禽源食品中沙門菌現(xiàn)場檢測方法的研究進(jìn)展

張 帥,江海洋

(中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院獸醫(yī)公共衛(wèi)生安全全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 海淀 100193)

沙門菌是自然界中普遍存在的一種食源性致病菌,是重要的人獸共患病原菌之一[1]。因飲食習(xí)慣等因素,西方人感染的食源性致病菌中以沙門菌最為常見,其中50%～75%的媒介是加工不完全的肉、蛋等動(dòng)物源性食品產(chǎn)品[2]。沙門菌血清型眾多,Chen等[3]的報(bào)道顯示,與人類、動(dòng)物、鳥類、嚙齒動(dòng)物和爬行動(dòng)物相關(guān)的沙門菌的血清型已經(jīng)超過2 500種。明確常見的禽沙門菌血清型對于檢測來說至關(guān)重要。禽源食品中報(bào)道較為頻繁的沙門菌血清型有鼠傷寒沙門菌、腸炎沙門菌和雞白痢沙門菌,近期報(bào)道的還有海德堡沙門菌、肯塔基沙門菌、嬰兒沙門菌和印第安納沙門菌[4]。

據(jù)測算,我國每年因食用雞肉導(dǎo)致的沙門菌食物中毒的發(fā)病人數(shù)達(dá)300多萬人次,其中近半數(shù)與生雞肉的交叉污染有關(guān);我國居民廚房案板生熟分開的比例低(不足三成),未生熟分開的居民僅有半數(shù)用消毒劑清洗案板;用消毒劑清洗案板,發(fā)病人數(shù)可降低120萬人次[5]。同樣,使用清洗劑和消毒劑可以降低蛋殼表面細(xì)菌污染水平,但是消毒劑會造成另外的食品安全問題,或者使生產(chǎn)成本增加[6]。目前,我國國家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,肉制品和即食用蛋制品中不允許檢出沙門菌[7]。沙門菌檢測方法的“金標(biāo)準(zhǔn)”是傳統(tǒng)的生化培養(yǎng)法,檢測步驟為預(yù)增菌、增菌、分離、生化試驗(yàn)和血清型鑒定5個(gè)步驟,此法是所有檢測方法所得結(jié)果是否準(zhǔn)確的參照,但從采樣到出結(jié)果需要36 h甚至更長時(shí)間,不能滿足食品安全快速檢測的需求[8,9]。

要達(dá)到防止污染擴(kuò)大化的目的,需要進(jìn)行現(xiàn)場實(shí)時(shí)檢測,及時(shí)確定被沙門菌污染的食品和批次并采取相關(guān)措施。本文就近年來新發(fā)展的適用于現(xiàn)場檢測禽源食品中沙門菌的方法和技術(shù)進(jìn)行綜述,并探討食源性致病菌動(dòng)態(tài)監(jiān)測體系的建設(shè)和發(fā)展。

1 禽源食品感染沙門菌現(xiàn)狀

近年來,沙門菌引起的人類群體感染事件依舊頻發(fā)。在美國,僅2021年就發(fā)生多起沙門菌感染事件,其中因冷凍裹雞粉中存在腸炎沙門菌,導(dǎo)致36人感染,11人住院;因使用被沙門菌污染的火雞粉導(dǎo)致33人感染,4人住院[10]。2015年以來,我國每年因沙門菌導(dǎo)致的食物中毒發(fā)病人數(shù)約達(dá)300萬人次,其中近半數(shù)與生雞肉交叉污染有關(guān)[11]。

相對于其他食物種類,家禽導(dǎo)致的沙門菌感染病例約占19.0%,雞蛋約占14.8%[12]。因?yàn)轱曫B(yǎng)成本低且可以供食新鮮的蛋和肉,散養(yǎng)家禽普遍存在,其帶來的污染風(fēng)險(xiǎn)不能忽視。沙門菌可通過多種媒介污染家禽,包括嚙齒動(dòng)物、貓和昆蟲以及受污染的垃圾[13,14],散養(yǎng)雞因缺乏管理,會接觸到這些媒介,處理不當(dāng)就會感染人類。除了養(yǎng)殖源頭,在家禽屠宰和運(yùn)輸過程中,沙門菌也會感染肉和蛋。

2 可用于現(xiàn)場檢測禽源食品中沙門菌的方法

2.1 基于分子生物學(xué)的快速檢測 以分子生物學(xué)技術(shù)為基礎(chǔ)的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase chain reaction,PCR),通過對不同血清型沙門菌的DNA保守序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增,產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳,可根據(jù)電泳條帶進(jìn)行結(jié)果判定。在PCR技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展形成了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP),其不僅具備PCR技術(shù)的高靈敏度和高特異性,而且反應(yīng)條件溫和,可以相對減少沙門菌增菌培養(yǎng)時(shí)間,更易實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場檢測。

