吡嗪酰胺耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌pncA基因表達(dá)分析

王楠?楊瑜?鄧麗?吳玲?劉志輝?孟繁榮

【摘要】目的 比較吡嗪酰胺（PZA）耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌在PZA藥物刺激前后PZA耐藥基因pncA的表達(dá)，探討pncA基因表達(dá)與結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥的關(guān)系。方法 培養(yǎng)PZA耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌，檢測(cè)其利福平和PZA最小抑菌濃度（MIC）；以PZA濃度為0和50 μg/mL 的培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)菌株pncA的表達(dá)水平。結(jié)果 21株結(jié)核分枝桿菌PZA的MIC≥1 600 μg/mL、12株為400～800 μg/mL、5株為100～200 μg/mL；

分別定義相應(yīng)PZA耐藥水平為高、中、低，其利福平的MIC中位數(shù)分別為128、128、64 μg/mL，任意2組利福平的MIC比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均> 0.05）；以相對(duì)定量 2-ΔΔCt 法計(jì)算PZA高、中、低水平耐藥結(jié)核分枝桿菌pncA表達(dá)水平，無藥組分別為0.904（0.202，2.653）、1.157（0.658，1.511）、1.147（0.372，1.347），PZA濃度為50 μg/mL

處理組分別為1.544（0.611，3.191）、0.846（0.421，1.237）、0.726（0.225，3.017）；以無藥組為對(duì)照，PZA含藥培養(yǎng)組與其對(duì)比，pncA基因表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。結(jié)論 PZA耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌在PZA藥物刺激前后pncA表達(dá)無明顯變化。

【關(guān)鍵詞】結(jié)核分枝桿菌；耐藥；吡嗪酰胺；利福平；pncA

Analysis of pncA gene expression in pyrazinamide-resistant and multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis Wang Nan， Yang Yu， Deng Li， Wu Ling， Liu Zhihui， Meng Fanrong. Institue of Pulomonary Diseases， Guangzhou Chest Hospital， State Key Laboratory of Respiratory Disease， Guangzhou 510095， China

Corresponding author， Meng Fanrong， E-mail： rendong.mfr@163.com

【Abstract】Objective To compare the expression levels of pncA gene in pyrazinamide （PZA）-resistant and multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis before and after PZA drug stimulation， and to explore the relationship between PZA-resistant Mycobacterium tuberculosis and pncA gene expression. Methods PZA-resistant and multidrug-resistant Mycobacterium tuberculosis was cultured， and the minimal inhibitory concentration （MIC） of rifampicin and PZA was detected. The strains were cultured in medium containing 0 and 50 μg/mL PZA， and the expression level of pncA was detected by real-time fluorescence quantitative PCR. Results The MIC of PZA of 21 strains of Mycobacterium tuberculosis was ≥ 1 600 μg/mL，400-800 μg/mL for 12 strains， and 100-200 μg/mL in 5 strains，and their corresponding PZA resistance levels were defined as high，medium and low，respectively. The median MIC of rifampicin was 128， 128 and 64μg/mL， respectively. Chi-square test showed that there was no significant difference between any two groups （all P > 0.05）. According to the relative quantitative 2-ΔΔCt method， the expression levels of pncA in the high，medium and low levels of PZA drug-resistant Mycobacterium tuberculosis was 0.904（0.202， 2.653）， 1.157（0.658， 1.511） and 1.147（0.372， 1.347）， and 1.544（0.611， 3.191）， 0.846（0.421， 1.237） and 0.726 （0.225， 3.017） in the 50 μg/mL treatment group，respectively. There was no significant difference in pncA gene expression between the control and PZA drug-containing culture groups

（P > 0.05）. Conclusion No significant changes are observed in the expression levels of pncA in multidrug-resistant and PZA-resistant Mycobacterium tuberculosis before and after PZA drug stimulation.

【Key words】Mycobacterium tuberculosis； Drug resistance； Pyrazinamide； Rifampicin； pncA

吡嗪酰胺（PZA）是目前唯一可殺滅巨噬細(xì)胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌的關(guān)鍵一線抗結(jié)核藥物，其耐藥問題嚴(yán)峻而其耐藥機(jī)制尚未完全闡明［1］。已有的研究表明PZA作為前體藥物，在pncA基因編碼的吡嗪酰胺酶催化作用下發(fā)揮抗結(jié)核作用，pncA基因突變則是結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥的主要機(jī)制，但pncA無熱點(diǎn)突變區(qū)［2-5］。此外研究表明部分PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌未發(fā)生pncA基因突變，甚至其PZA酶仍有活性，提示pncA突變并非結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥的唯一機(jī)制［6-7］。Sheen等［8］研究發(fā)現(xiàn)在pncA野生型PZA耐藥菌株中觀察到與pncA啟動(dòng)子區(qū)域突變相關(guān)的低水平pncA表達(dá)，在pncA突變型PZA耐藥菌中pncA基因表達(dá)水平如何，pncA基因表達(dá)是否為pncA基因突變以外的結(jié)核菌PZA耐藥機(jī)制之一？目前尚無明確的研究表明pncA的表達(dá)是否會(huì)影響結(jié)核分枝桿菌的PZA耐藥，本研究旨在通過分析PZA耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌pncA在PZA刺激前后菌株pncA基因表達(dá)情況，探討pncA表達(dá)在結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥中是否發(fā)揮作用。

