大同市云州區(qū)黃花菜資源調(diào)查與分析

摘要：山西省大同云州區(qū)是我國(guó)黃花菜的主要生產(chǎn)基地，為了探清大同市云州區(qū)黃花菜產(chǎn)區(qū)的主要品種，為大同市區(qū)域優(yōu)良種質(zhì)鑒定及選育提供理論依據(jù)，也為云州區(qū)黃花菜產(chǎn)區(qū)的品牌保護(hù)提供有力支持，試驗(yàn)采集大同市云州區(qū)33 個(gè)村落的黃花菜種苗，采用形態(tài)學(xué)指標(biāo)與山西農(nóng)業(yè)大學(xué)黃花菜種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用課題組前期開(kāi)發(fā)的43 對(duì)高多態(tài)性EST-SSR 分子標(biāo)記對(duì)這些種苗進(jìn)行遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析與聚類(lèi)分析。結(jié)果表明，根據(jù)花蕾性狀的形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)分析，可將大同地區(qū)黃花菜資源分為3 個(gè)組群；篩選出18 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記能夠很好地區(qū)分待測(cè)種質(zhì)，18 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記對(duì)146 份萱草屬植物種質(zhì)共擴(kuò)增出88 條多態(tài)片段，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出4.89 條多態(tài)片段，引物多態(tài)性信息含量的平均值為0.298 2，大同市大部分黃花菜種質(zhì)資源與參考種質(zhì)大同黃花的遺傳相似系數(shù)均為1.000 0。基于EST-SSR 標(biāo)記的聚類(lèi)分析與遺傳結(jié)構(gòu)分析結(jié)果相差不大，能很好地對(duì)黃花菜種質(zhì)進(jìn)行分類(lèi)，除了2 個(gè)來(lái)自峰峪村和2 個(gè)來(lái)自賀店村的黃花菜種質(zhì)外，其余134 份來(lái)自大同市云州區(qū)的黃花菜種質(zhì)資源與大同黃花聚為一類(lèi)。以上結(jié)果表明，除了來(lái)自峰峪村和賀店村的4 個(gè)黃花菜種質(zhì)外，其余134 份來(lái)自大同市云州區(qū)的黃花菜種質(zhì)資源全部為大同黃花。

關(guān)鍵詞：黃花菜；EST-SSR；聚類(lèi)分析；遺傳多樣性；大同市云州區(qū)

中圖分類(lèi)號(hào)：S644.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2023）06?0663?13

黃花菜（Hemerocallis citrina）又名忘憂草、金針菜，屬阿福花科萱草屬植物[1]，起源于我國(guó)東北部、日本及歐洲溫暖地帶，是一種常見(jiàn)的藥食兼用型功能蔬菜[2]。我國(guó)黃花菜種質(zhì)資源豐富，是黃花菜種植面積最大的國(guó)家[3]，其中，山西大同、陜西大荔、甘肅慶陽(yáng)、湖南祁東是我國(guó)最具有代表性的幾個(gè)黃花菜產(chǎn)區(qū)[2]。其中，大同市黃花菜產(chǎn)業(yè)歷史悠久，發(fā)展迅猛，在脫貧攻堅(jiān)道路上展現(xiàn)出了非凡的生命力。2020 年習(xí)近平總書(shū)記在山西考察，作出“黃花也能做成大產(chǎn)業(yè)，有著很好的發(fā)展前景。要保護(hù)好、發(fā)展好這個(gè)產(chǎn)業(yè)，讓黃花成為群眾脫貧致富的‘搖錢(qián)草’”的重要指示，更加促進(jìn)了大同市黃花產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[4]。大同市是全國(guó)黃花菜主產(chǎn)區(qū)之首，種植面積穩(wěn)定在1.77 萬(wàn)hm2 [5]。近年來(lái)，云州區(qū)黃花菜種植面積擴(kuò)大到1.13 萬(wàn)hm2，占全國(guó)總面積的27.3%，種植面積和產(chǎn)量均居全國(guó)第2 位[6]?！?大同黃花”被評(píng)為中國(guó)百?gòu)?qiáng)農(nóng)產(chǎn)品區(qū)域公用品牌，市場(chǎng)認(rèn)可度越來(lái)越高，各類(lèi)黃花產(chǎn)品直營(yíng)效果好，品牌知名度高。