Priya等[15]研究了一種基于LAMP的產(chǎn)物顯色測定法,可以用于目視檢測沙門菌擴(kuò)增產(chǎn)物,在沒有任何富集的情況下檢測限為 0.9 CFU/g。Hu等[16]開發(fā)了一種針對腸炎沙門菌特異性基因的擴(kuò)增檢測方法,使用 Genie Ⅲ小型儀器約35 min即可獲得擴(kuò)增曲線和結(jié)果。Zhang等[17]研究了通用接頭PCR觸發(fā)的鏈置換擴(kuò)增反應(yīng),建立了一種靈敏度高且可視化的鼠傷寒沙門菌檢測方法,恒溫?cái)U(kuò)增后直接顯色,肉眼即可判定結(jié)果,無需電泳,節(jié)省時(shí)間。因分子生物學(xué)檢測方法靈敏度高,若能結(jié)合有效的DNA提取方法,即可進(jìn)行現(xiàn)場檢測。Antonia等[18]建立了一種簡化的 DNA 分離方法,適用于在現(xiàn)場快速提取細(xì)菌DNA,可與上述方法結(jié)合使用,實(shí)現(xiàn)沙門菌的現(xiàn)場檢測。

2.2 基于免疫學(xué)的快速檢測 在食源性微生物的檢測中,通過抗原和抗體特異性結(jié)合的快速檢測方法被廣泛研究和應(yīng)用,主要的檢測方法是酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)和側(cè)流免疫層析(Lateral flow immunoassay,LFIA),因其操作簡單、不使用復(fù)雜儀器的特點(diǎn),更適用于快速檢測。但是,傳統(tǒng)免疫學(xué)檢測方法對食源性致病菌的靈敏度低,為了保持良好的特異性和穩(wěn)定性,需要不斷提高和優(yōu)化抗體的質(zhì)量和試驗(yàn)溶液體系。近年來,也有很多在此基礎(chǔ)上對沙門菌進(jìn)行快速檢測的研究,主要目的是提高檢測的靈敏度。

Gao等[19]應(yīng)用脲酶的誘導(dǎo)作用形成銀殼沉積在金納米粒子表面,以改進(jìn)ELISA的比色速率,快速靈敏地檢測沙門菌,檢測限達(dá)到1.21×102CFU/mL。Wu等[20]制備了鼠傷寒沙門菌單克隆抗體1B4,以此為基礎(chǔ)開發(fā)的膠體金免疫層析試紙條對鼠傷寒沙門菌檢測的視覺靈敏度達(dá)4×105CFU/mL。Ren等[21]研發(fā)了一種可用于現(xiàn)場快速檢測腸炎沙門菌和鼠傷寒沙門菌的測流層析方法,其中鹽誘導(dǎo)聚集的金納米粒子作為信號探針用于信號放大,以改善T線的敏感性和特異性,可在 14 min內(nèi)完成檢測,其視覺靈敏度為1×103CFU/mL。

2.3 基于生物傳感器的快速檢測 近年來,生物傳感器被廣泛應(yīng)用于快速檢測食源性致病菌。生物傳感器是將生物信號和物理或化學(xué)換能器結(jié)合并轉(zhuǎn)化為可以監(jiān)測信號的一類裝置,其靈敏度高,體積小。對于沙門菌的檢測主要是以抗原抗體或核酸適配體的特異性識別為基礎(chǔ),將生物信號放大并轉(zhuǎn)化為光、電信號,通過建立信號強(qiáng)度與沙門菌濃度之間的關(guān)系判斷檢測結(jié)果,達(dá)到檢測的目的[22]。

