鴨TRPM3基因與產蛋性狀的關聯(lián)性分析

摘要：為探討鴨瞬時受體電位陽離子通道亞家族M 成員3（TRPM3）基因與鴨產蛋性狀的相關性，采用Illumina高通量測序法對90 只金定鴨TRPM3 基因序列進行測序，分析TRPM3 中6 個SNP 位點的基因型頻率及與不同基因型鴨產蛋數和蛋質量的關聯(lián)性，并將各突變位點組成單倍型后與鴨產蛋數和蛋質量差異進行相關性分析，采用熒光定量PCR 方法檢測TRPM3 mRNA 在產蛋數高和產蛋數低組鴨卵巢及輸卵管中的表達差異。結果表明，TRPM3 基因中Z-36500134 Tgt;C，Z-36503668 Agt;C，Z-36534782 Ggt;A，Z-36684262Cgt;T，Z-36710928 Agt;G，Z-367324876 Ggt;A 單個核苷酸的突變均引起產蛋數顯著降低，蛋質量顯著增加。鴨TRPM3 基因存在4 種單倍型，其中TAGCAG 單倍型為優(yōu)勢單倍型，該單倍型與鴨產蛋量呈極顯著正相關，與蛋質量呈極顯著負相關。

鴨TRPM3 基因在產蛋數高和產蛋數低組輸卵管中的表達差異不顯著，在產蛋數低組卵巢中的表達量顯著低于其在高產蛋組卵巢中的表達量。以上結果說明，TRPM3 在鴨的產蛋性能中可能發(fā)揮重要作用，而且可能是通過影響卵巢的功能而影響其產蛋性能。

關鍵詞：鴨；TRPM3；產蛋數；Illumina 高通量測序法；蛋質量；相關性

中圖分類號：S834 文獻標識碼：A 文章編號：1002?2481（2023）06?0716?05

TRPM3 基因（瞬時受體電位陽離子通道亞家族M 成員3）是瞬時受體電位家族成員，位于人9 號染色體。KUNIBA 等[1]于2009 年采用基因芯片技術在41 例歌舞伎綜合征患者的9q21.11-q21.12（約1.27 Mb）區(qū)域篩查到該區(qū)域10 個堿基替換，其中包含基因TRPM3，因此，推測TRPM3 的突變可能與歌舞伎綜合征有關。2020 年，SHIELS 等[2]研究表明，TRPM3 為一種自發(fā)性的鈣離子通道，對細胞鈣信號和穩(wěn)態(tài)很重要，可與TRPM1 形成異多聚體離子通道，對鈣離子和鋅離子是可滲透的且TRPM3 通道的激活與體感神經元的熱感覺、胰腺β 細胞的胰島素分泌，神經遞質釋放、虹膜收縮和促進腫瘤發(fā)生有關[3-6]。一直以來，TRPM3 在瞬時受體電位家族中是研究較少的一員，最近由于發(fā)現(xiàn)其在大腦病理學中的重要作用而受到廣泛關注[7]。

DYMENT 等[8]2019 年報道TRPM3 的從頭錯義突變與智力障礙和癲癇有關。DE SAINTE AGATHE等[9]發(fā)現(xiàn)TRPM3 中Val837Met 的突變與眼部和關節(jié)缺陷有關，并伴有非強制性癲癇。迄今為止，TRPM3 基因在家禽中的研究報道極少。僅見CUI等[10]2020 年報道，雞萎縮性卵巢中miR-204 高表達，該miRNA 的高表達促進了卵巢顆粒細胞凋亡并抑制其自噬，且miR-204 上述作用的發(fā)揮是通過TRPM3/AMPK/ULK 通路靶向抑制TRPM3 的表達而實現(xiàn)，揭示TRPM3 在家禽卵巢顆粒細胞中發(fā)揮重要作用。通過查詢NCBI 發(fā)現(xiàn)，TRPM3 基因位于小鼠、狗和豬的1 號染色體，大鼠的19 號染色體，雞、鴨的Z 染色體。Z 染色體在家禽中為性染色體，只在母禽中存在，進一步揭示TRPM3 在母禽中可能發(fā)揮非常重要的作用。

