10個(gè)新樟屬植物葉片表型性狀多樣性分析

關(guān)鍵詞：新樟；葉片性狀；主成分分析；相關(guān)性分析；聚類分析

中圖分類號(hào)：S792.99 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1673-923X（2023）12-0083-11

樟科Magnoliids 植物是被子植物的早期分化類群[1]，樟科是一個(gè)重要的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)科，該科物種因其是熱帶和亞熱帶森林的重要組成部分，具有重要的生態(tài)和經(jīng)濟(jì)意義而受到關(guān)注[2-3]；然而，樟科中大多數(shù)常綠樹種都局限于熱帶地區(qū)。相比之下，樟科Lauraceae 中新樟族Neocinnamomeae 新樟屬Neocinnamomum植物多為常綠灌木或小喬木，是我國重要的油料和藥用植物資源；在我國西南地區(qū)，新樟屬植物的枝葉會(huì)被用作為中藥材入藥；在自然環(huán)境中，樟樹還能固定大量的CO2，并與環(huán)境進(jìn)行相互作用，這使得樟樹還具有重要的生態(tài)學(xué)意義。目前，在中國植物志中共記載了5 種新樟屬植物，分別為滇新樟Neocinnamomum caudatum、川鄂新樟N. fargesii、海南新樟N. lecomtei、滄江新樟N.mekongense 和新樟N. delavayi[4]。

植物表型性狀受遺傳物質(zhì)和環(huán)境的共同影響，經(jīng)過長期自然選擇逐漸形成穩(wěn)定的外在表現(xiàn)形式[5]。表型性狀是適應(yīng)、選擇、生存、進(jìn)化的重要指標(biāo)，是植物種內(nèi)個(gè)體遺傳多樣性和環(huán)境差異性的體現(xiàn)，其中葉片是植物體營養(yǎng)器官中對(duì)環(huán)境變化最為敏感的器官，其形態(tài)結(jié)構(gòu)特征被認(rèn)最能體現(xiàn)環(huán)境因子的影響或植物對(duì)環(huán)境的適應(yīng)[6-7]。Lu 等[8] 已成功基于葉片形態(tài)學(xué)的方法對(duì)山茶屬的植物進(jìn)行了解剖，為物種分類處理提供了依據(jù)；Rudall等[9] 通過對(duì)葉片表皮細(xì)胞的發(fā)育進(jìn)行研究比較從而推斷了被子植物共存的多樣性和相對(duì)衍生的譜系的發(fā)展；Gang 等[10] 選取了48 種亞洲樟屬植物，對(duì)其葉片進(jìn)行了微形態(tài)觀察，發(fā)現(xiàn)了樟屬植物的葉上表皮存在兩種不同的類型；而藤本植物的葉片對(duì)環(huán)境也十分敏感，根據(jù)葉片適應(yīng)特征的差異，將11 種藤本植物分為3 種類型[11]；目前，相較于其他的樟科屬植，新樟屬樹種的葉片性狀相關(guān)研究較少，對(duì)其研究遠(yuǎn)落后于其他油料植物，對(duì)其野生資源的開發(fā)利用程度極低。針對(duì)這一問題，對(duì)10 個(gè)新樟屬樹種的葉片進(jìn)行收集，并對(duì)葉長、葉寬以及細(xì)胞數(shù)目等20 種葉片性狀進(jìn)行測量，通過相關(guān)性分析、主成分分析和聚類分析，獲得了基于10 個(gè)新樟屬植物個(gè)體葉片性狀的親緣關(guān)系，篩選出具有分類價(jià)值的主要性狀，為新樟屬樹種種質(zhì)資源分類、評(píng)價(jià)及遺傳改良提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)供試材料為新樟屬7 個(gè)種的10 份植物材料，分別為采集于云南（25.1°N，99.2°E）的新樟Neocinnamomum delavayi （Lecomte） H.Liu、云南（24.9°N，98.8°E）的6068 新樟6068_Neocinnamomum delavayi （Lecomte） H. Liu、云南（24.4°N，103.7°E）的滄江新樟Neocinnamomummekongense （Hand.-Mazz.） Kosterm、云南（25.6°N，100.2°E）的7683 滄江新樟7683_Neocinnamomummekongense （Hand.-Mazz.） Kosterm、重慶（31.8°N，108.6°E） 的川鄂新樟Neocinnamomum fargesii（Lecomte） Kosterm、湖北（30.6°N，114.3°E） 的大果滇新樟Neocinnamomum caudatum var、廣東（23.2°N，113.4°E）的海南新樟Neocinnamomumlecomtei H. Liu、云南（23.4°N，104.2°E） 的文山新樟Neocinnamomum complanifructum、廣西（25.2°N，110.2°E） 的滇新樟Neocinnamomumcaudatum （Nees） Merr、緬甸（22.2°N，93.5°E）的7751 新樟7751_Neocinnamomum caudatum。