Jiang等[23]開發(fā)了一種帶有自驅(qū)動(dòng)聚對苯二甲酸乙二醇酯芯片的便攜式印跡電化學(xué)傳感器,用于快速檢測沙門菌,帶有虹吸管入口的芯片與反應(yīng)室連接,經(jīng)過創(chuàng)新設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)自驅(qū)動(dòng)進(jìn)樣和檢測,檢測限為100 CFU/mL,可在 20 min內(nèi)檢測出沙門菌,可應(yīng)用于現(xiàn)場監(jiān)測食品加工過程和食品流通過程中的沙門菌污染。Qi等[24]開發(fā)了一種微流體生物傳感器,將混合、分離、標(biāo)記和檢測集成到單個(gè)微流控芯片上,使用具有酶活性的金屬有機(jī)框架和樹莓派(Raspberry Pi,RPi)來放大并分析生物信號,檢測雞肉中的鼠傷寒沙門菌,檢測限為 14 CFU/mL,這種生物傳感器有自動(dòng)化程度高、反應(yīng)速度快、所用試劑少和體積小等優(yōu)點(diǎn),有望用于食源性細(xì)菌的現(xiàn)場檢測。Yin等[25]的研究將沙門菌特異性invA基因在規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù)-核酸酶(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats-Cas12a,CRISPR-Cas12a)系統(tǒng)作用下形成脫氧核酶,可以在氯化血紅素存在下催化四甲基聯(lián)苯胺氧(Trimethylbenzene,TMB)反應(yīng),產(chǎn)物在 454 nm 處的吸光度增加而發(fā)生顏色變化,該生物傳感器結(jié)合智能手機(jī)比色測定,可對沙門菌進(jìn)行超靈敏檢測,檢測限為1 CFU/mL,是用于病原菌即時(shí)檢測的新設(shè)計(jì)。

3 總結(jié)與展望

對于禽源食品中沙門菌的檢測,在注重快速的同時(shí),還要強(qiáng)調(diào)現(xiàn)場檢測技術(shù)。無論是養(yǎng)殖場還是商場超市,只要能現(xiàn)場取樣進(jìn)行快速檢測并出具結(jié)果,就可以在感染早期控制擴(kuò)散,降低損失。而且,現(xiàn)場檢測可以最大限度保持樣本的原始性,可以從食品源頭控制沙門菌污染,減小運(yùn)輸過程中帶來的不可控感染,使檢測結(jié)果更準(zhǔn)確。

極少量的食源性致病菌經(jīng)過繁殖后才會引起相關(guān)疾病,為快速準(zhǔn)確地檢測活菌,檢測前的增菌是必要的,其也是整個(gè)檢測過程中最耗時(shí)的一步?，F(xiàn)場檢測時(shí),沙門菌存在于復(fù)雜的基質(zhì)中,增菌后將其從蛋白質(zhì)、脂肪和非目標(biāo)菌中準(zhǔn)確的甄別和捕獲頗有難度。高效率的富集和捕獲樣品前處理方法可以縮短增菌時(shí)間。若沒有樣本前處理方法可以有效解決增菌或者富集問題,下游的檢測技術(shù)將無法更好地發(fā)揮作用。Wang 等[26]研究發(fā)現(xiàn),碳點(diǎn)-適配體復(fù)合物可作為一種新型熒光探針,用于定量檢測雞蛋樣品和自來水樣品中的鼠傷寒沙門菌,檢測限為50 CFU/mL,無需任何樣品富集過程,適用于現(xiàn)場檢測。Du[27]等開發(fā)了一種基于原位富集培養(yǎng)的有效預(yù)處理方法,大大減少了增菌時(shí)間,結(jié)合液滴數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)實(shí)現(xiàn)快速檢測痕量沙門菌,可檢測出低至 10-1CFU/mL 水平的沙門菌,用8 h完成包括前處理在內(nèi)的整個(gè)檢測過程。

Aliakbar Ahovan等[28]總結(jié)了微生物檢測的理想化狀態(tài),即需要較短的分析時(shí)間(最好小于1 h),最少的操作技能,較高的穩(wěn)定性,可檢測單個(gè)細(xì)菌,可區(qū)分活細(xì)胞和死細(xì)胞,沒有非特異性,不需要任何富集過程,若應(yīng)用于實(shí)際環(huán)境檢測,還需控制檢測成本。目前,我國對于禽肉原料中沙門菌的限量沒有明確規(guī)定,但是,禽肉在禽養(yǎng)殖場、運(yùn)輸、加工、儲存和售賣等環(huán)節(jié)都有被沙門菌污染的風(fēng)險(xiǎn),而且這些過程相當(dāng)復(fù)雜,需要在每個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行現(xiàn)場檢測和監(jiān)控,以防控代替治療,大大降低養(yǎng)殖成本并減小損失。目前來看,需要整合各方面的研究成果,獲得更高效的樣品前處理方法,結(jié)合具有良好性能的生物傳感器,形成靈敏且智能的檢測終端,結(jié)合大數(shù)據(jù)的分析系統(tǒng)和預(yù)警系統(tǒng)形成智能化檢測體系,從養(yǎng)殖源頭到餐桌全鏈條的每個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測,對沙門菌在禽源食品中的污染進(jìn)行有效的防控。