禽流感病毒H7和N2亞型nano-dPCR檢測(cè)方法的建立和應(yīng)用

摘要：為建立一種同時(shí)檢測(cè)H7 亞型和N2 亞型禽流感病毒（AIV）的雙重納米PCR（nano-dPCR）方法，從Gen‐Bank 中分別下載H7 亞型AIV 的HA 基因序列和N2 亞型AIV 的NA 基因序列，采用Primer 7.0 和Oligo 6.0 軟件設(shè)計(jì)了2 對(duì)特異性引物，通過對(duì)nano-dPCR 反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化確定最佳反應(yīng)體系；利用優(yōu)化好的反應(yīng)體系開展nano-dPCR 方法的特異性和敏感性試驗(yàn)；采集活禽市場(chǎng)家禽咽喉及泄殖腔拭子樣品進(jìn)行臨床樣品檢測(cè)并進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，成功建立了一種同時(shí)檢測(cè)H7 亞型（723 bp）和N2 亞型（314 bp）AIV 的nano-dPCR 方法，該方法特異性良好，其他亞型禽流感病毒及常見禽類呼吸道病毒均未出現(xiàn)特異性的條帶，H7 亞型AIV 和N2 亞型AIV 的最低核酸檢測(cè)量分別達(dá)到了5×103、5×103 拷貝/μL，其敏感性是普通雙重PCR 檢測(cè)方法的10 倍，其對(duì)臨床樣品檢測(cè)結(jié)果準(zhǔn)確率達(dá)到100%，可以用于禽流感臨床樣品鑒別診斷和日常防控監(jiān)測(cè)。

關(guān)鍵詞：禽流感病毒；雙重納米PCR；H7 亞型；N2 亞型

中圖分類號(hào)：S852.65+7 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2023）06?0709?07

流感病毒（Influenza Virus）屬于正黏病毒科流感病毒屬，分為甲型（A）、乙型（B）、丙型（C）和丁型（D）4 種，其中A 型流感病毒基因組由8 個(gè)片段組成，從大到小依次為PB2、PB1、PA、HA、NP、NA、M、NS[1]。根據(jù)A 型流感病毒表面的血凝素（HA）和神經(jīng)氨酸酶（NA）2 種蛋白可分為多個(gè)不同的亞型，目前已知HA 亞型有18 種，NA 亞型有11 種[2-3]。

除了H17N10 和H18N11 亞型在蝙蝠中被發(fā)現(xiàn)以外，所有其他已知的A 型流感病毒亞型都可以感染鳥類[4-5]。H7 亞型禽流感病毒（Avian influenzavirus，AIV）有9 種不同亞型組合，已知的亞型包括H7N1、H7N2、H7N3、H7N4、H7N5、H7N6、H7N7、H7N8 和H7N9[6-8]。目前在世界各地的野生鳥類和家禽中發(fā)現(xiàn)的大多數(shù)H7 亞型病毒屬于低致病禽流感病毒（LPAIV）[9]，H7N2 亞型AIV 自1994 年起在美國東北部的活禽市場(chǎng)流行數(shù)十年，2002 年，LU等[10]首次證明LPAI H7N2 可以感染人。2003 年，AKEY 從美國一名住院患者的呼吸道分離到一株H7N2 病毒，2007 年英國活禽市場(chǎng)發(fā)現(xiàn)H7N2 亞型AIV 并出現(xiàn)感染人的病例[11-12]。2002 年，王傳彬等[13]首次在中國無明顯臨床癥狀的雞體內(nèi)分離到H7N2 亞型LPAIV；隨后活禽市場(chǎng)不斷分離到H7N2 亞型AIV[14]。與人類感染相關(guān)最常見的是H7N9 亞型AIV，2013 年首次在中國發(fā)現(xiàn)，目前已造成1568 人感染[15]，并在2017 年初出現(xiàn)了對(duì)雞和人都呈現(xiàn)高致病性的H7N9 亞型AIV[16]。H7 亞型AIV 的不斷暴發(fā)和流行提醒人們，H7 亞型AIV 特別是H7N2 亞型AIV 已經(jīng)對(duì)養(yǎng)禽業(yè)和公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重威脅，需要加強(qiáng)對(duì)其監(jiān)測(cè)和防控。