優(yōu)異親本資源的篩選和種質(zhì)資源的準(zhǔn)確鑒定是植物品種選育推廣和遺傳研究的必要基礎(chǔ)。目前，我國(guó)萱草屬植物分子水平上的種質(zhì)資源鑒定和分類(lèi)研究都還有待深入[7]。各類(lèi)黃花菜在外形上極為相似，利用傳統(tǒng)分類(lèi)學(xué)的手段很難辨認(rèn)，這給優(yōu)質(zhì)黃花菜種質(zhì)的選育和研究都帶來(lái)很大的困難[8]。

而在分子層面，利用分子標(biāo)記的多態(tài)性對(duì)黃花菜資源進(jìn)行種質(zhì)鑒定能夠有效地解決這一問(wèn)題，在國(guó)內(nèi)外很多相關(guān)研究中已得到充分驗(yàn)證。較早出現(xiàn)的以PCR 技術(shù)為核心的是RAPD 分子標(biāo)記技術(shù)。劉長(zhǎng)命等[9]通過(guò)RAPD 分子標(biāo)記鑒定出秦嶺南麓24 份萱草屬種質(zhì)資源。之后出現(xiàn)的SSR 分子標(biāo)記技術(shù)具有豐富的多態(tài)性以及高度的可靠性[10-11]。朱華芳等[12]利用SSR 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)14 個(gè)萱草園藝品種及6 個(gè)原種或變種進(jìn)行了聚類(lèi)分析。還有一類(lèi)分子標(biāo)記是以DNA 序列（mRNA 或單核苷酸多態(tài)性）為核心的EST 技術(shù)，其是20 世紀(jì)90 年代被研究出來(lái)的。近年來(lái)LI 等[13]利用多態(tài)性EST-SSR 標(biāo)記對(duì)155 份萱草屬植物進(jìn)行遺傳多樣性分析，這些SSR 標(biāo)記在萱草屬植物材料間開(kāi)花時(shí)間的關(guān)聯(lián)分析中得到進(jìn)一步應(yīng)用。在這些分子標(biāo)記中，ESTSSR標(biāo)記因其開(kāi)發(fā)便利、多態(tài)性好、可操作性高而得以廣泛應(yīng)用，在杜鵑[14]、扁穗雀麥[15]、文心蘭[16]、茶樹(shù)[17]、黍稷[18]等植物的研究中均有報(bào)道。

為了探清大同市云州區(qū)黃花菜產(chǎn)區(qū)的主要品種，本研究利用形態(tài)學(xué)指標(biāo)對(duì)從山西省大同市云州區(qū)的33 個(gè)不同村落中采集的黃花菜種質(zhì)以及8 個(gè)已知來(lái)源的萱草屬植物進(jìn)行表型性狀調(diào)查與聚類(lèi)，并基于LI 等[13]開(kāi)發(fā)的43 對(duì)多態(tài)性EST-SSR 標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性與遺傳結(jié)構(gòu)分析，對(duì)大同市黃花菜種質(zhì)進(jìn)行鑒定篩選，旨在為大同市地區(qū)黃花菜優(yōu)良種質(zhì)鑒定及選育提供理論依據(jù)，為黃花菜產(chǎn)區(qū)提供品牌保護(hù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)待鑒定的138 份黃花菜種質(zhì)來(lái)源于山西省大同市云州區(qū)的33 個(gè)村落（圖1），8 個(gè)參考種質(zhì)現(xiàn)保存于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)萱草屬植物種質(zhì)資源圃（表1）。每份種質(zhì)選取長(zhǎng)勢(shì)良好、無(wú)病蟲(chóng)害的植株，采集其幼嫩葉片和成熟花蕾，設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，置于-40 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 表型性狀調(diào)查 對(duì)8 份參考種質(zhì)以及138 份待鑒定種質(zhì)進(jìn)行花蕾表型性狀調(diào)查?；ɡ匍L(zhǎng)度、花蕾直徑、花蕾鮮質(zhì)量、花蕾干質(zhì)量調(diào)查方法及測(cè)量標(biāo)準(zhǔn)參照熊雄等[19]定義的標(biāo)準(zhǔn)。每份種質(zhì)進(jìn)行3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)、3 個(gè)技術(shù)重復(fù)。