材料與方法

一、材 料

1.結(jié)核分枝桿菌

試驗(yàn)所用結(jié)核分枝桿菌來自廣州市胸科醫(yī)院分枝桿菌樣本庫，菌株入庫前均已通過生化和分子方法鑒定為結(jié)核分枝桿菌且通過臨床藥敏診斷實(shí)驗(yàn)鑒定為耐多藥（同時(shí)對(duì)異煙肼和利福平耐藥），且經(jīng)MGIT 960系統(tǒng)檢測(cè)其PZA藥敏性。

2.試劑與儀器

Middlebrook 7H9/7H10 培養(yǎng)基購自美國(guó)BD公司、PZA購自美國(guó)Sigma公司、TRIzol（200 mL）、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（High Capacity cDNA Reverse Transcription Kits）和熒光定量PCR 試劑盒為美國(guó)Thermo有限公司產(chǎn)品。細(xì)菌超聲分散儀BAC spreaderTM 1100［體必康生物科技（廣東）股份有限公司］、MP Fastprep-

24 5G 快速樣品制備儀（美國(guó)MP Biomedicals）、超微量紫外分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo）、熒光定量PCR儀ABI Vin7（美國(guó)ABI）。

二、方 法

1.結(jié)核分枝桿菌復(fù)蘇

從分枝桿菌菌種庫中取出結(jié)核分枝桿菌，37 ℃孵箱孵育過夜后轉(zhuǎn)種于7H10米氏固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3～4周。刮取培養(yǎng)基斜面菌落，細(xì)菌超聲分散儀調(diào)整濃度至1麥?zhǔn)?。?×106/mL終濃度接種于pH為7.0的7H9/10米氏培養(yǎng)基、PZA濃度

為0和50 μg/mL且pH為5.8的7H9米氏液體培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基上結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)4周后阿爾瑪藍(lán)顯色法檢測(cè)目標(biāo)菌株利福平和PZA的最小抑菌濃度（MIC），PZA刺激培養(yǎng)組培養(yǎng)2周后提取RNA。

2.利福平和PZA的MIC檢測(cè)

取pH為7.0的7H9/10米氏固體培養(yǎng)基斜面上生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的結(jié)核分枝桿菌，細(xì)菌超聲分散儀調(diào)整濃度至1麥?zhǔn)?，?×105/mL終濃度接種于含PZA終濃度為0、50、100、200、400、800、

1 600 μg/mL的96孔板中（每孔200 μL，pH 5.8，7H9米氏液體培養(yǎng)基）；以1×106/mL終濃度接種于含0.015 265、0.031 25、0.062 5、0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、64、128、256、512 μg/mL利福平的96孔板中（每孔200 μL，pH 7.0，7H9米氏液體培養(yǎng)基）培養(yǎng)14 d后每孔加入30 μL終濃度為0.2%的刃天青，37 ℃培養(yǎng)72 h后觀察顯色發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液由藍(lán)色變?yōu)槊导t色指示結(jié)核分枝桿菌生長(zhǎng)。

3. RNA提取

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的培養(yǎng)菌液8 mL，以10 000 r/min

離心5 min后棄上清，加入1 mL TRIzol 液體后顛倒混勻后轉(zhuǎn)移至裂解介質(zhì)管中，并置于MP快速樣品制備儀?？焖僬袷?0 s后冰浴 2 min，重復(fù)4次。于4 ℃ 10 000 r/min離心15 min后取上清至RNase-free 1.5 mL EP管，加入200 μL氯仿后顛倒混勻，室溫靜置5 min。4 ℃ 10 000 r/min離心15 min，上層液體轉(zhuǎn)移至新的RNase-free 1.5 mL EP管中，加600 μL異丙醇、60 μL 3 mol/L NaAc （pH 5.3）、10 μL glogen后于-70 ℃條件過夜。次日復(fù)融后，4 ℃ 10 000 r/min離心15 min后棄上清，加入1 mL 75% 乙醇重懸，在4 ℃ 10 000 r/min離心5 min，輕柔棄去液滴后自然干燥 5 min，加入50 μL RNase-free 水溶解。取1 μL RNA 樣品檢測(cè)濃度，調(diào)整濃度后取10 μL樣品逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。

