殼聚糖/BMP-2質(zhì)粒溫敏水凝膠復(fù)合體促犬牙槽骨再生的研究

李慧?吉秋霞

【摘要】目的 進(jìn)行殼聚糖/BMP-2質(zhì)粒溫敏水凝膠復(fù)合體系CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP的構(gòu)建，對(duì)犬牙槽骨再生中此復(fù)合體系的作用進(jìn)行分析。方法 將4只比格犬第2、3前磨牙建立牙周炎模型，實(shí)驗(yàn)牙齒隨機(jī)劃分為3組：CS/CSn-GP組、CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組、空白對(duì)照組。CS/CSn-GP組注入不含BMP-2的殼聚糖水凝膠復(fù)合體（CS/CSn-GP）；CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組注入殼聚糖/BMP-2質(zhì)粒溫敏水凝膠復(fù)合體CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP，空白對(duì)照組不注入任何材料。8周后處死，采用Masson染色法觀察牙周炎部位牙槽骨再生狀況；鈣鈷法觀察骨缺損部位堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)狀況。結(jié)果 Masson染色顯示CS/CSn-GP組與CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組，均有不同程度的牙槽骨再生，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組再生顯著；鈣鈷法顯示CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組ALP強(qiáng)陽(yáng)性，CS/CSn-GP組ALP弱陽(yáng)性，空白對(duì)照組為陰性。3組ALP陽(yáng)性部位著色的平均光密度值比較，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組 > CS/CSn-GP組>空白對(duì)照組，兩兩比較P均﹤0.05。結(jié)論 CS/CSn-GP復(fù)合修復(fù)體系對(duì)牙槽骨再生有著積極影響，包載pDNA-BMP-2后，有著更顯著的促牙槽骨再生作用。

【關(guān)鍵詞】牙周炎；殼聚糖納米粒；組織工程支架；骨形態(tài)蛋白2；溫敏水凝膠

The promoting effect of chitosan thermosensitive hydrogel complex with chitosan nanoparticles carrying BMP-2 plasmid DNA on alveolar bone regeneration in beagle dogs Li Hui△， Ji Qiuxia. △Department of Stomatology， Beijing Friendship Hospital， Capital Medical University， Beijing 100000， China

Corresponding author， Ji Qiuxia， E-mail： jqx_1@163.com

【Abstract】Objective To construct the chitosan/BMP-2 plasmid thermosensitive hydrogel complex CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP，and evaluate the effect of this composite system on alveolar bone regeneration in beagle dogs. Methods Periodontitis models were established in the second and third premolars from 4 beagle dogs. All teeth were randomly divided into three groups： CS/CSn-GP group，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group and blank control group. In the CS/CSn-GP group，CS/CSn-GP was injected. In the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP was injected. In the blank control group，no material was injected. All animals were sacrificed 8 weeks later. The alveolar bone regeneration in periodontitis was observed by Masson staining. The expression of alkaline phosphatase （ALP） in bone defects was observed by calcium and cobalt staining. Results Masson staining showed that different degrees of alveolar bone regeneration was noted in the CS/CSN-GP and CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP groups，and significant regeneration was noted in the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group. Calcium and cobalt staining revealed strongly-positive ALP in the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group，weakly-positive ALP in the CS/ CSN-GP group，and negative result in the blank control group. The average optical density value in the ALP-positive staining area in the CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP group was higher than that in the CS/CSn-GP group，followed by that in the blank control group（all P < 0.05）. Conclusions CS/CSn-GP composite repair system exerts positive effect on alveolar bone regeneration. Inclusion of pDNA-BMP2 can significantly promote the effect on alveolar bone regeneration.