1.2.2 EST-SSR 檢測(cè) 利用侯非凡[2]調(diào)整改良的CTAB 法提取146 份萱草屬種質(zhì)的DNA，其濃度及純度采用Nano Drop Spectrometer 進(jìn)行檢測(cè)。本試驗(yàn)所用的43 對(duì)多態(tài)性EST-SSR 引物序列來(lái)自山西農(nóng)業(yè)大學(xué)黃花菜種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用課題組的大同黃花（Hemerocallis citrina cv‘. Datong Huanghua’）轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)[13]，SSR 標(biāo)記擴(kuò)增PCR 采用10 μL擴(kuò)增體系，Touchdown 反應(yīng)程序，采用9% 非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，電泳結(jié)束后經(jīng)銀染顯色拍照記錄檢測(cè)結(jié)果[20]。

1.3 數(shù)據(jù)分析

1.3.1 表型性狀數(shù)據(jù)分析 使用Microsoft Excel2010 對(duì)每個(gè)表型性狀的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算每個(gè)性狀的最大值、最小值、極差、平均值（x）、標(biāo)準(zhǔn)差（σ）及變異系數(shù)。并利用Shannon’s 多樣性指數(shù)（H'）評(píng)價(jià)各表型性狀的遺傳多樣性，將各性狀數(shù)據(jù)分為10 級(jí)，第1 級(jí)為（Xilt;（x-2σ）），第10 級(jí)為（Xigt;（x+2σ）），每0.5σ 為1 級(jí)。

H'=-Σ（Pi）ln（Pi） （1） 式中，Pi 表示每個(gè)性狀第i 級(jí)內(nèi)材料的數(shù)量占總材料數(shù)量的比例。

使用NTSYSpc 2.10 軟件，采用歐氏距離以及UPGMA 方法對(duì)146 份萱草屬種質(zhì)性狀進(jìn)行聚類(lèi)分析，并繪制聚類(lèi)樹(shù)狀圖。

1.3.2 EST-SSR 標(biāo)記遺傳多樣性分析 根據(jù)聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果，構(gòu)建“0，1”序列矩陣。使用PopGene 32 軟件計(jì)算多態(tài)位點(diǎn)百分率與觀測(cè)等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、Shannon’s 信息指數(shù)（I）等；利用PowerMarker V 3.25 軟件計(jì)算每一個(gè)引物的多態(tài)性信息含量PIC 值；使用NTSYSpc2.10 軟件，采用UPGMA 方法對(duì)8 個(gè)參考種質(zhì)與138 個(gè)待鑒定種質(zhì)進(jìn)行聚類(lèi)分析。

1.3.3 遺傳結(jié)構(gòu)分析 利用STRUCTURE 2.3.4軟件中的貝葉斯聚類(lèi)方法對(duì)146 份種質(zhì)的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析[21]。設(shè)置群體分組范圍，即K 值為1～5，設(shè)定不作數(shù)迭代（Length of burn-in period）為50 000，不作數(shù)迭代后的馬爾科夫鏈MCMC（Markov’sChain Monte Carlo）為100 000，各20 次重復(fù)計(jì)算[22]。將得到的計(jì)算結(jié)果壓縮為zip 格式上傳至Structure Harvester 服務(wù)器的網(wǎng)址（http：//taylor0.biology.ucla.edu/struct_harvest/）進(jìn)行計(jì)算[23]，綜合文獻(xiàn)[22，24]的最佳K 值判斷方法得到最佳K 值。

