甘薯Iborf56基因的克隆與表達(dá)分析

摘要：為了研究甘薯葉綠體基因Iborf56 的表達(dá)是否受到鹽脅迫的誘導(dǎo)以及對(duì)生長(zhǎng)發(fā)育的影響，為甘薯的品種選育提供參考，以栗子香為研究材料，從中克隆Iborf56 基因，通過生物信息學(xué)方法分析其蛋白序列特征，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)、系統(tǒng)發(fā)育分析、調(diào)控元件分析、不同組織及鹽脅迫表達(dá)模式，以及qPCR 驗(yàn)證該基因的表達(dá)量。結(jié)果表明，Iborf56 與已知序列相似度為99.28%，開放閱讀框長(zhǎng)度為929 bp，編碼60 個(gè)氨基酸，含有8 個(gè)磷酸化位點(diǎn)，沒有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，不具有分泌蛋白的特性，主要由α-螺旋組成；亞細(xì)胞定位在葉綠體基質(zhì)中；進(jìn)化樹分析表明，Iborf56 與三淺裂野牽牛（Ipomoea trifida）和三裂葉薯（Ipomoea triloba）的遺傳距離最近；啟動(dòng)子元件分析發(fā)現(xiàn)，該基因啟動(dòng)子區(qū)域含有光響應(yīng)元件、抗逆和激素應(yīng)答等功能元件。轉(zhuǎn)錄組以及實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR 定量分析表明，Iborf56 在甘薯葉片中的表達(dá)量最高且隨生長(zhǎng)時(shí)間增加呈顯著上升趨勢(shì)，推測(cè)該基因參與甘薯的生長(zhǎng)發(fā)育；此外，Iborf56 基因的表達(dá)量隨鹽脅迫時(shí)間表現(xiàn)為先升后降的趨勢(shì)，且該基因在鹽脅迫下12 h 時(shí)達(dá)到了臨界值，暗示其可能參與甘薯鹽脅迫響應(yīng)。

關(guān)鍵詞：甘薯；I borf56 基因；基因克隆；生物信息學(xué)分析；表達(dá)模式分析

中圖分類號(hào)：S531 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2023）06?0610?10

甘薯（Ipomoea batatas（L.） Lam.）屬旋花科番薯屬1 年生或多年生雙子葉草本植物，是世界上第二大根莖作物，且對(duì)各種氣候和耕作制度都有廣泛適應(yīng)性[1]。根據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO）的數(shù)據(jù)，2021 年全球甘薯產(chǎn)量超過1.4 億t，其中，我國就約占36.5%[2]。甘薯不僅是人類日常的食物（儲(chǔ)存根和葉）和畜牧飼料，還可以加工為高附加值食品，如脫水薯片、谷物、果醬、果凍和面食等[3]。此外，甘薯還是生產(chǎn)淀粉、酒精和天然色素的工業(yè)原料[3]。因此，為了滿足對(duì)優(yōu)質(zhì)食品和工業(yè)原料日益增長(zhǎng)的需求，開發(fā)脅迫耐受性、高產(chǎn)和高營養(yǎng)價(jià)值的品種至關(guān)重要。甘薯是一種六倍體植物（2n=6x=90），其基因組龐大、遺傳背景復(fù)雜、自交和種間親和性差、雜合度較高、雜交后代分離能力強(qiáng)并且遺傳轉(zhuǎn)化難度大，新品種的培育和品質(zhì)改良面臨較大的困難[4]。隨著基因組學(xué)的發(fā)展，功能基因的鑒定為作物品種改良提供了基礎(chǔ)，有研究已對(duì)不同甘薯品種的葉綠體基因組進(jìn)行組裝[5]，但對(duì)于其葉綠體基因的研究并不完善。