【Key words】Periodontitis； Chitosan nanoparticle； Tissue engineering scaffold； BMP-2； Thermosensitive hydrogel

牙周病作為成人缺牙的主要原因，主要是指由牙周致病菌感染所引起的，發(fā)生在牙周支持組織的慢性細(xì)菌性感染性疾病，在全球范圍內(nèi)普遍存在［1-4］。牙周病導(dǎo)致的口腔內(nèi)微生物穩(wěn)態(tài)的破壞，還可能增加各種全身疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，例如類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、心肌梗死和阿爾茨海默病等［5-8］。因此，有效治療牙周炎并促進(jìn)牙周組織再生對(duì)人類(lèi)健康至關(guān)重要。傳統(tǒng)的牙周治療包括基礎(chǔ)治療、手術(shù)治療、全身和局部施用抗生素等，在恢復(fù)牙周組織的生理結(jié)構(gòu)和功能上，受主動(dòng)誘導(dǎo)組織再生修復(fù)能力缺失的影響，均無(wú)法實(shí)現(xiàn)理想的牙槽骨再生效果［9］。在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、組織工程技術(shù)有著更深入研究的背景下，在促進(jìn)牙槽骨再生方面，聯(lián)合使用組織工程和基因靶向治療及干細(xì)胞歸巢技術(shù)廣受期望。本研究擬構(gòu)建殼聚糖/BMP-2質(zhì)粒溫敏水凝膠復(fù)合修復(fù)體系CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP，研究該復(fù)合體系在犬牙槽骨再生中的作用。

材料與方法

一、材 料

1. 動(dòng) 物

4只29月齡比格犬，體質(zhì)量15～16 kg，購(gòu)自青島博隆實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

2. 試劑與儀器

三聚磷酸鈉（TPP，醫(yī)藥級(jí)，含量99％）購(gòu)自上海精細(xì)化工材料研究所；pDNA-BMP2購(gòu)自青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院中心實(shí)驗(yàn)室；多聚甲醛粉、α，β-GP（分析純）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；殼聚糖（醫(yī)級(jí)，脫乙酰度90%）購(gòu)自桓臺(tái)縣金湖甲殼制品有限公司；SM2000R型病理組織切片機(jī)（Leica Biosystems，德國(guó)）。本研究已獲得青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

二、方 法

1. CS/CSn-GP支架與CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合支架的制備

①稱(chēng)取0.1 g CS，用0.1 mol/L乙酸定容至100 mL，攪拌1 h，得到1 mg/mL的CS溶液。②稱(chēng)取0.1 g的TPP，用三蒸水定容至100 mL，得到1 mg/mL 的TPP溶液。③吸取0.5 mL的TPP（aq）和5 mL的CS（aq），質(zhì)量比為1∶10，進(jìn)行攪拌，時(shí)長(zhǎng)為0.5 h，然后進(jìn)行5 min超聲震蕩，靜置15 min，進(jìn)行過(guò)濾處理，獲得無(wú)菌CSn溶液。④取1 μL pDNA-BMP2與10 μL CSn加入Eppendorf管中，室溫下均勻漩渦30 s，即可制備成N/P等于5∶1的CSn （pDNA-BMP2）。⑤取0.2 g CS，加入8 mL的0.1 mol/L乙酸，

使用磁力攪拌器進(jìn)行攪拌，持續(xù)時(shí)長(zhǎng)為2 h，待充分溶解后進(jìn)行除雜，過(guò)濾，使用高壓蒸汽進(jìn)行滅菌（設(shè)置的條件為121 ℃，10 min），置入4 ℃冰箱保存；使用2 mL雙蒸水溶解0.56 g α，β-GP，而后磁力攪拌器持續(xù)攪拌5min至充分溶解，使用濾膜（孔徑為0.22 μm）過(guò)濾后，在4 ℃冰箱中保存濾液。對(duì)以上兩種溶液，進(jìn)行15 min的冰浴，然后以2∶8的比例，在CS溶液中逐滴加入α，β-GP與CS溶液，并進(jìn)行10 min的持續(xù)攪拌，就能夠獲得質(zhì)量濃度為2%的CS溶液和5.6%質(zhì)量濃度的α，β-GP凝膠溶液。溶膠經(jīng)37 ℃的恒溫水浴后，轉(zhuǎn)變?yōu)槟z，形成Cs/α，β-GP溫敏水凝膠。⑥取適量CS/CSn（pDNA-BMP2），加入Cs/α，β-GP溫敏水凝膠中，進(jìn)行磁力攪拌，使得納米粒能夠均勻散布，從而實(shí)現(xiàn)CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體系的制備。⑦使用等量的去離子水，替代以上制備中使用的pDNA-BMP2，不變動(dòng)其他步驟，就可實(shí)現(xiàn)CS/CSn-GP復(fù)合修復(fù)體系的制備。