2 結(jié)果與分析

2.1 大同市栽培黃花菜種質(zhì)表型分析

由表2 可知，萱草的花蕾長(zhǎng)度均值為8.74 cm，

花蕾直徑均值為16.19 mm，黃花菜的花蕾長(zhǎng)度均值為12.69 cm，花蕾直徑均值為10.30 mm。黃花菜和萱草相比，其花蕾長(zhǎng)度更長(zhǎng)，但是花蕾直徑較短；但是黃花菜與萱草花蕾的鮮質(zhì)量和干質(zhì)量差異不明顯，萱草的花蕾鮮質(zhì)量均值為4.02 g，花蕾干質(zhì)量均值為0.45 g，黃花菜的花蕾鮮質(zhì)量均值為3.76 g，花蕾干質(zhì)量均值為0.37 g。

來(lái)自大同市云州區(qū)的黃花菜種質(zhì)中，邢莊村的種質(zhì)花蕾長(zhǎng)度最大，可達(dá)14.43 cm，東駱駝坊的種質(zhì)花蕾長(zhǎng)度最小，只有9.54 cm；花蕾直徑最大的種質(zhì)來(lái)自徐家堡村，為11.99 mm，花蕾直徑最小的種質(zhì)來(lái)自東駱駝坊，為8.52 mm；花蕾鮮質(zhì)量最大的種質(zhì)為5.09 g，來(lái)自大坊城村，鮮質(zhì)量最小的種質(zhì)為2.38 g，來(lái)自東駱駝坊；花蕾干質(zhì)量最大的種質(zhì)為0.56 g，來(lái)自小蒲村與南棟莊，干質(zhì)量最小的種質(zhì)為0.17 g，來(lái)自下泉村。通過(guò)整理表中數(shù)據(jù)可以看出，來(lái)自郭家窯頭村的黃花菜種質(zhì)花蕾長(zhǎng)度、花蕾直徑、花蕾鮮質(zhì)量與花蕾干質(zhì)量都比較大，在138 份地方栽培種中各項(xiàng)性狀較為優(yōu)良；而來(lái)自東駱駝坊的黃花菜種質(zhì)各項(xiàng)性狀較差。

對(duì)4 個(gè)花蕾表型性狀進(jìn)行分析，結(jié)果顯示（表3），變異系數(shù)最大的性狀是花蕾干質(zhì)量（28.63%）；其次是花蕾鮮質(zhì)量（22.16%），之后是花蕾直徑（10.32%）；花蕾長(zhǎng)度的變異系數(shù)最?。?0.04%），表明它們?cè)趤?lái)自大同云州區(qū)的138 份黃花菜種質(zhì)間變異較小。這4 個(gè)性狀的多樣性指數(shù)變化范圍為2.03～2.07，彼此相差不大。

采用NTSYSpc 2.10 軟件對(duì)146 份萱草屬種質(zhì)材料的花蕾長(zhǎng)度、花蕾直徑、花蕾鮮質(zhì)量和花蕾干質(zhì)量4 個(gè)性狀進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖2 所示，參考種質(zhì)搖籃曲（5 號(hào)）、兒童節(jié)（6 號(hào)）和海爾范（7 號(hào)）聚類(lèi)為一組；另一組包括其余5 個(gè)參考種質(zhì)和138 份來(lái)自山西大同的黃花菜種質(zhì)資源，這138 份來(lái)自大同的黃花菜種質(zhì)資源可以分為3 組，第1 組為來(lái)自徐家堡村的53 號(hào)、來(lái)自東駱駝坊的59 號(hào)、來(lái)自南棟莊的81 號(hào)和參考種質(zhì)龍游紅花（8 號(hào)）成為一類(lèi)；第2 組是來(lái)自駕遇造村的102 號(hào)和來(lái)自路家莊的103 號(hào)、104 號(hào)；第3 組為其余132 份來(lái)自大同的黃花菜種質(zhì)資源和參考種質(zhì)大同黃花（1 號(hào)）、小黃花（2 號(hào)）、沖里花1 號(hào)（3 號(hào)）和大荔黃花（4 號(hào)）聚類(lèi)在一起。