葉綠體（Cp）是一個(gè)半自主性植物細(xì)胞器，它包含整個(gè)光合作用的酶機(jī)制，用于完成植物的光合作用[6-7]。葉綠體為環(huán)狀基因組，由一大一小2 個(gè)單拷貝區(qū)以及2 個(gè)反向重復(fù)區(qū)域組成[8]。甘薯葉綠體DNA 基因組共有145 個(gè)基因，其中94 個(gè)是編碼基因，有72 個(gè)單拷貝基因和11 個(gè)雙拷貝基因[9]。研究發(fā)現(xiàn)，CpDNA 大多數(shù)編碼蛋白不僅參與植物光合作用，還參與其他生化過程，如淀粉合成、色素合成和氮代謝，以及免疫反應(yīng)等，進(jìn)而對(duì)植物能量轉(zhuǎn)化及抗逆性有一定的影響[10-11]。鄭夢(mèng)迪[12]研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥葉綠體基因AtSVR9 不僅是葉綠體發(fā)育和葉片花斑形成過程中的必需因子，而且參與協(xié)調(diào)葉綠體發(fā)育和葉片發(fā)育；AtSVR11 是植物發(fā)育的必需因子。楊建國[13] 研究發(fā)現(xiàn)，楊樹葉綠體基因NADH 可增強(qiáng)植物對(duì)鹽脅迫等逆境的抗性。張歡玲[14]研究發(fā)現(xiàn)，葉綠體FtsH 蛋白酶基因能調(diào)節(jié)高溫強(qiáng)光脅迫下小麥葉片氣孔開閉，以減少水分蒸騰，使植物對(duì)逆境脅迫具有應(yīng)激保護(hù)。orf56 基因在棉屬10 個(gè)葉綠體基因組分析及其系統(tǒng)發(fā)育研究中被鑒定為一個(gè)葉綠體基因[15]，orf56 參與編碼天冬酰胺合成酶的合成，進(jìn)而提高對(duì)鹽和干旱脅迫的抵抗能力，而合成的天冬酰胺在植物光合作用下的生物合成和氮代謝過程中發(fā)揮重要作用[16-17]。然而，有關(guān)參與甘薯中光合作用促進(jìn)的生物合成和響應(yīng)抗鹽脅迫的葉綠體基因鮮有報(bào)道。

本研究以甘薯品種栗子香為試驗(yàn)材料，成功克隆得到甘薯Iborf56 基因，利用生物信息學(xué)工具對(duì)其預(yù)測(cè)的編碼蛋白進(jìn)行分析。利用RNA-seq 數(shù)據(jù)以及實(shí)時(shí)熒光qRT-PCR 定量分析該基因在不同發(fā)育時(shí)期和鹽脅迫條件下的表達(dá)模式，旨在探究Iborf56 在甘薯生長(zhǎng)發(fā)育和鹽脅迫響應(yīng)機(jī)制中的潛在作用，同時(shí)也為甘薯品種改良提供理論參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

所選材料為山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的甘薯品種栗子香。不同生長(zhǎng)時(shí)期樣品制備：將4 周齡的組培薯苗去掉全部成葉片，只留1 片幼葉，在培養(yǎng)箱（22±1）℃、光14 h/暗10 h 條件下水培，水培液為改良的1/2 Hoagland 營養(yǎng)液，于0、7、14、21、28 d 這5 個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期取形態(tài)學(xué)下端第1 片葉，并進(jìn)行液氮速凍，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

鹽脅迫條件下樣品的收集：待組培薯苗長(zhǎng)至兩葉一心時(shí)，分別于正常條件以及180 mmol/L NaCl脅迫條件下培養(yǎng)，處理0、6、12、24、48 h 后選取幼嫩植株作為樣品，經(jīng)液氮速凍后，置-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)生物學(xué)重復(fù)來自于3 個(gè)生長(zhǎng)狀況良好且一致的植株。

植物RNA 提取試劑盒（北京華越洋生物公司），Prime ScriptTM RT reagent Kit 反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR ScriptTM RT reagent Kit Ⅱ 試劑盒、DNA Marker 和pMDTM19-T Vector 試劑盒（TaKaRa 公司），2×Taq Master Mix（康為世紀(jì)公司），DNA 片段純化試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒（Axygen 公司），氨芐霉素（索萊寶公司）。大腸桿菌感DH5α 菌株由山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 Iborf56 基因的克隆

利用NCBI獲取Iborf56基因的全長(zhǎng)序列，序列在Sweetpotato GARDEN（http：//sweetpotato-garden.kazusa.or.jp/blast. html）中進(jìn)行BLAST 搜索，獲得全長(zhǎng)為929 bp的Iborf56基因的CDS 序列。然后利用oligo 7 設(shè)計(jì)并測(cè)評(píng)克隆引物，引物序列如表1 所示。