4.檢測(cè)pncA基因表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）擴(kuò)增pncA基因，pncA引物為：上游5′-GGTGTTCTACAAGGGTGCCT-3′，下游5′-GGTGGCAATACCGACCACAT-3′，內(nèi)參基因?yàn)閞rs，測(cè)得pncA基因的Ct值。相對(duì)定量2-ΔΔCt 法計(jì)算pncA基因相對(duì)表達(dá)量。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)錄入Excel表格，以SPSS 26.0、GraphPad軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析及繪圖。根據(jù)試驗(yàn)菌株pncA基因的Ct值計(jì)算相對(duì)表達(dá)量（2-ΔΔCt）。本研究數(shù)據(jù)經(jīng)Shapiro-Wilk（W檢驗(yàn)）正態(tài)性檢驗(yàn)顯示數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布，以M（P25，P75）予以統(tǒng)計(jì)描述，PZA刺激前后結(jié)核分枝桿菌pncA基因表達(dá)水平對(duì)比采用符號(hào)秩和檢驗(yàn)，多組比較采用 Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)，P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、PZA耐藥水平分析

38株P(guān)ZA耐藥的耐多藥結(jié)核分枝桿菌，經(jīng)MIC檢測(cè)顯示：>1 600 μg/mL者9株、1 600 μg/mL者12株、800 μg/mL者6株、400 μg/mL者6株、200 μg/mL者2株、100 μg/mL者3株。定義PZA的MIC≥1 600 μg/mL為PZA高水平耐藥、400～

800 μg/mL為中等水平耐藥、100～200 μg/mL為低水平耐藥，將PZA耐藥菌分為3組。

二、RFP耐藥水平分析

PZA高、中、低水平耐藥的3組菌株利福平的MIC經(jīng)Shapiro-Wilk （W檢驗(yàn)）正態(tài)性檢驗(yàn)顯示P < 0.001，提示數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布。PZA高、中、低水平耐藥菌株利福平的MIC分別為128 （64，128）、128（64，128）、64（18，96） μg/mL。PZA高、中、低水平耐藥組結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥狀況示意圖見圖1。Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)比較PZA高、中、低水平耐藥組利福平的MIC比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.203）。

三、pncA本底表達(dá)水平檢測(cè)

以熒光定量 PCR 檢測(cè)菌株pncA基因和內(nèi)參基因rrs的Ct值，2株耐多藥PZA敏感菌株為對(duì)照（Ct平均值為15.49），計(jì)算相對(duì)表達(dá)值（2-ΔΔCt）。pncA基因相對(duì)表達(dá)值經(jīng)Shapiro-Wilk（W檢驗(yàn)）正態(tài)性檢驗(yàn)顯示P < 0.001，提示其為非正態(tài)分布。PZA高、中、低水平耐藥結(jié)核菌pncA本底表達(dá)分別為0.904（0.202，2.653）、1.157（0.658，1.511）、1.147（0.372，1.347），pncA本底表達(dá)情況見圖2。Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)對(duì)比PZA耐藥水平不同組之間pncA基因表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.731）。

四、PZA藥物處理前后結(jié)核分枝桿菌的pncA表達(dá)差異分析

以pH 5.8的7H9米氏培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株為對(duì)照，以pH 5.8的50 μg/mL PZA含藥7H9米氏培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株為實(shí)驗(yàn)組，計(jì)算相對(duì)表達(dá)值（2-ΔΔCt）。pncA基因相對(duì)表達(dá)值經(jīng)Shapiro-Wilk（W檢驗(yàn)）正態(tài)性檢驗(yàn)顯示P < 0.001，提示數(shù)據(jù)為非正態(tài)分布。PZA高、中、低水平耐藥菌株在PZA藥物刺激下的相對(duì)表達(dá)值分別為1.516（0.654，3.319）、0.846（0.421，1.237）、0.726（0.225，3.017）。見圖3。Kruskal-Wallis 秩和檢驗(yàn)對(duì)比PZA耐藥高、中、低水平組在PZA藥物刺激下組間pncA基因表達(dá)水平，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.120）。符號(hào)秩和檢驗(yàn)菌株P(guān)ZA藥物刺激前后pncA基因表達(dá)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P = 0.249）。見圖4。