通過(guò)比較可以發(fā)現(xiàn)，來(lái)自大同市云州區(qū)的黃花菜種質(zhì)的各項(xiàng)表型性狀都與來(lái)自山西大同黃花十分相似，所以，只通過(guò)表型觀測(cè)無(wú)法對(duì)其品種進(jìn)行分辨，需要通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)黃花菜種質(zhì)資源進(jìn)行進(jìn)一步鑒定。

2.2 EST-SSR 分析

經(jīng)Nano Drop 檢測(cè)DNA 濃度及純度，其OD260/280 均在1.8～2.0，OD260/230 均在1.8～2.0，DNA質(zhì)量符合分子標(biāo)記檢測(cè)要求。使用43 對(duì)多態(tài)性EST-SSR 標(biāo)記對(duì)146 份種質(zhì)進(jìn)行擴(kuò)增，所有標(biāo)記均在8 份參考種質(zhì)中表現(xiàn)出多態(tài)性，而在大同地方栽培種中表現(xiàn)出多態(tài)性的標(biāo)記有18 對(duì)。ESTSSR在部分種質(zhì)中的擴(kuò)增情況如圖3 所示，其中三堿基重復(fù)類(lèi)型以上的標(biāo)記有15 對(duì)，SAU00010、SAU00029、SAU00097 為二堿基重復(fù)，這18 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記的詳細(xì)信息如表4 所示。

2.3 遺傳多樣性分析

遺傳多樣性分析結(jié)果表明（表5），18 對(duì)ESTSSR標(biāo)記在146 份萱草屬植物材料中共測(cè)得88 個(gè)等位基因，平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)（Na）4.888 9 個(gè)，有效等位基因數(shù)（Ne）1.761 4 個(gè)。Shannon’s 信息指數(shù)（I）的變化范圍為0.023 4～0.853 7，平均值為0.606 0，最小位點(diǎn)為SAU00064， 最大位點(diǎn)為SAU00059。多態(tài)性信息含量（PIC）的變化范圍為0.007 0～0.440 0，平均值為0.298 2，SAU00045 的多態(tài)性最高，SAU00064 的多態(tài)性最低。觀測(cè)雜合度（Obs_Het）的范圍為0.000 0～1.000 0，平均為0.659 1，期望雜合度（Exp_Het）的范圍為0.007 0～0.546 5，平均為0.375 6。Nei 基因多樣性指數(shù)的變化范圍為0.007 0～0.544 6，平均值為0.374 3。各個(gè)種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)平均為0.960 4（0.443 0～1.000 0），來(lái)自徐家堡村的59 號(hào)栽培黃花菜與參考萱草種質(zhì)龍游紅花之間的遺傳相似性系數(shù)最小，為0.443 0，它們之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。大同地區(qū)的黃花菜種質(zhì)資源大部分與參考種質(zhì)大同黃花的遺傳相似系數(shù)均為1.000 0。

2.4 Structure 遺傳結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 最佳K 值判斷 基于Structure 的計(jì)算結(jié)果顯示，在K 值為1～4 時(shí)，對(duì)數(shù)似然函數(shù)值隨著K 值的增大而減?。▓D4）。Rosenberg 的方法表示，當(dāng)對(duì)數(shù)似然函數(shù)值變化趨于緩慢的那個(gè)拐點(diǎn)就是最佳K 值，即檢測(cè)分組值與真實(shí)K 值接近，那么K 值為2時(shí)與真實(shí)K 值相接近。

而Evanno 的方法是判斷對(duì)數(shù)值的變化率Delta K 是否發(fā)生了驟變，當(dāng)K 值為2 時(shí)，其Delta K值較高；而K 值為3 時(shí)，Delta K 值驟降，所以K 值為2 接近于真實(shí)K 值（圖5）。

