黃芪根腐病病原菌的分離鑒定及對其抑制作用分析

摘要：黃芪（Astragalus membranaceus）是膜莢黃芪和蒙古黃芪的干燥根，根部受病原菌侵染會導致根腐病發(fā)生，根腐病會嚴重影響黃芪的藥用價值及其產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。黃酮和皂苷類物質(zhì)屬于黃芪的次級代謝物，也是黃芪的主要藥用成分。為了明確黃芪根腐病致病菌類型以及黃芪黃酮和皂苷對病原菌的抑制作用，為防治該致病菌引起的根腐病以及研究黃芪次級代謝物參與黃芪抗病奠定基礎(chǔ)，從山西省渾源縣取回黃芪病株進行病原菌的分離鑒定，并研究黃芪根部總黃酮和總皂苷對病原菌生長的抑制作用；通過形態(tài)學觀察、ITS 序列分析和致病性鑒定，明確黃芪根腐病病原菌為腐皮鐮刀菌HYFS-1。結(jié)果表明，30% 的無水乙醇對腐皮鐮刀菌菌落生長無影響，可作為總黃酮和總皂苷的稀釋液；當總黃酮質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL 時，對菌落生長具有顯著抑制作用，平均抑制率為16.42%；當總皂苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時，對菌落生長具有顯著抑制作用，平均抑制率高達85.42%。

關(guān)鍵詞：黃芪根腐病；腐皮鐮刀菌；總黃酮；總皂苷；抑制作用

中圖分類號：S435.67 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0690?06

黃芪是豆科多年生草本藥用植物，黃芪根腐病的發(fā)生會嚴重影響其藥用價值。目前報道的黃芪根腐病病原菌主要有立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）、尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）、腐皮鐮刀菌（Fusarium solani）、銳頂鐮刀菌（Fusarium acuminatum）、芬芳鐮刀菌（Fusarium redolens）、鏈格孢菌（Alternariasp）、逗號鐮刀菌（Fusarium virguliforme）、木賊鐮刀菌（Fusarium equiseti）等，而各個地區(qū)的主要病原菌也隨著地區(qū)不同而有差異[1-8]。雖然分離到的黃芪根腐病病原菌有很多，但由于植物病原菌的長期互作，會導致病原菌的致病能力發(fā)生變異，所以需要不斷地進行致病菌的分離與鑒定。

據(jù)報道，黃酮類和皂苷類化合物對于細菌有很好的抑制作用，黃芪中的皂甙已被證明能抑制致病菌金黃色葡萄球菌和枯草桿菌等的生長[9]，苦蕎麩皮黃酮提取物能抑制致病菌大腸桿菌和沙門氏菌等的生長[10]。此外，皂苷類化合物對于真菌也有一定的抑制作用，人參莖葉總皂苷對人參根腐病病原菌腐皮鐮刀菌的生長有很好的抑制作用[11]。而有關(guān)黃芪有效成分如黃酮類和皂苷類化合物對于黃芪根腐病致病菌生長的抑制未見相關(guān)報道。

本研究擬從黃芪病株中分離根腐病病原菌，通過形態(tài)觀察和分子鑒定明確病原菌類型，通過接種鑒定明確病原菌對黃芪的致病作用；提取黃芪根部總黃酮和總皂苷，通過平板培養(yǎng)來明確其對病原菌生長的抑制作用，旨在明確黃芪有效成分在抑制病原菌中的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

病原菌分離所用的黃芪病株在2021 年取自于山西大同渾源縣；致病性鑒定所用材料為蒙古黃芪；根部總皂苷和總黃酮的提取用的是2～3 年生的黃芪植株。

1.2 病原菌的分離與純化

病原菌的分離與純化采用的是組織分離法[3]，其中0.1% HgCl2 被0.1% NaClO 替代，其余方法不變。挑取菌絲末端進行純化培養(yǎng)。分離純化所使用的培養(yǎng)基是北京索萊寶科技有限公司的PDA 培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件為27 ℃的黑暗環(huán)境。

1.3 病原菌的形態(tài)觀察

在純化過的真菌平板邊緣取6 mm 的菌餅放置到新的PDA 培養(yǎng)基上置于27 ℃ 的黑暗環(huán)境下培養(yǎng)，用于觀察菌落特征和分生孢子，分生孢子使用熒光顯微鏡（Leica DM6B）觀察。參照《真菌鑒定手冊》[12]對真菌進行鑒定。

1.4 病原菌的分子鑒定

取培養(yǎng)5 d 的菌絲，利用生工生物Ezup 柱式真菌基因組DNA 抽提試劑盒進行DNA 提取，以DNA 為模板，以真菌鑒定引物ITS 4（5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）和ITS 5（5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3'）進行PCR 擴增（表1），反應條件：95 ℃ 預變性5 min；94 ℃變性30 s；57 ℃退火30 s；72 ℃延伸90 s，30 個循環(huán)后72 ℃終延伸10 min。用1% 的瓊脂糖凝膠電泳對10 μL PCR產(chǎn)物進行檢測。利用生工生物SK8131 膠回收試劑盒進行PCR 產(chǎn)物回收，送生工生物工程股份有限公司進行測序。測序結(jié)果在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索，利用MEGA 7.0 軟件鄰接法（Neighbor-Joining）（bootstrap 設(shè)為1 000）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 病原菌致病性鑒定