用CTAB 法提取甘薯品種栗子香葉片的葉綠體DNA，以葉綠體DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，總反應(yīng)體系為20 μL：2×Taq Master Mix 10 μL，10 μmol/Iborf56-F/R 各1 μL，DNA 1 μL，ddH2O7 μL；擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃ 預(yù)變性2 min；94 ℃ 變性30 s，59 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。將Iborf56 基因的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行1% 瓊脂糖凝膠電泳，割膠回收目的片段，回收純化后與pMD19-T 克隆載體連接并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含Amp 的LB 固體培養(yǎng)基上37 ℃過夜培養(yǎng)；挑單克隆劃線于含Amp 的LB固體培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌線后進(jìn)行菌液PCR 鑒定，鑒定出的陽性克隆送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序。保菌于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 甘薯Iborf56 基因的生物信息學(xué)分析

通過使用表2 中的在線生物信息學(xué)分析工具對(duì)甘薯Iborf56 基因進(jìn)行分析。馬鈴薯、擬南芥、水稻、番茄、辣椒、玉米、甘薯和三裂葉野牽牛蛋白序列與CDS 序列分別來源于馬鈴薯DB 基因組資源數(shù)據(jù)庫（http：//spuddb. uga. edu/）、TAIR 數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org），水稻基因組注釋項(xiàng)目數(shù)據(jù)庫（http：//rice. plantbiology. msu. edu/）、Ensembl Plants 植物基因組數(shù)據(jù)庫（http：//plants.ensembl.org/index. html）、甘薯六倍體數(shù)據(jù)庫（publicgenomes-ngs. molgen. mpg. de/SweetPotato/）。然后利用NCBI 中甘薯orf56 基因CDS 序列對(duì)以上數(shù)據(jù)庫進(jìn)行本地blast，并篩選出各物種中與Iborf56同源性最高的序列，在10.1 版本的MEGA-X 中采用ClustW 進(jìn)行多序列比對(duì)，導(dǎo)出mgea 格式文件，bootstrap 設(shè)置為1 000，其他參數(shù)皆為默認(rèn)值，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。從數(shù)據(jù)庫下載各物種FPKM 表達(dá)量數(shù)據(jù)，根據(jù)基因ID 獲取不同物種Iborf56 的表達(dá)量，利用R 語言（1.4.1717 版本）中R 包heatmap進(jìn)行熱圖繪制分析Iborf56 基因組織特異性表達(dá)；并且通過R 包c(diǎn)irclize 進(jìn)行不同時(shí)間鹽脅迫下Iborf56 的表達(dá)分析。

1.4 不同試驗(yàn)條件下甘薯Iborf5 6 基因的表達(dá)分析

分別提取水培后5 個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期（0、7、14、21、28 d）甘薯植株葉片的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA 后進(jìn)行qRT-PCR 分析Iborf56 在不同生長(zhǎng)時(shí)期葉片中的相對(duì)表達(dá)量。同時(shí)，對(duì)水培甘薯植株進(jìn)行不同時(shí)間（0、6、12、21、24 h）的鹽脅迫處理并取葉片材料，提取RNA 并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)一步利用qRT-PCR檢測(cè)其在鹽脅迫條件下的表達(dá)情況，引物如表1 所示。采用熒光定量CFX-96 PCR 儀（Bio-Rad，美國）進(jìn)行qRT-PCR，反應(yīng)總體系為10 μL：1 μL cDNA，5 μL 2×SYBR?Premix Ex TaqTM，3.2 μL ddH2O和正反引物各0.4 μL。設(shè)置程序如下：初始變性條件95 ℃/30 s；然后設(shè)置40 個(gè)循環(huán)的95 °C/5 s 和60 °C/30 s，每個(gè)基因上樣3 個(gè)重復(fù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘薯Iborf56 基因的克隆

以栗子香葉綠體基因組DNA 為模板擴(kuò)增Iborf56 基因，經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳跑膠檢測(cè)，得到750～1 000 bp 大小的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖1-A）；將目的條帶與pMDTM19-T 載體相連，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)，進(jìn)行菌落PCR 檢測(cè)，經(jīng)鑒定均在750～1 000 bp，與目的片段的大小一致（圖1-B）。將陽性克隆搖菌擴(kuò)繁后提取質(zhì)粒，送樣于上海生工公司進(jìn)行測(cè)序，并進(jìn)行序列比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為929 bp，與NCBI 網(wǎng)站中預(yù)測(cè)的甘薯Iborf56 基因進(jìn)行比對(duì)，一致度為99.28%。