綜合2 種方法，K 值為2 是最佳K 值。

2.4.2 K 值為2、3、4 時(shí)的遺傳結(jié)構(gòu)分析 結(jié)果顯示（圖6），當(dāng)K=2 時(shí)，146 份種質(zhì)資源可以分為2 個(gè)類(lèi)群，以大同黃花（1 號(hào)）與大荔黃花（4 號(hào)）為代表的黃花菜類(lèi)群（紅色部分）及以搖籃曲（5 號(hào)）、兒童節(jié)（6 號(hào)）、海爾范（7 號(hào)）和龍游紅花（8 號(hào)）為代表的萱草類(lèi)群（綠色部分）。其中，小黃花（2 號(hào)）、沖里花1 號(hào)（3 號(hào)）以及來(lái)自峰峪村的47 號(hào)、來(lái)自賀店村的121 號(hào)、122 號(hào)這些種質(zhì)本屬于黃花菜，但是在分群時(shí)卻偏向于萱草類(lèi)群， 這可能是因?yàn)楫?dāng)K 值為2 時(shí)多態(tài)性標(biāo)記的數(shù)量不足，無(wú)法對(duì)這幾個(gè)種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，所以還需要對(duì)更高的K 值進(jìn)行分析。

當(dāng)K 值為3 時(shí)，與K 值為2 時(shí)的結(jié)果相比，小黃花（2 號(hào)）和沖里花1 號(hào)（3 號(hào)）有了明顯的區(qū)分，以及來(lái)自峰峪村的47 號(hào)、來(lái)自賀店村的121 號(hào)和122 號(hào)種質(zhì)資源明顯屬于以小黃花（2 號(hào)）為代表的黃花菜類(lèi)群，但是沖里花1 號(hào)（3 號(hào)）在分群時(shí)還是更偏向于萱草類(lèi)群，還需要對(duì)更高的K 值進(jìn)行分析。當(dāng)K值為4 時(shí)，小黃花（2 號(hào)）和沖里花1 號(hào)（3 號(hào)）與萱草類(lèi)群有了明顯區(qū)分。

結(jié)合以上3 個(gè)K 值的結(jié)果表明，來(lái)自峰峪村的47 號(hào)、來(lái)自賀店村的121 號(hào)和122 號(hào)種質(zhì)資源與小黃花（2 號(hào)）的遺傳結(jié)構(gòu)相似，除這3 份種質(zhì)資源比較特殊外，其余來(lái)自大同市云州區(qū)的135 份種質(zhì)資源都與大同黃花（1 號(hào)）在一個(gè)類(lèi)群。

2.5 146 份萱草屬種質(zhì)的聚類(lèi)分析

根據(jù)18 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記的擴(kuò)增數(shù)據(jù)，通過(guò)軟件計(jì)算出146 份萱草屬種質(zhì)的遺傳相似性系數(shù)，并使用UPGMA 方法對(duì)其進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖7所示。

為了檢驗(yàn)聚類(lèi)結(jié)果的好壞，用Cophenetic 相關(guān)性進(jìn)行分析，結(jié)果表明，相關(guān)性系數(shù)為0.980 97，聚類(lèi)結(jié)果可靠。這146 份種質(zhì)材料在遺傳相似系數(shù)為0.980 97 處可分為黃花菜與萱草兩大類(lèi)群，來(lái)源于山西省大同市云州區(qū)的138 份種質(zhì)資源全部屬于黃花菜類(lèi)群。包含來(lái)自獨(dú)樹(shù)村的9 號(hào)、來(lái)自邢莊村的142 號(hào)等134 份大同市云州區(qū)的黃花菜種質(zhì)資源與參考種質(zhì)大同黃花（1 號(hào)）聚類(lèi)在一起；而來(lái)自峰峪村的40 號(hào)和47 號(hào)以及來(lái)自賀店村的121 號(hào)和122 號(hào)4 份黃花菜種質(zhì)與參考種質(zhì)小黃花（2 號(hào)）聚類(lèi)在一起（圖7）。