目前，AIV 檢測(cè)技術(shù)主要包括病毒的分離及培養(yǎng)、血清學(xué)試驗(yàn)和免疫熒光等傳統(tǒng)方法，由于AIV亞型眾多且新的變異株不斷出現(xiàn)，使用上述傳統(tǒng)檢測(cè)方法對(duì)其進(jìn)行分型和診斷不僅存在著操作方法復(fù)雜，而且檢測(cè)周期長(zhǎng)及容易受抗體等因素影響使得檢測(cè)結(jié)果不能準(zhǔn)確和及時(shí)[17]。分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)是近年AIV 檢測(cè)技術(shù)發(fā)展的主流，具有快速準(zhǔn)確和特異性好等優(yōu)點(diǎn)[18]。納米PCR 技術(shù)是一種在PCR 反應(yīng)中添加了納米金屬顆粒，能夠使PCR 反應(yīng)更快地達(dá)到目標(biāo)溫度，同時(shí)減少非特異擴(kuò)增和提高反應(yīng)的靈敏性[19]。隨著納米PCR 技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)有多種納米PCR 技術(shù)檢測(cè)動(dòng)物病原體的研究報(bào)道[20-22]，而利用雙重納米PCR（nano-dPCR）技術(shù)同時(shí)檢測(cè)和鑒別H7 及N2 亞型AIV 的檢測(cè)技術(shù)尚未見有報(bào)道。本研究旨在建立一種同時(shí)檢測(cè)H7 亞型和N2 亞型AIV 的nano-dPCR 方法，為H7 和N2 亞型AIV 快速鑒別診斷和防控提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 納米PCR 試劑盒（NPK02）購自上海滬崢生物科技有限公司；DNA Marker、逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV、dNTP、2×PCR Mix 混合液、PMD18-T 連接載體和RNA 酶抑制劑均購自寶生物（北京）有限公司；RNA/DNA 核酸提取試劑盒、膠回收純化試劑盒、小量質(zhì)粒提取試劑盒和大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購均自北京全式金生物技術(shù)有限公司；其他相關(guān)試劑購自商業(yè)公司。

1.1.2 毒株來源 毒株H7N2、H14N5、H15N9 和H16N3 亞型AIV 的cDNA 模板由美國賓夕法尼亞州立大學(xué)惠贈(zèng)；H5N1 亞型AIV 的cDNA 模板由美國康涅狄格州立大學(xué)惠贈(zèng)；H1N1、H3N6、H6N6、H9N2、H9N6 亞型AIV、NDV、IBV、ILTV 和ChPV均由廣西獸醫(yī)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存；其他亞型AIV（H2N3、H4N3、H8N4、H10N3、H11N3、H12N5和H13N6）毒株或cDNA 模板均由香港大學(xué)惠贈(zèng)。

1.2 方法

1.2.1 引物的設(shè)計(jì)與合成 在GenBank 中分別搜索不同宿主和地區(qū)來源的N2 亞型AIV NA 基因和H7 亞型AIV HA 基因的核苷酸序列并以FASTA格式下載，將整理好的上述序列運(yùn)用DNAStar 軟件進(jìn)行比較和分析。根據(jù)分析結(jié)果，采用Primer 7.0和Oligo 6.0 軟件分別設(shè)計(jì)HA 基因和NA 基因針對(duì)性的特異引物，然后通過BLAST 對(duì)所設(shè)引物進(jìn)行在線驗(yàn)證。特異性引物序列如表1 所示，上述引物均由捷尼斯生物公司合成。