2. CS/CSn-GP復(fù)合支架系統(tǒng)及CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系的性質(zhì)檢測(cè)

掃描電鏡觀察：取少量的CS/CSn-GP溶液真空噴金，對(duì)表面形態(tài)進(jìn)行檢測(cè)并拍照。

溫敏性測(cè)定：制備CS/CSn-GP復(fù)合支架系統(tǒng)及CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系，采用試管倒置法檢測(cè)水凝膠在室溫37 ℃時(shí)的溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變。

3. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的建立及分組

根據(jù)Kim等［10］建模方法建立第二、三前磨牙牙周炎模型。從4只比格犬第二、三前磨牙（共32顆牙，16象限）選取15個(gè)象限的30顆牙齒隨機(jī)分成3組：每個(gè)象限內(nèi)牙齒為同一組，每組包含5個(gè)象限的10顆牙齒，A組為CS/CSn （pDNA-BMP2） -

GP組（n=10），B組為CS/CSn-GP組（n=10），C組為空白對(duì)照組（n=10）。實(shí)驗(yàn)使用的各種器械進(jìn)行高壓消毒，動(dòng)物稱(chēng)重后，速眠新Ⅱ 0.4～0.8 mg/kg肌注麻醉。對(duì)口內(nèi)、口外使用碘酊進(jìn)行消毒，鋪無(wú)菌巾，對(duì)實(shí)驗(yàn)牙行翻瓣術(shù)，翻開(kāi)黏膜骨膜瓣至前庭溝，對(duì)根面作平整處理，對(duì)殘留肉芽組織進(jìn)行去除，結(jié)合分組的差異，置入相應(yīng)材料。A組注入CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合體，B組注入CS/CSn-GP復(fù)合體，C組作為空白對(duì)照組僅做手術(shù)，不注入任何修復(fù)材料，組織瓣冠向復(fù)位，以4-0號(hào)線(xiàn)縫合。在術(shù)后5 d內(nèi)，連續(xù)肌注青霉素2×106單位，以避免發(fā)生感染；流質(zhì)軟食喂養(yǎng)1周，以避免術(shù)區(qū)受到咬合力的影響。術(shù)后8周，處死實(shí)驗(yàn)犬，取頜骨，標(biāo)本分切，常規(guī)4%多聚甲醛固定。行Masson染色觀察新生骨組織。行鈣鈷法測(cè)定ALP強(qiáng)度表達(dá)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。正態(tài)分布定量資料用表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD法。α=0.05（雙側(cè)）。

結(jié)果

一、掃描電鏡觀察

掃描電鏡（圖1）可見(jiàn)，CSn納米粒為規(guī)則球形，在復(fù)合體系中分散性好。

二、溫敏性測(cè)定

CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變速率與溫度、時(shí)間的關(guān)系見(jiàn)表1。在25 ℃下，CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系可長(zhǎng)時(shí)間保持溶膠狀，而在37 ℃下，3 min內(nèi)就能夠向凝膠狀轉(zhuǎn)變。

試管倒置法測(cè)定CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP合修復(fù)體系溶膠-凝膠轉(zhuǎn)變的實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。在25 ℃下，CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系可長(zhǎng)時(shí)間保持溶膠狀，在37 ℃下，能夠向凝膠狀轉(zhuǎn)變（圖2B、D）。

三、Masson染色結(jié)果

Masson染色結(jié)果見(jiàn)圖3。CS/CSn（pDNA-BMP2）-

GP組（圖3A）具有更多的新生骨（NB）、新生牙周膜（PDL）。平行排列的新生沙比纖維（SF）插入新生牙槽骨內(nèi)。而CS/CSn-GP組（圖3B）只見(jiàn)少量NB形成，及少量的SF，空白對(duì)照組（圖3C）只見(jiàn)極少NB生成，SF極少。