1.2 方法

從1.1中所述標(biāo)本材料中選擇完整、無畸形的健康成熟葉片，對(duì)其進(jìn)行測量并記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。其中，葉片測量分為宏觀和微觀兩個(gè)方面，并通過定性研究和定量研究來討論其分類特征。宏觀定性觀測需觀察葉片形態(tài)、葉被毛、葉脈凸起、葉尖形態(tài)以及葉基形態(tài)等特征；定量測量需要用游標(biāo)卡尺準(zhǔn)確地測量出葉的長和寬、葉柄的長和粗、葉尖的長和寬，用量角器測量出葉基夾角和葉脈夾角。微觀數(shù)據(jù)首先制作顯微鏡玻片，并用顯微鏡拍出不同倍數(shù)下的上下表皮、葉脈和葉片橫切等圖像再進(jìn)行測量。微觀定性測量需觀察顯微鏡所拍照片，如上表皮的細(xì)胞形態(tài)，平直或波紋；下表皮的氣孔形態(tài)，凸起、平行或下陷；是否有毛基和乳突等。定量測量需量取單位面積內(nèi)的上表皮細(xì)胞大小和數(shù)量，下表皮氣孔大小和數(shù)量等性狀。

1.2.1 葉片宏觀數(shù)據(jù)測量

包括葉片整體形態(tài)（長圓形、卵圓形、披針形等）、葉尖形態(tài)（鈍、漸尖、長漸尖等）、葉基形態(tài)（近圓形、漸狹、楔形等）、葉脈凸起情況（兩面均凸起、上凹下凸等）、用S8APO 型光學(xué)顯微鏡分別在2.0X、2.5X、4.0X、6.3X 下采集葉片背面圖像，以觀察葉片被毛情況（稀疏、密集、無毛）。對(duì)每一棵樹的葉片利用游標(biāo)卡尺和量角器分別測量并記錄葉長（mm）、葉寬（mm）、葉柄長（mm）、葉柄粗（mm）、葉尖長（mm）、葉尖寬（mm）、葉脈數(shù)（左、右）、葉基夾角（°）、葉脈夾角（°）等，利用電子天秤稱量并記錄葉片的干質(zhì)量（g）。使用YM-1242 葉面積儀測量葉片的面積（mm2）、周長（mm）、長度（mm）、寬度（mm）、長寬比（mm）、形狀因子（mm），每一葉片重復(fù)測量5 次，在電腦上與手工實(shí)際測量的數(shù)據(jù)進(jìn)行對(duì)比篩選（以葉長、葉寬為對(duì)比），分別計(jì)算出各葉片的平均值、中值。

1.2.2 葉片上表皮數(shù)據(jù)的測量

1）采用屈亞亞[12] 的方法進(jìn)行葉片上表皮制片。

2）將制好的玻片放置在DM2000 型光學(xué)顯微鏡下觀察，同時(shí)用LASV4.8 軟件采集圖像（目鏡為10X，分別于20X 物鏡和40X 物鏡下對(duì)上下表皮各采集12 張，即一棵樹共采集角質(zhì)層圖像48 張）。

觀察并記錄氣孔位置（平行、下陷）、有無乳突、有無毛基、上表皮細(xì)胞的形態(tài)（淺波狀、深波狀）、表皮毛分布情況、葉脈密度、葉片厚度。

3）使用ImageJ 1.8.0 軟件分別測量40 倍鏡下的上表皮細(xì)胞、下表皮氣孔的長寬，每張圖片測量6 個(gè)細(xì)胞的數(shù)據(jù)；對(duì)20X 物鏡的下表皮氣孔和40X 物鏡的上表皮細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，用Excel 2010軟件處理收集到的數(shù)據(jù)，計(jì)算其密度。

1.2.3 葉脈測量

1）采用屈亞亞[12] 的方法進(jìn)行葉葉脈相關(guān)性狀的測量。在目鏡為10X 下，分別于10X 物鏡和20X 物鏡下各采集12 張，即一棵樹共采集葉脈圖像24 張。