3 結(jié)論與討論

形態(tài)學(xué)指標(biāo)利用表型性狀可以最直觀、快速地對(duì)物種間進(jìn)行分類(lèi)和鑒定，是最簡(jiǎn)單的方法。但是這種方法也存在很大的不足之處，只能區(qū)別外形具有明顯差異性的植物，且應(yīng)用范圍較小，無(wú)法說(shuō)明真實(shí)的遺傳變異情況[25]。若某一品種的數(shù)量較多或者外形相似度較高時(shí)，使用這種方法就難以對(duì)其進(jìn)行區(qū)分，容易出現(xiàn)誤差。本研究中，由于黃花菜種質(zhì)之間外形非常相近，所以通過(guò)對(duì)其表型性狀的觀測(cè)并不能將這些黃花菜種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分，需要通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定分析。根據(jù)花蕾的表型性狀進(jìn)行聚類(lèi)分析，可將大同地區(qū)黃花菜資源分為3 個(gè)組群，形態(tài)學(xué)聚類(lèi)與分子標(biāo)記聚類(lèi)結(jié)果差異較大，造成這種結(jié)果的原因可能是由于形態(tài)學(xué)性狀容易受環(huán)境影響，并不能對(duì)種質(zhì)材料進(jìn)行很好地分類(lèi)。熊雄等[19]曾對(duì)大同黃花花蕾的表型性狀進(jìn)行了研究，其花蕾長(zhǎng)度的變異系數(shù)為5.07%，花蕾寬度的變異系數(shù)為7.49%，花蕾鮮質(zhì)量的變異系數(shù)為13.55%。本研究中這3 個(gè)性狀的變異系數(shù)均比其高。說(shuō)明表型性狀除了受遺傳的影響，環(huán)境因素也會(huì)發(fā)生作用，例如土壤、水肥、氣候等。

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，分子標(biāo)記在萱草屬植物中的應(yīng)用研究逐漸增多。陳志峰[26]用SRAP 分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)17 種黃花菜進(jìn)行了親緣關(guān)系鑒定，多態(tài)性條帶占總擴(kuò)增條帶數(shù)的49.3%，將它們分成了2 類(lèi)5 組；鄭家禎等[27] 借助SCoT 分子標(biāo)記技術(shù)將31 份黃花菜資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析并將其分為2 類(lèi)；任陽(yáng)[28]用形態(tài)學(xué)性狀、SSR 分子標(biāo)記、ISSR 分子標(biāo)記對(duì)50 份萱草屬植物材料進(jìn)行分類(lèi)研究，發(fā)現(xiàn)2 種分子標(biāo)記技術(shù)平均標(biāo)記的數(shù)量與多態(tài)性百分比不同，且對(duì)這50 份材料的聚類(lèi)結(jié)果也有差異。基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的ESTSSR分子標(biāo)記技術(shù)與傳統(tǒng)的SSR 分子標(biāo)記技術(shù)相比，具有開(kāi)發(fā)簡(jiǎn)單、測(cè)序數(shù)據(jù)范圍較廣、通用性較好等優(yōu)點(diǎn)[29]，目前已經(jīng)被大規(guī)模應(yīng)用在植物基因組的研究中，如種質(zhì)資源遺傳多樣性的分析、遺傳圖譜的構(gòu)建和功能基因組學(xué)研究等[30]。冀芳芳[31]使用EST-SSR 分子標(biāo)記研究了萱草屬植物的種質(zhì)資源遺傳多樣性，其觀測(cè)等位基因數(shù)、多態(tài)性信息含量平均值分別為9.209 3 和0.606 4。本試驗(yàn)收集了從大同市云州區(qū)33 個(gè)村落中采集的黃花菜種質(zhì)以及8 個(gè)已知來(lái)源的萱草屬植物，并使用山西農(nóng)業(yè)大學(xué)黃花菜種質(zhì)資源創(chuàng)新與利用課題組前期開(kāi)發(fā)的43 對(duì)多態(tài)性EST-SSR 分子標(biāo)記對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，EST-SSR 標(biāo)記表現(xiàn)出了較好的多態(tài)性，篩選出的18 對(duì)EST-SSR 標(biāo)記能夠很好地區(qū)分待測(cè)種質(zhì)，對(duì)146 份萱草屬植物種質(zhì)共擴(kuò)增出88 條多態(tài)片段，平均每對(duì)引物擴(kuò)增出4.89 條多態(tài)片段，多態(tài)性信息含量的平均值為0.298 2，這是由于大同地區(qū)黃花菜的遺傳背景相似，材料遺傳變異小，結(jié)合基于遺傳相似系數(shù)矩陣的聚類(lèi)分析，本試驗(yàn)所收集的134 份大同地區(qū)黃花菜種質(zhì)與參考種質(zhì)大同黃花聚類(lèi)在一起，證明了這一點(diǎn)。本研究中，分子標(biāo)記聚類(lèi)將146 份種質(zhì)資源分為兩大類(lèi)群，每個(gè)種質(zhì)間的遺傳相似系數(shù)平均值為0.960 4（0.443 0～1.000 0），大同大部分地區(qū)的黃花菜種質(zhì)資源與參考種質(zhì)大同黃花的遺傳相似系數(shù)均為1.000 0。黃花菜類(lèi)群中，134 份來(lái)自大同市云州區(qū)的黃花菜種質(zhì)資源與參考種質(zhì)大同黃花聚類(lèi)在一起，小黃花與2 個(gè)來(lái)自峰峪村和2 個(gè)來(lái)自賀店村的種質(zhì)聚類(lèi)在一起；萱草類(lèi)群中只包含搖籃曲、海爾范、兒童節(jié)萱草、龍游紅花4 個(gè)參考種質(zhì)。小黃花和沖里花1 號(hào)的遺傳相似系數(shù)均為0.691 4，4 個(gè)萱草參考種質(zhì)之間的遺傳相似系數(shù)為0.474 4～0.658 5，它們的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，所以聚在了不同的組中。2009 年，黎海利等[3] 利用AFLP 標(biāo)記對(duì)35 份萱草野生種和栽培品種進(jìn)行了親緣關(guān)系研究，結(jié)果顯示，同一產(chǎn)地的品種基本可以聚類(lèi)在一起，與本研究的聚類(lèi)結(jié)果相同，再次表明黃花菜的親緣關(guān)系與其來(lái)源地有很大關(guān)系。