NB及PDL高度統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖4。CS/CSn（pDNA-

BMP2）-GP組NB高度最高，CS/CSn-GP組次之，空白對(duì)照組最低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05）。CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組與CS/

CSn-GP組PDL高度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P > 0.05），而2組與空白對(duì)照組相比，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.01）。

四、ALP活性測(cè)定

鈣鈷法染色結(jié)果見(jiàn)圖5。ALP陽(yáng)性部位被染為深棕色或黑色，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP組（圖5A）與CS/CSn-GP組（圖5B）同空白對(duì)照組（圖5C）相比較，ALP陽(yáng)性部位有著更明顯的著色。CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 組與CS/CSn-GP組相比較，ALP陽(yáng)性部位有著更明顯的著色，呈深棕黑色。

3組ALP陽(yáng)性部位的平均光密度（AOD）統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)圖6。結(jié)果表明：CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 組最高，CS/CSn-GP組次之，空白對(duì)照組最低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

討論

在組織再生領(lǐng)域內(nèi)，可原位注射和生物降解的溫敏水凝膠應(yīng)用非常廣泛［11］。它主要有以下優(yōu)點(diǎn)：第一，溫敏水凝膠在室溫狀態(tài)下為穩(wěn)定流體狀，而在機(jī)體體溫下，水凝膠會(huì)由流體變?yōu)槟z體。故而，在局部治療中，只需要利用注射器就能夠向病變位置進(jìn)行溫敏水凝膠的靶向注入，無(wú)需進(jìn)行手術(shù)，使得手術(shù)創(chuàng)傷能夠盡可能地減輕，讓患者獲得更好的舒適度和接受度。第二，對(duì)注射型生物材料尤為重要的是，流體狀的溫敏水凝膠能夠隨著注射位置的變化而形成不定形水凝膠，從而避免受形狀不規(guī)則的影響發(fā)生機(jī)體損傷。第三，載藥性溫敏水凝膠能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)藥物的持續(xù)緩釋?zhuān)恢皇窃诟纳扑幬锊涣挤磻?yīng)及減少給藥次數(shù)上有積極效果，對(duì)提升治療靶向性、改善患者的舒適度等也有著積極作用。在組織工程技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展的背景下，在基因傳遞載體的研究中，納米粒的研究是熱點(diǎn)。作為天然的陽(yáng)離子多糖，殼聚糖的生物相容性良好，可與DNA有效結(jié)合，對(duì)DNA能夠起到保護(hù)作用，以免被核酸酶降解，故而是非病毒基因傳遞的理想載體之一［12-14］。殼聚糖納米粒的制備，可運(yùn)用的方法較多，具體有共價(jià)交聯(lián)法、乳化交聯(lián)法、離子交聯(lián)法、去溶劑法、大分子復(fù)合法［15-16］。其中，離子交聯(lián)法采用TPP交聯(lián)劑對(duì)殼聚糖進(jìn)行離子誘導(dǎo)，進(jìn)行殼聚糖納米粒的制備。離子交聯(lián)法在室溫條件下就可實(shí)現(xiàn)，具有較好的可行性，反應(yīng)條件溫和，不需要使用到有機(jī)溶劑，制備出的納米粒在粒徑上可調(diào)且尺寸均一，是最多使用到的一種制備方法［17］。在本研究中，采用離子交聯(lián)法制備CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系。

骨組織工程的構(gòu)成三要素是生長(zhǎng)因子、細(xì)胞和支架。其中，生長(zhǎng)因子和支架有著重要作用。作為骨缺損修復(fù)治療應(yīng)用的一種新方法，骨組織工程在臨床上也獲得應(yīng)用。BMP2在體內(nèi)誘導(dǎo)中體現(xiàn)出強(qiáng)大的作用，已被看作是有著最強(qiáng)大骨誘導(dǎo)能力的一種生長(zhǎng)因子，也是可單獨(dú)誘導(dǎo)骨組織形成的僅有的一種局部生長(zhǎng)因子［18］。但因其極易被降解和變性的特點(diǎn)，目前臨床應(yīng)用較為局限。納米微球（NPs）的顯著特征是表面積大、直徑小，能夠?yàn)樗幬锿黄粕锲琳霞按┩讣?xì)胞膜并積聚至目標(biāo)位置帶來(lái)幫助，使得藥物具有更高的利用率及更強(qiáng)的靶向作用，故而在藥物輸送系統(tǒng)中有著良好作用［19-20］。