1.2.2 病毒核酸的提取 嚴(yán)格參照核酸提取試劑盒的使用說明書對(duì)所用到的AIV、NDV、IBV、ILTV 和CHPV 的DNA/RNA 進(jìn)行抽提，DNA/RNA 模板用DEPC 水溶解。RNA 模板參照反轉(zhuǎn)錄酶說明書合成cDNA（反轉(zhuǎn)錄引物為9 堿基隨機(jī)引物），DNA 模板直接保存，所有模板制備完成后均置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.3 nano-dPCR 反應(yīng)體系及條件的優(yōu)化 初步確定nano-dPCR 方法的PCR 反應(yīng)體系總體積為25 μL：2×Nano-PCR buffer 12.5 μL，Taq DNApolymerase（5 U/μL）0.8 μL，所用引物的工作濃度均為25 pmol/μL，將引物分為0.1～1.0 μL 10 個(gè)不同梯度分別組成對(duì)應(yīng)的多個(gè)不同引物濃度組合，依次分別加入反應(yīng)體系中進(jìn)行不同引物組合濃度的優(yōu)化篩選，相同濃度的模板cDNA 各加入1 μL，最后用超純水將反應(yīng)總體積補(bǔ)足至25 μL；初步反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，50 ℃ 20 s，72 ℃30 s，30 個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min 結(jié)束反應(yīng)。根據(jù)同一PCR 條件下（體系、反應(yīng)時(shí)間和模板量相同）相同上樣量PCR 產(chǎn)物電泳條帶的強(qiáng)弱，選擇同一泳道中2 個(gè)條帶最亮的引物組合作為最佳引物濃度組合（同時(shí)兼顧nano-dPCR 靈敏度和特異性）。進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)體系的退火溫度（46～53 ℃）進(jìn)行優(yōu)化，最終根據(jù)凝膠結(jié)果確定nano-dPCR 方法的最佳反應(yīng)條件體系。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 按照優(yōu)化好的nano-dPCR 最佳反應(yīng)條件體系，選擇不同禽流感亞型及常見禽病病原體H1N1、H2N3、H3N6、H4N6、H5N1、H6N6、H7N2、H7N9、H8N4、H9N2、H9N6、H10N3、H11N3、H12N5、H13N6、H14N5、H15N9、H16N3、NDV、IBV、ILTV 和ChPV 進(jìn)行檢測(cè)方法的特異性驗(yàn)證，用ddH2O 做陰性對(duì)照。同時(shí)對(duì)PCR 擴(kuò)增出的目的片段進(jìn)行純化回收，快速連接至PMD18-T載體并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中進(jìn)行基因克隆，PCR 鑒定后挑選陽性單克隆菌液送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，驗(yàn)證產(chǎn)物的特異性。

1.2.5 質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 質(zhì)粒的制備參照文獻(xiàn)[23]的方法，用特定全長(zhǎng)基因引物分別擴(kuò)增N2 亞型AIV NA 基因及H7 亞型AIV HA 基因，分別將上述基因片段PCR 產(chǎn)物克隆到PMD18-T 載體中，挑選PCR 鑒定陽性的單克隆菌液送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。將測(cè)序驗(yàn)證正確的分別含有N2 亞型AIV NA 基因和H7 亞型AIV 的HA 基因的2 個(gè)重組質(zhì)粒分別命名為N2-T 和H7-T，用小量質(zhì)粒抽提試劑盒分別提取擴(kuò)大培養(yǎng)含有質(zhì)粒的陽性菌液，獲得的質(zhì)粒用超微量紫外可見光分光度計(jì)分別進(jìn)行核酸濃度測(cè)定。根據(jù)核酸測(cè)定結(jié)果計(jì)算其對(duì)應(yīng)的質(zhì)粒模板拷貝數(shù)，將N2-T 和H7-T 質(zhì)粒進(jìn)行等拷貝數(shù)混合。將混合好的質(zhì)粒進(jìn)行10 倍倍比稀釋，最終得到2 種質(zhì)粒DNA 濃度均為6×109～6×101拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.6 敏感性試驗(yàn) 運(yùn)用所建立的H7 和N2 亞型禽流感病毒雙重普通PCR（dPCR）和nano-dPCR檢測(cè)方法對(duì)上述所制備濃度6×109～6×101拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行特異性擴(kuò)增，并根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果確定2 種方法的敏感性。

1.2.7 臨床樣品檢測(cè) 對(duì)廣西地區(qū)不同活禽市場(chǎng)隨機(jī)采集的130 份家禽咽喉及泄殖腔拭子樣品進(jìn)行處理，運(yùn)用建立的nano-dPCR 檢測(cè)方法對(duì)處理后的樣品進(jìn)行檢測(cè)鑒定。為驗(yàn)證nano-dPCR 檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，同時(shí)將同管剩余樣品接種SPF 雞胚進(jìn)行病毒分離，并對(duì)病毒分離陽性的樣品擴(kuò)增HA和NA 基因全長(zhǎng)。最終將nano-dPCR 陽性產(chǎn)物和雞胚分離病毒鑒定PCR 陽性產(chǎn)物全部送測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序，并根據(jù)測(cè)結(jié)果驗(yàn)證nano-dPCR 檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 H7亞型和N2亞型AIV nano-dPCR 方法的建立