2. 2 甘薯Iborf56 生物信息學(xué)分析

利用ProtParam 在線軟件預(yù)測(cè)理化性質(zhì)，結(jié)果顯示，Iborf56 蛋白的分子式為C283H482N110O89S1，分子質(zhì)量為6 881.68 u，共有965個(gè)原子，等電點(diǎn)是11.71，為堿性蛋白。它的消光系數(shù)為0.217，總平均親水系數(shù)-1.380，屬于親水性蛋白；不穩(wěn)定系數(shù)為68.61，大于40，所以，甘薯Iborf56 蛋白的性質(zhì)不穩(wěn)定。

使用UniProt 對(duì)Iborf56 對(duì)應(yīng)的編碼蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，其定位于葉綠體基質(zhì)中（圖2）。蛋白質(zhì)折疊的情況決定氨基酸的親疏水性，Iborf56 蛋白的親疏水性預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖3-A），甘薯Iborf56 蛋白的氨基酸親疏水性分值介于-3.0～0.5，且親水面積區(qū)域遠(yuǎn)大于疏水面積區(qū)域，結(jié)果表明，甘薯Iborf56 蛋白為親水蛋白，親水蛋白一般都會(huì)位于細(xì)胞膜內(nèi)。甘薯Iborf56 蛋白信號(hào)肽預(yù)測(cè)結(jié)果表明（圖3-B），Iborf56 蛋白沒有信號(hào)肽，不具有分泌蛋白的特性。甘薯Iborf56 蛋白跨膜區(qū)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示（圖3-C），Iborf56 蛋白沒有跨膜區(qū)，不是跨膜蛋白，且全都在膜內(nèi)。蛋白質(zhì)磷酸化會(huì)使得蛋白質(zhì)附帶電荷，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)變化進(jìn)而引起蛋白質(zhì)功能。甘薯Iborf56 蛋白磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示（圖3-D），Iborf56 蛋白有2 個(gè)蘇氨酸和6 個(gè)絲氨酸磷酸化，分?jǐn)?shù)在0.5 以上可以認(rèn)為存在潛在的磷酸化位點(diǎn)，分?jǐn)?shù)越高，預(yù)測(cè)的可信度越高。由圖3-D可知，6 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)的得分較高，置信度較高；而2 個(gè)蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)的得分剛好超過臨界值（0.5），表明其作為真正磷酸化位點(diǎn)的可能性較低。圖4-A 中藍(lán)色柱型結(jié)構(gòu)的深淺與高低代表蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)果預(yù)測(cè)的可信度，顏色越深、柱狀越高代表預(yù)測(cè)的可信度越高，可以看出，此預(yù)測(cè)的結(jié)果在大多數(shù)氨基酸位點(diǎn)都比較可靠。Iborf56 蛋白序列與模板序列的一致度為37.14%（圖4-B），符合建模要求。三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果如圖4-C。

甘薯Iborf56 基因啟動(dòng)子元件分析結(jié)果表明，啟動(dòng)子區(qū)域包括多種重要的順式作用元件（圖5）。

除了轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件CAAT-box 外，還有3 個(gè)光響應(yīng)元件Sp1、GATA-motif 和G-box，以及脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)等其他功能元件。

MobiDB 提供了關(guān)于內(nèi)在無序區(qū)域（IDRs）的信息，以及來自各種來源和預(yù)測(cè)工具的相關(guān)特征。

不同的可靠性級(jí)別和不同的特性被報(bào)告為不同的獨(dú)立注釋。從圖6 可以觀察到，序列的兩端存在著較長(zhǎng)的IDRs，且都為卷曲部分，而螺旋和折疊部分少有IDRs，固有無序化的低復(fù)雜序列結(jié)構(gòu)域，在真核生物基因轉(zhuǎn)錄階段起著至關(guān)重要的作用并參與蛋白的相變。相變是一個(gè)協(xié)同轉(zhuǎn)換過程，涉及來自多價(jià)蛋白質(zhì)間相互作用模塊的集體效應(yīng)。由此推斷，orf56 蛋白極有可能參與蛋白相變，而植物蛋白質(zhì)的相變?cè)谠S多生物學(xué)過程中都至關(guān)重要，對(duì)于植物適應(yīng)環(huán)境和維持正常生長(zhǎng)發(fā)育具有重要意義。