參考NIU 等[13]大豆根腐病下胚軸鑒定方法對黃芪4～5 葉期進行子葉節(jié)下1 cm 根部接種病原菌6 mm 菌餅，25 ℃、100% 濕度下保濕2 d 后放到25 ℃16 h 光照/8 h 黑暗下生長，每天觀察植株發(fā)病情況。

1.6 總黃酮和總皂苷的提取

分別用干燥的3 年生黃芪根部進行總黃酮的提取和2 年生黃芪根部進行總皂苷的提取，提取方法使用的是閃式提取法[14]?？傸S酮含量采用紫外分光光度法測定，以蘆丁為標品繪制標準曲線；總皂苷含量利用香草醛-濃硫酸比色法測定，以黃芪甲苷為標品繪制標準曲線。

1.7 病原菌抑制試驗

總黃酮抑制試驗：提取出總黃酮后，用30% 的無水乙醇對其進行稀釋，稀釋質(zhì)量濃度分別0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/mL。分別在PDA 培養(yǎng)基上涂布1 mL 不同總黃酮溶液于超凈臺里吹干后在培養(yǎng)基中央接種6 mm 病原菌菌餅，每處理設(shè)3 個重復，置于27 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，每天測定其病菌生長直徑，以涂1 mL 30% 無水乙醇為對照。

總皂苷抑制試驗：提取出總皂苷后，用30% 的無水乙醇對其進行稀釋，稀釋質(zhì)量濃度分別為0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL。在PDA 培養(yǎng)基上涂布1 mL 不同濃度的總皂苷溶液在超凈臺里吹干后在培養(yǎng)基中央接種6 mm 的病原菌菌餅，每個處理設(shè)3 個重復，置于27 ℃恒溫黑暗培養(yǎng)，每天測量其病菌生長直徑，以涂1 mL 30% 的無水乙醇為對照。

菌落平均直徑（mm）=測量菌落平均值－菌餅直徑（6 mm） （1） 菌落生長抑制率=1－處理菌落平均直徑/對照菌落平均直徑×100% （2） 平均抑制率=同一濃度每天抑制率之和/天數(shù)（3）1.8 數(shù)據(jù)分析利用SPSS 23軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析和Duncan多重比較檢驗，設(shè)置Plt;0.05為顯著性水平。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離鑒定及致病性鑒定

2.1.1 病原菌的分離及致病性鑒定 對黃芪病株進行病原菌分離純化共獲得5 個真菌分離物，分別將5 株真菌分離物PDA 菌餅通過下胚軸接種法（圖1-A）于4～5 葉期蒙古黃芪進行致病性鑒定，以接種空白PDA 菌餅為對照。結(jié)果表明，只有其中1 種真菌分離物接種黃芪2 d 后葉片開始萎蔫直到植株枯萎（圖1-B），而空白對照（圖1-C）和其余4 株真菌分離物接種黃芪長勢正常。在枯萎植株接種部位取樣約0.5 cm 進行致病菌再分離，發(fā)現(xiàn)菌落的正面形態(tài)（圖1-D）和致病菌（圖2-A）形態(tài)一致，符合柯赫氏法則，說明該真菌分離物為致病菌。

2.1.2 致病菌的形態(tài)學鑒定 致病菌在PDA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)3 d 的菌落生長直徑為17～20 mm，培養(yǎng)5 d 的菌落生長直徑為41～53 mm，初期菌落背面和菌絲為白色，菌絲稀疏整體成絨毛狀（圖2-A），后期菌落背面為粉色且出現(xiàn)同心輪紋（圖2-B）。

大型分生孢子背部腹部兩側(cè)平行，兩端鈍圓向內(nèi)稍彎曲，內(nèi)部多見3 個隔膜（圖2-C）。小型分生孢子為卵型、腎型和橢圓型，多為無隔（圖2-D）。參考《真菌鑒定手冊》初步推斷該致病菌為腐皮鐮刀菌Fusarium solani。

2.1.3 致病菌的分子鑒定 以致病菌基因組DNA 為模板，利用鑒定真菌的核糖體通用引物ITS 4 和ITS 5 對致病菌進行PCR 擴增，結(jié)果如圖3 所示。

圖３ 結(jié)果顯示，該片段大小為568 bp，測序后進行序列比對，發(fā)現(xiàn)該基因與腐皮鐮刀菌親緣關(guān)系較近（圖4）。結(jié)合形態(tài)學鑒定確定該致病菌為腐皮鐮刀菌Fusarium solani，將其暫時命名為HYFS-1。