2）用ImageJ 1.8.0 軟件分別測量10 倍鏡和20倍鏡的葉脈長度，用Excel 2010 軟件處理收集到的數(shù)據(jù)。

1.2.4 葉片橫切測量

1）每棵樹選取一片干燥葉片，用剪刀避開主脈側(cè)脈，剪成便于操作的長條。

2）用刀片輕輕切削葉片的橫切面，盡量削薄，以能看清葉片的柵欄組織為宜，放入盛有蒸餾水的培養(yǎng)皿內(nèi)備用。

3）選取葉片薄片放于載玻片上壓制成臨時(shí)玻片，用DM2000 型光學(xué)顯微鏡進(jìn)行圖像采集（目鏡為10X，20X 物鏡下采集共12 張）。

4）利用ImageJ 1.8.0 軟件測量每一張圖片的橫切厚度，每張圖片量取3 個(gè)不同位置的厚度，用Excel 2010 軟件處理收集到的數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 葉片宏觀定性結(jié)果

通過觀察和對(duì)比，新樟屬10 個(gè)植物的葉形均為卵圓形；葉尖形態(tài)有漸尖、短漸尖和長漸尖，6068 新樟為短漸尖，大果滇新樟為長漸尖，其余均為漸尖；葉基形態(tài)有楔形和寬楔形，葉基形態(tài)為寬楔形的為新樟、6068 新樟、大果滇新樟、海南新樟和滇新樟，為楔形的包括滄江新樟、7683滄江新樟、川鄂新樟、文山新樟和7751 新樟。在觀測的葉片中，大部分葉背和葉柄均被毛，少數(shù)光滑；觀察發(fā)現(xiàn)6068 新樟和7683 滄江新樟葉背和葉柄均極密被毛；新樟葉背和葉柄均密被毛，滄江新樟和海南新樟葉背被毛較稀疏，但其葉柄密被絨毛；滇新樟和7751 滇新樟葉背和葉柄被毛稀疏，文山新樟葉背葉柄被毛極稀疏，川鄂新樟和大果滇新樟葉背和葉柄均較光滑。葉片質(zhì)地為堅(jiān)紙質(zhì)或近革質(zhì)，新樟、6068 新樟、滄江新樟和7683 滄江新樟葉片質(zhì)地為近革質(zhì)，其余種葉片為堅(jiān)紙質(zhì)。就葉緣形態(tài)而言，新樟屬10 個(gè)植物葉片的葉緣都是全緣（表1、圖1 ～ 3）。

2.2 葉片微觀定性結(jié)果

10 個(gè)新樟屬植物個(gè)體葉片微觀定性結(jié)果列于表2 中。如表2 所示，這些個(gè)體的上表皮細(xì)胞有平直、深波紋狀和淺波紋狀3 種形態(tài)，新樟、6068新樟和大果滇新樟上表皮細(xì)胞邊緣為平直狀，滇新樟和7751 滇新樟為深波紋狀，其余為淺波紋狀。10 個(gè)個(gè)體樹葉片的氣孔形態(tài)有橢圓形和卵圓形兩種，呈卵圓形的有6068 新樟和7683 新樟兩種植物，呈橢圓形的有新樟、滄江新樟、川鄂新樟、大果滇新樟、海南新樟、文山新樟、滇新樟和7751 滇新樟共8 種植物。氣孔位置有微下陷和平行兩種狀態(tài)。僅有海南新樟的氣孔微下陷，其余9 種植物的氣孔狀態(tài)均為平行。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所有個(gè)體的表皮細(xì)胞均沒有乳突，細(xì)胞界限均較明顯，老葉葉片葉背光滑的均沒有毛基，如川鄂新樟和大果滇新樟；葉背密被毛或者被毛稀疏的大部分能看到毛基，如新樟、滄江新樟和海南新樟；但葉背毛稀疏的種存在看不到毛基的情況，如文山新樟和滇新樟。10 個(gè)新樟屬植物葉片的葉脈大部分分布密集，分布稀疏的僅有滄江新樟1 種（圖4 ～ 6）。