討論

已有的研究表明pncA基因突變是結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥的主要機(jī)制，而高達(dá)30%的PZA耐藥菌表現(xiàn)出PZA酶活性且擁有野生型pncA基因，提示pncA基因突變以外PZA耐藥機(jī)制的存在［9-12］。前期對(duì)所納入研究的結(jié)核分枝桿菌進(jìn)行pncA測(cè)序，同時(shí)檢測(cè)到pncA突變型和野生型。此外我們前期研究還在耐多藥PZA敏感結(jié)核分枝桿菌中檢測(cè)到pncA基因突變，也表明pncA基因突變不足以單獨(dú)解釋結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥。pncA基因編碼吡嗪酰胺酶催化PZA發(fā)揮抗結(jié)核作用，在PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌中其表達(dá)狀況如何，pncA基因低水平表達(dá)是否為pncA基因突變外結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥機(jī)制？本研究聚焦此問題，主要通過對(duì)比分析PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌經(jīng)PZA藥物刺激后pncA基因表達(dá)與無PZA藥物刺激時(shí)本底表達(dá)之間的差異。

因PZA耐藥主要發(fā)生在耐多藥結(jié)核分枝桿菌中，非耐多藥結(jié)核患者 PZA 耐藥率較低［12-18］。故本研究以耐多藥PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌為研究對(duì)象，檢測(cè)菌株P(guān)ZA的耐藥水平并定義了其高、中、低。結(jié)核分枝桿菌利福平耐藥主要由rpoB基因突變引起，rpoB 基因編碼RNA聚合酶β亞基，其突變引起的RNA聚合酶β亞基結(jié)構(gòu)的改變可能會(huì)影響下游RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)的翻譯。而PZA為前體藥物經(jīng)pncA基因編碼的 PZA酶催化發(fā)揮抗結(jié)核作用，是否會(huì)受到利福平耐藥的影響？為解答這一問題，我們首先檢測(cè)了PZA耐藥高、中、低水平組菌株利福平耐藥水平，結(jié)果顯示3組利福平的MIC中位數(shù)均超過64 μg/mL，為較高水平耐藥。對(duì)比PZA高、中、低水平耐藥組之間利福平耐藥水平，結(jié)果顯示無差異?？紤]原因可能為本研究86.84%（33/38）的菌株利福平MIC超過32 μg/mL，即PZA耐藥菌株多為利福平較高水平耐藥。耐多藥菌株較高水平的利福平耐藥是否會(huì)影響到pncA基因的表達(dá)水平？本研究檢測(cè)了PZA藥物刺激結(jié)核分枝桿菌相對(duì)于無藥刺激組的表達(dá)水平，并將其與菌株pncA基因本底表達(dá)（pH 7.0的7H10米氏固體培養(yǎng)基）水平對(duì)比，發(fā)現(xiàn)PZA高、中、低水平耐藥組接受PZA藥物刺激后pncA基因的表達(dá)與本底表達(dá)無明顯差異。PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌在PZA藥物作用下pncA基因表達(dá)未發(fā)生變化，pncA基因低水平表達(dá)是否為結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥的可能機(jī)制需要進(jìn)一步深入研究。關(guān)于pncA基因表達(dá)的研究，Rueda等［19］研究提示，11株pncA基因突變菌中2株呈現(xiàn)相對(duì)低水平pncA表達(dá)、9株pncA基因表達(dá)水平升高。與本研究所不同的是，其pncA表達(dá)為體外構(gòu)建質(zhì)粒載體表達(dá)，本研究直接檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌臨床分離株pncA基因的表達(dá)與其略有不同。此外，我們對(duì)4例PZA敏感一線抗結(jié)核藥物全敏結(jié)核分枝桿菌同樣進(jìn)行PZA藥物刺激試驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)PZA刺激后其pncA基因表達(dá)有3倍及以上的升高。

本研究不足之處在于：首先納入PZA耐藥耐多藥結(jié)核分枝桿菌38株屬于小樣本量探索性研究，進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量后檢測(cè)菌株接受PZA藥物刺激后pncA基因表達(dá)是否升高有待繼續(xù)探究。另外未深入探討非耐多藥PZA耐藥結(jié)核分枝桿菌的pncA基因表達(dá)狀況，我們前期研究發(fā)現(xiàn)非耐多藥結(jié)核菌PZA耐藥率為6.22%［15］。Therese等［20］報(bào)道印度兒童結(jié)核患者中分離到的PZA 單耐藥結(jié)核菌pncA突變率為20%，故非耐多藥PZA耐藥pncA基因突變結(jié)核菌難于收集。后續(xù)研究將收集非耐多藥PZA耐藥及PZA敏感結(jié)核分枝桿菌，探究pncA表達(dá)是否影響結(jié)核分枝桿菌PZA耐藥。

參? 考? 文? 獻(xiàn)

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（收稿日期：2023-09-25）

（本文編輯：楊江瑜）