通過nano-dPCR 方法分別對(duì)H7 亞型AIV 和N2 亞型AIV 的目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，電泳檢測(cè)結(jié)果表明分別獲得723、314 bp 的目的基因片段（圖1），產(chǎn)物片段大小與預(yù)期相符。

2.2 H7 亞型和N2 亞型AIV nano-dPCR 檢測(cè)方法最佳退火溫度和反應(yīng)條件的確定

nano-dPCR 經(jīng)退火溫度（46～53 ℃）優(yōu)化，電泳結(jié)果如圖2 所示。

從圖2 可以看出，選擇48 ℃ 作為nano-dPCR檢測(cè)方法最佳退火溫度。對(duì)不同梯度引物組合篩選的最終結(jié)果表明，H7 亞型和N2 亞型最佳引物組合（同時(shí)保證nano-dPCR 擴(kuò)增的靈敏度和特異性）為：H7 1.0 μL 和N2 0.8 μL（引物濃度25 pmol/μL，反應(yīng)體系為25 μL）。最終確定nano-dPCR 方法最佳反應(yīng)體系包括：2×Nano-PCR buffer 12.5 μL，Taq DNA polymerase（5 U/μL）0.8 μL，模板cDNA 2 μL，引物H7-F 和H7-R（25 pmol/μL）分別為1.0 μL、引物N2-F 和N2-R（25 pmol/μL）分別為0.8 μL，最后用ddH2O 補(bǔ)足25 μL。

2.3 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立nano-dPCR 檢測(cè)方法的特異性良好。該方法對(duì)H7N2 亞型AIV分別擴(kuò)增出723、314 bp 這2 條特異性條帶；對(duì)H7N9 亞型AIV 即H7Ny（N1-N9，y≠2）亞型AIV僅擴(kuò)增出723 bp 1 條特異性條帶；對(duì)H9N2 亞型AIV 即HxN2（H1-H16，x≠7）亞型AIV 僅擴(kuò)增出1 條314 bp 的特異性條帶，同時(shí)nano-dPCR 對(duì)其他常見的禽病病原體以及其他不同亞型AIV 的擴(kuò)增均未出現(xiàn)目的條帶（圖3）。

2.4 敏感性試驗(yàn)

H7 亞型和N2 亞型AIV nano-dPCR（A）和dPCR（B）敏感性試驗(yàn)結(jié)果如圖4 所示。

從圖4 可以看出，用ddH2O 對(duì)初始濃度分別為6×109、6×109 拷貝/μL 的H7-T 和N2-T 混合質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行10 倍倍比稀釋，對(duì)稀釋后樣品用超微量紫外可見光分光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定驗(yàn)證其濃度，然后用nano-dPCR 和dPCR 同時(shí)檢測(cè)不同稀釋度的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品。敏感性試驗(yàn)結(jié)果表明，nano-dPCR 可檢測(cè)質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的最低拷貝數(shù)分別為6×103、6×103 拷貝/μL，而dPCR 方法對(duì)相同模板檢測(cè)的最低拷貝數(shù)分別為6×104、6×104 拷貝/μL。結(jié)果表明，nano-dPCR 檢測(cè)方法的敏感性比dPCR 檢測(cè)方法高10 倍。

2.5 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用nano-dPCR 方法對(duì)廣西不同活禽市場(chǎng)采集的130 份家禽（包含雞30 份、鴨80 份和鵝20 份）棉拭子樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示，H7 亞型AIV 陽性率為0.77%（1/130），N2 亞型AIV 陽性率為20.77%（27/130），未有H7N2 混合AIV 陽性。nano-dPCR陰性樣品中其他亞型AIV 陽性率為7.69%（10/130，分離鑒定與測(cè)序結(jié)果）（表2）。所有nano-dPCR陽性產(chǎn)物測(cè)序分析結(jié)果顯示，723 bp 產(chǎn)物均為H7亞型AIV HA 基因特異性片段，314 bp 產(chǎn)物均為N2 亞型AIV NA 基因特異片段。nano-dPCR 方法與雞胚分離方法結(jié)果完全一致，HA 基因和NA 基因全長(zhǎng)基因測(cè)序結(jié)果與nano-dPCR 方法的檢測(cè)結(jié)果也完全一致。上述結(jié)果表明，所建立的nano-dPCR方法可以應(yīng)用于對(duì)H7 亞型和N2 亞型AIV 臨床樣品的監(jiān)測(cè)和鑒別診斷。