江蘇省家禽科學研究所水禽課題組前期通過對產蛋量高和產蛋量低的2 組金定鴨全基因組混池重測序發(fā)現(xiàn)，TRPM3 基因是與鴨產蛋量相關的候選基因之一，進一步測序和多重比對顯示，該基因上存在多個SNP 突變位點，揭示其在鴨的產蛋調控中可能發(fā)揮作用。為了進一步驗證TRPM3基因在母鴨產蛋中的作用，本研究采用Illumina 測序平臺對TRPM3 基因上6 個SNP 位點進行測序分型，將6 個SNP 位點組成的單倍型與鴨產蛋性能進行相關性分析，同時檢測了TRPM3 在產蛋數不同鴨卵巢和輸卵管組織中的mRNA 表達水平差異，旨在探討其在產蛋性能中的作用。

1 材料和方法

1.1 試驗動物

選擇228 只產蛋高峰期的金定鴨，從全群鴨日產蛋率達50% 時每天記錄每只鴨的產蛋量，連續(xù)記錄150 d，統(tǒng)計每只鴨150 d 的產蛋數。分別于299、300、301 d 時連續(xù)稱取蛋質量，記錄為300 d 平均蛋質量。每只鴨翅靜脈采集抗凝血2 mL，用于DNA 提取。同時按照從高到低的順序，選擇產蛋量排名前30 的鴨為高產組鴨，排名后30 的鴨為低產組鴨，分別統(tǒng)計2 組鴨的產蛋量和蛋質量，2 組分別隨機選擇8 只，采集輸卵管膨大部和卵巢皮質部組織，保存于-20 ℃冰箱用于RNA 提取。

1.2 DNA 提取、PCR 擴增和文庫構建

參考NCBI 中PekingDuck_PBH1.5 基因組信息，確定金定鴨TRPM3 基因上6 個突變位點的基因組位置。采用血液小量提取試劑盒提取各樣本DNA（TIANGEN，DP348），采用多重PCR 方法對樣本進行擴增，PCR 擴增引物序列如表1所示。其中，第1 輪PCR 反應體系為：Primer Mix（50 nmol/L）2.0 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL，10×Buffer 1.0 μL，基因組DNA（20 ng/μL）2.0 μL，Mg2+（100 mmol/L）1.0 μL，石蠟油10.0 μL，ddH2O 3.1 μL，共20.0 μL。第1 輪PCR 反應條件為：95 ℃ 15 min，1 個循環(huán)；，94 ℃ 30 s，60 ℃ 10 min，4 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 1 min，72 ℃ 30 s，20 個循環(huán)。第2 輪PCR 擴增體系為，Barcode（2.0 μmol/L）3.6 μL，dNTP（2.5 mmol/L）0.8 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.1 μL，第1 輪擴增產物稀釋液10.0 μL，Mg2+（100 mmol/L）1.0 μL，10×Buffer 2.0 μL，ddH2O2.5 μL，石蠟油20.0 μL，共40.0 μL。第2 輪PCR 擴增反應條件為：95 ℃ 15 min，1 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，60 ℃ 4 min，5 個循環(huán)；94 ℃ 30 s，65 ℃ 1 min，72 ℃30 s，10 個循環(huán)。對2 輪擴增獲得的PCR 產物進行混樣，混樣后對文庫進行純化并精確定量后稀釋至測序所需質量濃度（10.0 ng/μL）。

1.3 高通量測序

基于Illumina X-10 測序平臺對TRPM3 基因中6 個SNP 位點進行測序，具體流程為：橋式PCR，采用NaOH 將雙鏈DNA 文庫變性為單鏈，將單鏈DNA雜交到Flow Cel（l 流動槽）上，以Flow Cell表面的Oligos 為引物合成第1 鏈，沖洗單鏈DNA，并以合成的第1 鏈為模板進行橋式PCR，去除與P5接頭連接的DNA 單鏈，阻斷3'-OH；測序反應，將橋式PCR 產物上機測序，所用平臺為IlluminaX-10，操作流程按照標準化工作流程進行，根據測序結果統(tǒng)計每個樣本各SNP 位點的基因型。