2.3 葉性狀特征主成分分析

對(duì)10 份新樟個(gè)體的20 個(gè)葉片性狀進(jìn)行主成分分析如表3 所示，其結(jié)果表明：將20 個(gè)性狀分成了5 個(gè)成分，5 個(gè)主成分累積貢獻(xiàn)率為88.888%。表明了這5 個(gè)成分代表了20 中性狀的大多數(shù)信息，其中第1 成分主要由葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗、葉脈數(shù)、重量、厚度、葉脈密度10X、葉脈密度20X、葉片干質(zhì)量組成，特征貢獻(xiàn)率為39.485%。第2 成分主要由長寬比、葉長、葉柄長、葉柄粗、葉尖長、葉尖寬、質(zhì)量、厚度、細(xì)胞面積、葉脈密度10X、葉脈密度20X、葉片干質(zhì)量、橫切厚度、20X 氣孔數(shù)目組成，特征貢獻(xiàn)率為18.713%。第3成分主要由長寬比、葉長、葉柄粗、葉尖長、葉尖寬、葉基夾角、葉脈密度20X、20X 氣孔數(shù)目、40X 細(xì)胞數(shù)目組成，特征貢獻(xiàn)率為14.393%。第4 成分主要由葉柄粗、葉尖長、葉尖寬、葉脈夾角、葉基夾角、質(zhì)量、厚度、細(xì)胞面積、葉脈密度10X、葉片干質(zhì)量、橫切厚度、20X 氣孔數(shù)目組成，特征貢獻(xiàn)率為9.055%。第5 成分特征主要由長寬比、葉柄長、葉基夾角、質(zhì)量、氣孔面積、細(xì)胞面積、葉片干質(zhì)量、橫切厚度、20X 氣孔數(shù)目組成，貢獻(xiàn)率為6.242%。

2.4 葉性狀特征相關(guān)性分析

對(duì)10 個(gè)新樟樹種的20 個(gè)葉片性狀指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析如表4 所示。有17 對(duì)性狀相關(guān)性達(dá)到極顯著水平（P ＜ 0.01），9 對(duì)性狀相關(guān)性達(dá)到顯著水平（P ＜ 0.05）。其中葉長與葉寬、葉柄粗、質(zhì)量、葉片干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；葉寬與葉柄粗、葉脈數(shù)、質(zhì)量、葉片干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；葉柄長與質(zhì)量、葉片干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；葉柄粗與質(zhì)量、葉片干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)；葉尖寬與20X 氣孔數(shù)目、40X 細(xì)胞數(shù)目呈極顯著正相關(guān)、質(zhì)量與葉片干質(zhì)量呈極顯著正相關(guān)、細(xì)胞面積與葉脈密度10X 呈極顯著正相關(guān)；而長寬比與葉脈夾角呈極顯著負(fù)相關(guān)。20 個(gè)性狀間存在不同程度的相關(guān)性，彼此之間互相影響關(guān)系密切。

2.5 葉片性狀特征聚類分析

對(duì)10 個(gè)新樟屬個(gè)體樹的20 個(gè)葉片性狀進(jìn)行聚類分析。當(dāng)遺傳距離為10 時(shí)，可將10 種新樟屬植物分為三大類群，第一類群的新樟樹種最多， 有8 個(gè)種， 分別為新樟、6068 新樟、滄江新樟、7683 新樟、大果滇新樟、海南新樟、滇新樟、7751 滇新樟；第一類群新樟樹種跟其他兩個(gè)類群區(qū)分的主要性狀是葉脈密度20X，第一類群的新樟樹種葉脈密度20X 為1 549.98 左右，而其他的2 個(gè)樹種為2 958.48 與4 124.19。第二類群的新樟樹種為川鄂新樟，這個(gè)性狀與其他兩個(gè)類群的主要區(qū)分性狀為20X 氣孔數(shù)目，川鄂新樟的20X 氣孔數(shù)目為44.33，而第一類群與第三類群的20X 氣孔數(shù)目分別為76.35 和64.58。第三類群為文山新樟，與其他兩個(gè)類群的主要區(qū)別性狀為葉脈密度10X、葉脈密度20X，其中文山新樟的葉脈密度10X 為6 689.42，而第一性狀為4 076.65，第二性狀樹種為4 364.39；文山新樟的葉脈密度20X 為4 124.19，而第一樹種性狀為1 549.98，第二性狀為2 958.48. 通過聚類分析，可以大致分析樹種之間的親緣關(guān)系。

3 討論

3.1 10 個(gè)新樟屬植物葉片宏觀和微觀定性分析

葉片是與環(huán)境接觸面積最大的植物器官，外界環(huán)境的各種因素首先作用于葉，植物種的特性應(yīng)該從葉上表現(xiàn)出來[13]。葉片的結(jié)構(gòu)性狀能夠在很大程度上影響植物的光合生理，進(jìn)而影響植物的性能[14]，如氣孔是植物交換CO2 和水分的主要通道，其大小和密度直接影響了水分利用效率[15]；葉脈為植物提供支持、水分以及光合碳水化合物來維持植物的水分輸送系統(tǒng)[16]，葉脈的大小、密度以及排列情況均與葉片的功能緊密相關(guān)。對(duì)10份新樟樹種的物種資源的葉片宏觀、微觀進(jìn)行定性分析，新樟屬10 個(gè)植物材料在宏觀方面均有差異，這表明新樟屬10 個(gè)植物的葉片宏觀和微觀形態(tài)具有豐富多樣性，而植物表型性狀越豐富，表明對(duì)該屬樹種進(jìn)行再選擇性的產(chǎn)出率會(huì)更高，其增益也會(huì)隨之提高。