采用試管倒置法對(duì)CS/CSn-GP和CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系溫敏性進(jìn)行檢測(cè)表明，在25 ℃下，兩者均為溶膠狀，而在37 ℃下，3 min內(nèi)兩者就能夠向凝膠狀轉(zhuǎn)變。反映出CS/CSn-GP復(fù)合支架的溫敏性良好，而CSn（pDNA-BMP2）的加入對(duì)溫敏性并不存在影響。殼聚糖具有的矩陣結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞增殖具有積極影響，能夠使得細(xì)胞微環(huán)境中殼聚糖的濃度保持在較高水平，從而使得基因的表達(dá)獲得延長(zhǎng)，并使得基因治療具有更好效果［21］。如果CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系由溶液變成水凝膠，常規(guī)孔和多孔結(jié)會(huì)構(gòu)成交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)。水凝膠顯現(xiàn)出的形態(tài)特征，對(duì)水和小分子的自由移動(dòng)是有利的。掃描電鏡顯示，在支架中CSn（pDNA-BMP2）呈均布狀，并嵌入支架支柱內(nèi)，反映出CSn（pDNA-BMP2）與支架有著緊密的結(jié)合。納米粒子和支架的三維結(jié)構(gòu)，能夠?qū)DNA-BMP2起到保護(hù)作用，避免發(fā)生快速擴(kuò)散與降解。充分表明，CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系是潛力巨大的基因載體支架系統(tǒng)。

部分研究顯示，對(duì)PCLDs增殖及向成骨方向分化，BMP-2能夠起到誘導(dǎo)作用，如果將BMP-2 與材料復(fù)合，進(jìn)行細(xì)胞支架的制備，能夠顯著改善牙周再生效率，而它功能的發(fā)揮，主要依賴(lài)的是改善細(xì)胞的ALP活性，提高骨鈣蛋白和膠原蛋白含量［22］。對(duì)成骨細(xì)胞的分化趨勢(shì)，ALP水平的高低可予以客觀表征。在本實(shí)驗(yàn)中，應(yīng)用CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP復(fù)合修復(fù)體系后，與其他2組相比較，ALP活性明顯更高；在僅應(yīng)用CS/CSn-GP組的情形下，與空白對(duì)照組相比較，ALP活性更高。反映出，在促進(jìn)牙槽骨再生方面，CS/CSn-GP復(fù)合修復(fù)體系有著良好的能力，包載pDNA-BMP2后，能夠顯著提升成骨能力；此外，在CS/CSn-GP復(fù)合修復(fù)體系與一定量的BMP-2復(fù)合后，Masson染色觀察到在8周有出現(xiàn)明顯的新生牙槽骨樣結(jié)構(gòu)，反映出牙周膜細(xì)胞受成骨誘導(dǎo)因子的刺激作用，在支架中實(shí)現(xiàn)成骨向分化，且有著明顯的效果。故而說(shuō)明，CS/CSn-GP復(fù)合修復(fù)體系是pDNA-BMP2的良好載體。

本實(shí)驗(yàn)表明：CS/CSn-GP復(fù)合修復(fù)體系對(duì)牙槽骨再生有著積極影響，包載pDNA-BMP-2后，有著更顯著的促牙槽骨再生作用。本研究對(duì)在牙周骨組織缺損修復(fù)中應(yīng)用CS/CSn（pDNA-BMP2）-GP 復(fù)合體系的可行性問(wèn)題作了初步分析，為后期實(shí)驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-08-11）

（本文編輯：鄭巧蘭）