1.4 RNA 提取和反轉錄

采用TRNzol 法提取總RNA，提取流程按照TRNzol Universal 總RNA 提取試劑盒（TIANGEN，DP424）的說明書進行，采用分光光度計檢測RNA的純度和含量，經檢測，OD260/OD280 為1.8～2.1 定為合格，將檢測合格的RNA 逆轉錄成cDNA。逆轉錄具體操作參照FastKing 試劑盒一步法除基因組cDNA 第1 鏈合成預混試劑（TIANGEN，KR118）說明書。

1.5 熒光定量PCR

根據NCBI 上鴨TRPM3 基因的參考序列（Gene No：XM_038170831），用Primer Premier 5.0軟件設計TRPM3 mRNA 引物，TRPM3-F：5'-GGTGTTGCTGTGGGCGTCTAATAG-3'，TRPM3-R：5'-GCTTGCTGATGGACCACTTCTCTG-3'；以鴨持家基因ACTB（NM_001310421.1）為參考序列，引物為ACTB-F：TGAGAGTAGCCCCTGAGGAGCAC-3'，ACTB-R：5'-TAACACCATCACCAGACTCCATCAC-3'。采用SYBR Green 法進行熒光定量PCR，以反轉錄的cDNA 為模板進行PCR 擴增，反應體系為：cDNA 2.0 μL，2×SYBRreal-time PCR premix 10.0 μL，50×ROX ReferenceDye 0.4 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.8 μL，總體積20.0 μL。反應條件為：95 ℃，20 s；60 ℃，15 s；72 ℃，15 s，共40 個循環(huán)。

1.6 數據分析

采用SPSS 20.0 軟件對TRPM3 基因上6 個SNP 位點的基因型及其單倍型鴨的產蛋數和蛋質量進行單因素方差分析，比較不同基因型及單倍型間的產蛋數和蛋質量差異。采用雙因素方差分析法分析不同單倍型與產蛋數和蛋質量的相關性。

采用2-ΔΔCt 方法分析TRPM3 基因在鴨卵巢和輸卵管中的相對表達量。

2 結果與分析

2.1 鴨TRPM3 突變位點及與產蛋性能分析

由表2可知，Z-36500134Tgt;C，Z-36503668Agt;C，Z-36534782Ggt;A，Z-36684262Cgt;T，Z-36710928Agt;G，Z-36732487Ggt;A 突變位點的單個核苷酸的突變均引起產蛋數顯著降低（Plt;0.05），300 d蛋質量顯著增加（Plt;0.05）。

2.2 鴨TRPM3 基因單倍型與產蛋性能關聯(lián)分析

檢測了216 只鴨TRPM3 基因的6 個SNPs，共發(fā)現(xiàn)4 種單倍型，結果如表3 所示，其中野生單倍型TAGCAG為優(yōu)勢單倍型，頻率為0.625；而CCATGA、TAGCAA 和CAGTAA 突變單倍型，占比較小，頻率分別為0.250、0.014和0.111。野生單倍型TAGCAG的鴨產蛋量顯著高于突變單倍型CCATGA 和TAGCAA（Plt;0.05）；而蛋質量在野生單倍型鴨顯著低于突變單倍型CCATGA 和CAGTAA（Plt;0.05）。相關性分析表明，不同單倍型與鴨產蛋量呈極顯著正相關（Plt;0.01），與鴨300 d 蛋質量呈極顯著負相關（Plt;0.01）。

2.3 鴨產蛋量分組和TRPM3 mRNA 相對表達量分析

從圖1-A 可以看出，鴨TRPM3 基因在低產組的產蛋數顯著低于在高產組的產蛋數（Plt;0.05）。

從圖1-B 可以看出，TRPM3 基因在不同組間輸卵管中表達量高，但差異不顯著（Pgt;0.05），鴨卵巢TRPM3 mRNA 在低產組表達量顯著低于在高產組的表達量（Plt;0.05）。