3.2 10 個(gè)新樟屬植物葉片性狀相關(guān)性分析通過分析

20 個(gè)葉片性狀的相關(guān)性，其中極顯著正相關(guān)的性狀有16 對(duì)。在這16 對(duì)性狀中，葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗與質(zhì)量、葉片干質(zhì)量的相關(guān)性最高，說明在新樟樹種資源的評(píng)價(jià)與培育的過程中，應(yīng)該考慮葉片質(zhì)量和葉片干質(zhì)量對(duì)葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗的影響。葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗等指標(biāo)越大，越有利于葉片凈質(zhì)量的增加幅度。以上結(jié)果為進(jìn)一步新樟樹種種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和新品種培育，提供了理論依據(jù)。而這也與金方倫等[17] 對(duì)蓖麻的葉長和葉寬都呈正相關(guān)且葉片長度與葉寬、葉柄都呈現(xiàn)顯著正相關(guān)的研究結(jié)果一致，他們通過建立葉片質(zhì)量和性狀指標(biāo)的回歸方程，可以得到回歸方程相關(guān)系數(shù)；通過對(duì)每一個(gè)樣品的葉片進(jìn)行測量其性狀，軟件直接進(jìn)行相關(guān)性的分析。而葉片性狀間復(fù)雜的相關(guān)性可能是因?yàn)閿?shù)量性狀受多基因控制所致[18]。

3.3 10 個(gè)新樟屬植物葉片性狀主成分分析

主成分分析將10 份新樟樹種質(zhì)資源的大部分信息進(jìn)行簡化。而也有研究將此方法在無花果、香蕉等研究中應(yīng)用[19-20]，發(fā)現(xiàn)5 個(gè)主成分貢獻(xiàn)累計(jì)率為87.89%，主成分1 貢獻(xiàn)率最大為39.485%，主要是葉長、葉寬、葉柄長、葉柄粗、葉脈數(shù)、質(zhì)量、厚度、葉脈密度10X、葉脈密度20X、葉片干質(zhì)量、40X 的細(xì)胞數(shù)目；結(jié)合相關(guān)性數(shù)據(jù)，11 個(gè)性狀之間互相呈現(xiàn)極顯著性關(guān)系。主成分2占比18.713%，主成分3 占比14.393%，主成分4占比9.055%，主成分5 占比6.242%。通過主成分分析，在20 個(gè)性狀中分析主要的綜合性因素，為新樟樹中的種質(zhì)資源和育種工作，提供了重要的參考依據(jù)。

3.4 10 個(gè)新樟屬植物葉片性狀聚類分析

通過聚類可以探究新樟屬不同種之間的親緣關(guān)系，為下一步對(duì)新樟屬的選擇育種提供理論依據(jù)。通過對(duì)新樟屬7 個(gè)種的10 個(gè)樣本進(jìn)行聚類分析，也有研究采用不同的方法對(duì)物種進(jìn)行聚類分析，例如趙麗娟等[20] 采用離差平方和法（Ward）對(duì)香蕉種質(zhì)資源葉片表型性狀進(jìn)行聚類分析將公示材料分成了4 份；通過將供試材料分成了3 大類群，其中第一類群有8 個(gè)種，分別為新樟、6068 新樟、7683 滄江新樟、海南新樟、滄江新樟、大果滇新樟、7751 滇新樟、滇新樟；第二類群和第三類群均只有一個(gè)樹種，分別為川鄂新樟和文山新樟。推測新樟、6068 新樟、7683 滄江新樟、海南新樟、滄江新樟、大果滇新樟、7751 滇新樟、滇新樟之間親緣關(guān)系較近。為進(jìn)一步確定新樟屬種間的親緣關(guān)系，接下來將對(duì)花、果實(shí)等具有傳統(tǒng)分類價(jià)值的性狀進(jìn)行研究。

4 結(jié)論

收集不同地區(qū)、不同海拔的7 種新樟屬植物10 個(gè)個(gè)體，對(duì)其宏觀表型與微觀表型進(jìn)行分析，將其分為了3 大類群，并進(jìn)行了性狀的相關(guān)分析，為以后新樟樹種資源的評(píng)價(jià)與培育提供性狀指標(biāo)參考，同時(shí)還進(jìn)行了新樟樹種性狀的主成分分析，揭示了不同性狀對(duì)新樟樹種的影響，這也為以后新樟樹中的種質(zhì)資源和育種工作提供了理論依據(jù)。

[ 本文編校：羅列]