里埃公司),Vitek 2 配套藥敏卡GP67藥敏板卡(最低抑菌濃度MIC法),37 ℃二氧化碳培養(yǎng)箱,培養(yǎng)基為哥倫比亞血平板、巧克力平板(鄭州安圖公司),聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR)擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司),電泳儀(北京六一儀器廠),Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒(上海生工生物有限公司),2×HieffTM PCR Master Mix(上海翊圣生物科技有限公司),耐藥基因分子檢測(cè)陰性對(duì)照菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923,陽(yáng)性對(duì)照菌株為金黃色葡萄球菌ATCC29213購(gòu)自美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)菌庫(kù)ATCC。

1.2.2 細(xì)菌培養(yǎng)及鑒定:嚴(yán)格遵循《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》操作指導(dǎo),將采集的標(biāo)本接種在哥倫比亞血平板培養(yǎng)基、巧克力瓊脂培養(yǎng)基中,置于35 ℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～72 h。根據(jù)細(xì)菌菌落特點(diǎn)和革蘭染色結(jié)果進(jìn)行初步鑒定,再采用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定。

1.2.3 藥敏試驗(yàn):采用VITEK 2 Compact全自動(dòng)藥敏分析儀進(jìn)行藥敏試驗(yàn),結(jié)果判定嚴(yán)格按照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)執(zhí)行。

1.2.4 mecA基因檢測(cè):將收集凍存的菌株常溫復(fù)蘇,接種于血瓊脂平板上,過(guò)夜孵育。采用生工Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒進(jìn)行DNA提取,引物交由上海生工生物有限公司設(shè)計(jì)合成,上游引物:5’-ACGAAGAATATAATAAATTAACCGAA-3’,下游引物:5’-GATTTGCCAATTAAGTTTGCAT-3’。反應(yīng)體系共20 μl:DNA模板1 μl,上、下游引物各1 μl,Master PCR Mix 10 μl,ddH2O 7 μl。熱循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性20 s,55 ℃退火20 s,72 ℃延伸1 min,共35個(gè)循環(huán);72 ℃終延伸10 min。試驗(yàn)分別采用金黃色葡萄球菌ATCC29213和ATCC25923標(biāo)準(zhǔn)菌株作為陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)2.0%瓊脂糖凝膠100 V電泳30 min,最終在凝膠成像系統(tǒng)上觀察結(jié)果。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,計(jì)數(shù)資料以[例 (%)]表示,采用χ2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 結(jié)膜囊標(biāo)本所分離的細(xì)菌分布和構(gòu)成比 對(duì)93例健康體檢人群結(jié)膜囊標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng),87例培養(yǎng)陽(yáng)性,陽(yáng)性率93.55%,其中39例培養(yǎng)出一種細(xì)菌,剩余48例培養(yǎng)出兩種或兩種以上細(xì)菌。共分離出168株細(xì)菌,G+菌150株(89.29%),G-菌15株(8.93%),真菌3株(1.79%)。具體菌株分布結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 87例眼部結(jié)膜囊標(biāo)本的細(xì)菌分布和構(gòu)成比(n=168)

2.2 主要革蘭陽(yáng)性球菌耐藥情況 所分離的主要凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌、人葡萄球菌)對(duì)多種抗生素呈現(xiàn)出耐藥性,未發(fā)現(xiàn)對(duì)莫西沙星、利福平和萬(wàn)古霉素耐藥的菌株,75株凝固酶陰性葡萄球菌有39株為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(Methicillin-resistant coagulase-negative Staphylococci,MRCoNS),占52.00%(39/75)。主要革蘭陽(yáng)性球菌耐藥情況,見(jiàn)表2。

表2 眼部常見(jiàn)革蘭陽(yáng)性球菌耐藥情況

2.3 MRCoNS與MSCoNS兩組耐藥率比較 MRCoNS對(duì)抗生素的耐藥率明顯高于甲氧西林敏感凝固酶陰性葡萄球菌(Methicillin-susceptible coagulase-negative staphylococci,MSCoNS),其中青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、復(fù)方新諾明五種藥物耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05),見(jiàn)表3。

表3 MRCoNS與MSCoNS耐藥率比較[例(%)]

2.4 眼部和同期其他部位所分離凝固酶陰性葡萄球菌耐藥率比較 統(tǒng)計(jì)藥敏結(jié)果顯示,非眼部所分離的凝固酶陰性葡萄球抗生素耐藥率及MRCoNS所占比例總體高于眼部分離株,兩者耐藥率均較高的抗生素有青霉素、克林霉素和紅霉素。兩組對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物、慶大霉素、復(fù)方新諾明耐藥率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)(均P<0.05)。見(jiàn)表4。

表4 眼部和非眼部葡萄球菌耐藥率比較[例(%)]

2.5 耐藥基因mecA檢測(cè)結(jié)果 耐甲氧西林耐藥基因mecA經(jīng)PCR擴(kuò)增出664 bp大小的DNA片段,對(duì)75株凝固酶陰性葡萄球菌mecA基因進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示40株mecA基因陽(yáng)性,其中39例與Vitek 2 Compact全自動(dòng)細(xì)菌藥敏分析儀苯唑西林耐藥所預(yù)測(cè)的MRCoNS一致,1例與儀器檢測(cè)結(jié)果顯示的苯唑西林敏感不符,符合率為97.5%。剩余35株菌株mecA基因陰性,與儀器所檢測(cè)的苯唑西林敏感均相符。試驗(yàn)所設(shè)立的陰陽(yáng)對(duì)照結(jié)果與預(yù)期一致,耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌mecA耐藥基因PCR產(chǎn)物電泳圖見(jiàn)圖1。