3 結論與討論

鴨的產蛋性能是衡量蛋鴨經濟價值的重要指標。研究表明，多個基因與鴨的產蛋性能相關，如NPY、VIPR、PRL 與連城白鴨的產蛋性能相關[11]，F(xiàn)SHR 基因與金定鴨的產蛋性能相關[12]。最近采用全基因組重測序的方法在紹興鴨中發(fā)現(xiàn)了MARCHF6、ATP6V0D2、GRIN3B、MARCHF6、CA2、WDR18、GRIN3B 等多個與產蛋量相關的候選基因[13]。江蘇省家禽科學研究所水禽育種與生產課題組在對金定鴨的高通量測序中首次發(fā)現(xiàn)TRPM3 基因上存在幾個堿基突變，揭示該基因可能影響了鴨的產蛋量。進一步檢測了金定鴨TRPM3 基因上的6 個SNP 位點，分析不同基因型鴨產蛋數和300 d 蛋質量的差異，發(fā)現(xiàn)Z-36500134Tgt;C，Z-36503668Agt;C，Z-36534782Ggt;A，Z-36684262Cgt;T，Z-36710928Agt;G，Z-36732487Ggt;A 突變位點的單個核苷酸的突變均引起產蛋數顯著降低，蛋質量顯著增加。本研究在金定鴨中檢測到TRPM3 基因的4 種單倍型，其中，TAGCAG為野生單倍型，亦為優(yōu)勢單倍型，與高產蛋量和低蛋質量極顯著相關，揭示該單倍型可作為鴨高產蛋量的分子標記用于標記輔助選擇育種。以上這些結果表明，TRPM3 基因突變顯著影響鴨的產蛋性能。

LEE 等[14]于2003 年研究表明，TRPM3 基因在人的大腦、脊髓和睪丸中高表達，而在其他組織中幾乎不表達。GRIMM 等[15]2003 年通過Northern Blot和RT-PCR 的方法檢測了TRPM3 在人組織中的表達情況，結果表明，TRPM3 在人腎臟、大腦、卵巢和胰腺中表達，且在腎臟中的表達高于其他組織。

FONFRIA 等[16]2006 年研究也表明，TRPM3 在腦、垂體、腎臟和脂肪組織中的表達均比較豐富，在其他組織中表達量較低或不表達。近年來的研究進一步表明，TRPM3 在多種組織中廣泛表達，包括腎、腦、脂肪和胰腺等，并在維持細胞內鈣離子穩(wěn)態(tài)、胰島素分泌和體感神經元的熱感中發(fā)揮重要的生理功能[3，17-18]，并能夠在血管平滑肌的細胞收縮和細胞因子分泌中發(fā)揮作用[19]。在卵巢癌上皮細胞中的研究表明，TRPM3 基因在卵巢癌細胞中表達量顯著增加，而且可能通過調控Beclin1 促進卵巢癌細胞的自噬[20]。TRPM3 還可能通過激活Wnt/β-catenin 通路促進卵巢癌細胞的上皮間質轉化過程，進而增強卵巢癌細胞的侵襲轉移能力[21]。TRPM3 基因在雞卵巢顆粒細胞中表達，作為miR-204 的靶基因，在調節(jié)卵巢顆粒細胞的自噬中發(fā)揮重要作用[10]。

本試驗通過對鴨TRPM3 基因的SNP 位點檢測、SNP 位點與產蛋性能的相關性分析，以及TRPM3 在產蛋數不同鴨卵巢和輸卵管組織中的mRNA 表達水平差異的研究，結果表明，TRPM3在鴨產蛋性能中發(fā)揮作用，但具體的調節(jié)作用機制尚不清楚，后續(xù)研究中，將會更深入研究TRPM3在鴨卵巢及卵巢細胞中的作用及信號調控機制，以進一步明確TRPM3 在家禽中的作用。