2.2 HYFS-1 生長抑制作用研究

2.2.1 30% 無水乙醇對HYFS-1 生長的影響 選取30% 無水乙醇稀釋總黃酮和總皂苷溶液，空白對照均為涂抹1 mL 的30% 無水乙醇。為證明30% 無水乙醇對HYFS-1 的影響，在研究黃酮抑制HYFS-1 的過程中加入1 個未做任何添加的PDA平板接菌對照（直接接菌），結(jié)果如表2 所示。

表2 結(jié)果顯示，直接接菌的菌落生長與加30%無水乙醇相比沒有差異。說明30% 無水乙醇可作為稀釋液，且在PDA 平板上添加1 mL 的30% 無水乙醇可作為對照。

2.2.2 不同濃度總黃酮對HYFS-1 生長的影響 分別在涂布總黃酮質(zhì)量濃度為0、0.01、0.05、0.1、0.3、0.5、0.8、1.0 mg/mL 的PDA 培養(yǎng)基中接種直徑為6 mm 的HYFS-1 菌餅，從第2 天開始測量菌落直徑并對每天不同濃度下菌落直徑進行顯著性分析，結(jié)果顯示，當質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL 時菌落直徑顯著低于對照，開始有抑制作用（Plt;0.05），且與質(zhì)量濃度gt;0.3 mg/mL 的處理沒有顯著差異（Pgt;0.05）（表2、圖5）。說明總黃酮質(zhì)量濃度為0.3 mg/mL是抑制腐皮鐮刀菌生長的最低濃度，且該濃度下平均抑制率為16.42%。

2.2.3 不同濃度下總皂苷對HYFS-1 生長的影響 分別在涂布質(zhì)量濃度為0、0.05、0.1、0.25、0.5 mg/mL 的PDA 培養(yǎng)基中接種直徑為6 mm 的HYFS-1 菌餅，從第2 天開始測量菌落直徑并對每天不同濃度下菌落直徑進行顯著性分析，結(jié)果顯示（表3、圖6），質(zhì)量濃度為0.25、0.5 mg/mL 時菌落直徑顯著低于對照（Plt;0.05）。當總皂苷質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL 時，對菌落生長的平均抑制率較大，達到85.42%，說明總皂苷濃度高時抑制作用較強。

3 結(jié)論與討論

黃芪根腐病是土傳病害，主要危害黃芪根部和莖基部[15]，一旦根部腐爛受損，就失去了藥用價值。

為深入解該病害，從山西渾源縣帶回病株進行病原菌的分離，分離的病原菌腐皮鐮刀菌HYFS-1 菌落背面為白色至粉色，與山西渾源縣已報道的腐皮鐮刀菌菌落背面顏色為白色至土黃色[3]不一致，推測本研究分離的腐皮鐮刀菌為新的致病菌株，可能是由于腐皮鐮刀菌長期與植物互作發(fā)生了變異，也可能是由于分離腐皮鐮刀菌的病株取自渾源縣不同的根腐病區(qū)。

植物在遭受病原菌等生物和非生物脅迫時，酚類、黃酮類、生物堿和萜類化合物等次級代謝物的生物合成能在植物抗逆中起重要作用[16-18]。黃芪干燥根中含有黃酮皂苷類等有效成分，屬于天然的防御屏障，本研究在體外分別測定了黃芪根部總黃酮和總皂苷的抑菌率，結(jié)果表明總黃酮平均抑制率為16.42%，總皂苷平均抑制率高達85.42%，說明與總黃酮相比，總皂苷在抑制腐皮鐮刀菌生長中起主要作用。有研究學者利用人參莖葉總皂苷對人參根腐病致病菌腐皮鐮刀菌進行抑制研究，結(jié)果表明，人參莖葉總皂苷質(zhì)量濃度為10 mg/mL 時，抑制率高達67.79%[11]?？傸S酮和總皂苷抑菌能力可能與它們自身抗病機理有關(guān)，黃酮類物質(zhì)主要作為抗氧化劑在脅迫中保護植物免受脅迫過程中的氧化性損傷[19-20]，而皂苷類物質(zhì)主要通過破壞真菌膜結(jié)構(gòu)進而起到抗病作用[21]，能直接作用于病原菌。

人參莖葉總皂苷高濃度下能影響人參致病菌腐皮鐮刀菌細胞膜的透性[11]。有關(guān)本研究中總皂苷抑制腐皮鐮刀菌生長機理有待進一步研究。

本研究還發(fā)現(xiàn)，總皂苷質(zhì)量濃度為0.25 mg/mL時開始對腐皮鐮刀菌菌落生長有明顯抑制作用、為0.5 mg/mL 時抑制作用更顯著，初步推測黃芪植株的抗性可能與植株中總皂苷的濃度相關(guān)。據(jù)報道，大豆和菜豆中可溶性色素的含量可以作為抗大豆菌核病的一種指標[22-23]，且可溶性色素含量的測定已被用作基因定位研究中的表型指標[24-25]?？傇碥漳芊褡鳛榭裹S芪根腐病的指標有待進一步研究。