1～4:mecA陽(yáng)性菌株;5:陽(yáng)性對(duì)照;6:陰性對(duì)照

3 討 論

眼表核心微生物群是由凝固酶陰性葡萄球菌、棒狀桿菌、丙酸桿菌等革蘭陽(yáng)性菌為主的多種細(xì)菌共同組成。凝固酶陰性葡萄球菌是定植在人體皮膚黏膜上一種常見(jiàn)的條件致病菌,也是淚囊炎、結(jié)膜炎術(shù)后眼內(nèi)炎等感染性眼病的主要致病菌[4-7]。在本研究中,結(jié)膜囊標(biāo)本培養(yǎng)陽(yáng)性率是93.55%,高于國(guó)內(nèi)外報(bào)道的正常結(jié)膜囊樣本中細(xì)菌檢出率為20.60%～87.00%的水平,造成這種差異可能與培養(yǎng)時(shí)間、納入研究對(duì)象的標(biāo)準(zhǔn)及地理位置不同有關(guān)。在眼部定植菌分布特征方面,我們的研究結(jié)果與國(guó)內(nèi)外其他一些研究結(jié)果基本一致[8-9],葡萄球菌是眼表主要定植菌,革蘭陰性菌在我們的研究結(jié)果中占比較小,以流感嗜血桿菌和不動(dòng)桿菌為主。

隨著新型有效的藥物不斷被推出,供眼科醫(yī)師治療眼表疾病時(shí)可選擇的藥物種類(lèi)也相應(yīng)增加,但由于多重耐藥菌株在全球范圍內(nèi)普遍流行[10],這可能會(huì)降低抗生素治療感染性眼病的有效性[11]。我們的藥敏結(jié)果提示眼部凝固酶陰性葡萄球菌(表皮葡萄球菌和人葡萄球菌)對(duì)青霉素、苯唑西林、紅霉素、克林霉素的耐藥率均超過(guò)50.00%,對(duì)眼科常用藥物環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和復(fù)方新諾明的耐藥率在20%左右。同時(shí)對(duì)不同部位所分離的凝固酶陰性葡萄球菌耐藥率進(jìn)行比較,非眼部葡萄球菌對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物的耐藥率遠(yuǎn)高于眼部且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。有關(guān)細(xì)菌耐藥性的報(bào)道在不同地區(qū)差異性比較大,這可能與用藥習(xí)慣和生活環(huán)境有關(guān)。例如,有研究[12-14]報(bào)道,葡萄球菌對(duì)左氧氟沙星、環(huán)丙沙星和莫西沙星的敏感率低,Laura 等[12]報(bào)道中指出,葡萄球菌對(duì)甲氧西林和紅霉素的耐藥率較高。本研究未發(fā)現(xiàn)眼部凝固酶陰性葡萄球菌對(duì)莫西沙星、利福平和萬(wàn)古霉素耐藥,這提示眼科醫(yī)師優(yōu)先使用這些藥物治療凝固酶陰性葡萄球菌引起的眼部感染可能會(huì)有比較理想的治療效果。目前,雖還未有眼部分離出耐萬(wàn)古霉素葡萄球菌的報(bào)道[15-18],但隨著高級(jí)別抗生素在臨床上的使用越來(lái)越多,不免使我們對(duì)萬(wàn)古霉素治療效果產(chǎn)生擔(dān)憂(yōu),這需引起臨床醫(yī)師的足夠重視,按照藥敏結(jié)果合理選擇藥物。

有文獻(xiàn)[15]指出,MRCoNS菌株會(huì)明顯增加葡萄球菌對(duì)其他抗生素的耐藥性。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)MRCoNS組對(duì)抗生素的耐藥率明顯高于MSCoNS組,其中青霉素、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、克林霉素、復(fù)方新諾明五種藥物耐藥性比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05)。MRS耐藥機(jī)制多由mecA基因介導(dǎo),其基因表達(dá)產(chǎn)物是低親和力的青霉素結(jié)合蛋白2a,會(huì)降低與β-內(nèi)酰胺類(lèi)藥物的親和力(五代頭孢菌素除外),由它引起的眼部感染除增加治療難度外也可能會(huì)導(dǎo)致患者預(yù)后不良,同時(shí)此類(lèi)細(xì)菌易在院內(nèi)進(jìn)行傳播,也是院感重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的耐藥菌[19]。我們研究中采用的PCR檢測(cè)mecA基因和VITEK 2 Compact儀器法對(duì)MRCoNS苯唑西林耐藥性預(yù)測(cè)的結(jié)果符合率是97.5%,其中1例mecA基因陽(yáng)性菌株經(jīng)儀器檢測(cè)顯示對(duì)苯唑西林敏感,這可能與苯唑西林是誘導(dǎo)mecA基因表達(dá)的一種弱誘導(dǎo)劑以及mecA第二啟動(dòng)子的錯(cuò)義突變和單一突變有關(guān)[20],當(dāng)“隱形”MRCoNS接觸到β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素時(shí),便可能轉(zhuǎn)變?yōu)楦叨饶退幘?所以將檢測(cè)耐藥表型和mecA基因或青霉素結(jié)合蛋白2a的方法聯(lián)合起來(lái)對(duì)篩選或鑒定耐甲氧西林葡萄球菌尤為重要。

綜上所述,G+球菌為眼表的主要定植菌,其中凝固酶陰性葡萄球菌為主要優(yōu)勢(shì)菌,我們應(yīng)加強(qiáng)對(duì)葡萄球菌特別是MRS耐藥性的監(jiān)測(cè),指導(dǎo)臨床根據(jù)藥敏結(jié)果合理規(guī)范使用抗生素。