3 結(jié)論與討論

A 型流感病毒自然宿主為野生水禽，還可以感染各種家禽、哺乳動(dòng)物以及人類，呈季節(jié)性流行，也能引起大流行[24]。研究表明，H5、H7 和H9 亞型AIV 引起的AI 是目前對(duì)家禽養(yǎng)殖業(yè)危害最嚴(yán)重的3 種亞型[25-26]。近年來，家禽中HPAI 和LPAI H7病毒的暴發(fā)已導(dǎo)致全球超過7 000 萬家禽的死亡，不僅暴發(fā)的亞型多，而且波及的國家和地區(qū)范圍較廣，包括歐洲的德國、荷蘭、愛爾蘭、意大利等及美洲的美國、加拿大和智利等[27]。中國于2003 年首次分離到H7N2 亞型AIV，此后于2014 年2 月在人感染H7N9 AIV 患者家中的雞群中分離到由H7N9和H9N2 亞型AIV 重組形成的低致病性H7N2 亞型AIV[28]。2017 年初我國出現(xiàn)了感染人的高致病性H7N9 亞型AIV 后，2018 年又在福建省的鴨群中陸續(xù)出現(xiàn)高致病性鴨源H7N2 亞型AIV，對(duì)雞鴨的致死率均達(dá)到100%[29]，足見H7 亞型AIV 已經(jīng)在全球范圍內(nèi)流行，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，還對(duì)人類公共衛(wèi)生安全造成了嚴(yán)重的威脅[30]，應(yīng)加強(qiáng)對(duì)H7N2 亞型AIV 的持續(xù)監(jiān)測(cè)。

多重PCR 反應(yīng)受多種因素影響，本研究在引物設(shè)計(jì)時(shí)充分平衡各種影響多重PCR 的因素，同時(shí)設(shè)計(jì)了7 對(duì)不同的引物，通過分析引物的特異性及二聚體等，然后將引物進(jìn)行多個(gè)引物組合的篩選優(yōu)化，最終選擇一套最佳的引物對(duì)組合進(jìn)行nanodPCR擴(kuò)增。同時(shí)檢測(cè)H7 亞型和N2 亞型AIVnano-dPCR 與普通雙重PCR 的敏感性對(duì)比結(jié)果表明，nano-dPCR 敏感性比普通雙重PCR 高出10 倍，nano-dPCR 反應(yīng)時(shí)間也比普通dPCR 縮短15 min以上。此外，nano-dPCR 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果也表明其準(zhǔn)確率達(dá)到100%。付琦媛等[31]建立了鑒別豬流行性腹瀉病毒經(jīng)典株與變異株雙重納米R(shí)T-PCR檢測(cè)方法，李連燕[32]建立了犬巴貝斯蟲和犬埃立克體雙重納米PCR 方法，其檢測(cè)敏感度均比普通dPCR 高出100 倍。本研究所建立的nano-dPCR 檢測(cè)方法的敏感性只有上述方法敏感性的10%，這可能與不同亞型禽流感病毒HA 和NA 基因差異較小，導(dǎo)致設(shè)計(jì)引物的特異性與擴(kuò)增效率之間較難平衡等有關(guān)。nano-dPCR 與傳統(tǒng)的AIV 檢測(cè)鑒定方法相比，具有操作簡(jiǎn)便、高效省時(shí)和特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)，能快速檢測(cè)和區(qū)分H7 和N2 亞型AIV 的特異性片段，不使用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀等昂貴儀器，適宜在基層養(yǎng)殖企業(yè)和單位推廣，為H7 和N2 亞型AIV 快速鑒別診斷和預(yù)防奠定技術(shù)基礎(chǔ)。

本研究成功建立的同時(shí)檢測(cè)H7 和N2 亞型AIV 雙重納米PCR 方法，應(yīng)用所建立的nano-dPCR對(duì)活禽市場(chǎng)所采集的臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，家禽中N2 亞型AIV（包括H9N2、H3N2、H6N2 和H4N2等亞型）感染較高，但較少發(fā)現(xiàn)H7 亞型AIV 陽性，表明近年H7 亞型AI 防控取得了很好的效果。另外，本研究中未檢測(cè)出H7 亞型AIV 和N2 亞型AIV 的混合感染現(xiàn)象也表明目前廣西地區(qū)未出現(xiàn)H7N2 亞型AIV 的流行情況。