由遺傳結(jié)構(gòu)分析可知，除了峰峪村和賀店村的黃花菜種質(zhì)與小黃花親緣關(guān)系較近以外，來(lái)自大同市云州區(qū)的135 份種質(zhì)資源都與大同黃花在一個(gè)類(lèi)群。大同黃花與大荔黃花親緣關(guān)系較近，與小黃花和沖里花1 號(hào)的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，這與LI 等[13]對(duì)于155 份萱草屬植物的聚類(lèi)分析結(jié)果一致。在K 值為2 時(shí)，小黃花和沖里花1 號(hào)與萱草類(lèi)群的遺傳結(jié)構(gòu)相似，無(wú)法進(jìn)行區(qū)分，這可能是由標(biāo)記的數(shù)量不足而導(dǎo)致。當(dāng)K 值增大后，小黃花和沖里花1 號(hào)有了明顯的區(qū)分，這與后邊的聚類(lèi)結(jié)果一致。冀芳芳[32]利用EST-SSR 分子標(biāo)記與群體結(jié)構(gòu)分析，在K 值為2 時(shí)，將141 份萱草屬種質(zhì)材料分為2 個(gè)類(lèi)群。

史青青[33]對(duì)155 份萱草種質(zhì)材料進(jìn)行遺傳結(jié)構(gòu)分析，在K 值為2 時(shí)將155 份萱草種質(zhì)材料分為黃花菜和萱草兩大類(lèi)群，與本研究聚類(lèi)結(jié)果一致。

結(jié)合遺傳多樣性分析、遺傳結(jié)構(gòu)分析和聚類(lèi)分析結(jié)果，可知除了來(lái)自峰峪村的40 號(hào)和47 號(hào)以及來(lái)自賀店村的121 號(hào)和122 號(hào)這4 份黃花菜種質(zhì)外，其余134 份來(lái)自大同市云州區(qū)的黃花菜種質(zhì)資源全部為大同黃花。本研究結(jié)果為大同市區(qū)域優(yōu)良種質(zhì)鑒定及選育提供了理論依據(jù)，也為云州區(qū)黃花菜產(chǎn)區(qū)的品牌保護(hù)提供了有力支持。