為了探討Iborf56 在不同植物物種中的潛在進(jìn)化關(guān)系，對(duì)馬鈴薯、擬南芥、水稻、番茄、辣椒、玉米、甘薯和三裂葉野牽牛8 個(gè)物種中比對(duì)出的Iborf56同源基因進(jìn)行了系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，結(jié)果顯示（圖7），甘薯、三裂葉野牽牛和三裂葉薯中Iborf56 很可能具有相同的作用，功能注釋為RAD51 的DNA 修復(fù)蛋白，能夠增加細(xì)胞發(fā)生所需基因變化的概率。

其次，進(jìn)化關(guān)系最近的擬南芥中也比對(duì)為編碼一個(gè)涉及雙鏈DNA 修復(fù)的RAD51B 家族的蛋白質(zhì)，純合子突變株對(duì)絲裂霉素的敏感性增加，從而引起DS 斷裂。此外，甘薯與玉米和水稻的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，因此，在單子葉植物和雙子葉植物中Iborf56 的功能可能不同。

2.3 基于RNA-seq 的orf56 基因表達(dá)模式分析

利用不同物種的RNA-seq 數(shù)據(jù)，檢測(cè)orf56 基因在不同組織下的表達(dá)水平，結(jié)果如圖8 所示。

由圖8 可知，orf56 基因在不同物種不同組織下具有相同的表達(dá)趨勢(shì)。在所選物種中，orf56 基因在地上部分組織的表達(dá)顯著高于地下部分組織的表達(dá)（Plt;0.05），但是辣椒中該基因在葉中幾乎不表達(dá)，而在莖和花中表達(dá)水平較高，這可能是由于在進(jìn)化關(guān)系中辣椒與其他物種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，表達(dá)水平趨勢(shì)也與其他物種不相同，推測(cè)orf56 基因很可能參與辣椒莖和花的生長(zhǎng)發(fā)育。整體上結(jié)果表明，該基因在莖和葉中表達(dá)最高，且在三淺裂野牽牛和甘薯中表達(dá)模式基本一致。由此可推斷，在這2 個(gè)物種中Iborf56 具有相同的作用，且可能與生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

利用甘薯在不同時(shí)間（0、12、48 h）鹽脅迫下的RNA-seq 數(shù)據(jù)，檢測(cè)葉片Iborf56 基因的表達(dá)量，如圖9 所示，隨著鹽脅迫時(shí)間增加，Iborf56 的表達(dá)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，且各處理間差異極顯著（Plt;0.01），表明Iborf56 響應(yīng)甘薯鹽脅迫。

2.4 不同試驗(yàn)條件下甘薯Iborf56 基因的表達(dá)分析

進(jìn)一步收集栗子香5 個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期和鹽脅迫處理不同時(shí)間的葉片進(jìn)行qRT-PCR 鑒定，結(jié)果如圖10 所示，隨著生長(zhǎng)時(shí)期的增加，Iborf56 在甘薯葉片中的表達(dá)量呈極顯著上升趨勢(shì)（Plt;0.01），推測(cè)Iborf56 在促進(jìn)甘薯的生物生長(zhǎng)有一定作用；隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)，Iborf56 基因的表達(dá)量表現(xiàn)出先升高后下降的趨勢(shì)，這與轉(zhuǎn)錄組分析的結(jié)果相一致，結(jié)果表明Iborf56 與甘薯鹽脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

3 結(jié)論與討論

甘薯具有耐鹽堿、抗旱和耐貧瘠等特性，且單位面積、單位時(shí)間的生物合成和能源產(chǎn)量比普通作物多，因此其成為適宜用于挖掘鹽堿地生產(chǎn)潛力的能源作物之一[18]。相比于水稻和小麥等大類糧食作物，目前甘薯耐鹽等非生物脅迫的分子生物學(xué)研究還有很大差距[19]。因此，深入研究甘薯的耐鹽特性，對(duì)甘薯種植和深化應(yīng)用以及我國生物能源發(fā)展具有重要意義。近年來少量研究發(fā)現(xiàn)，一些葉綠體基因參與光合作用的發(fā)生，進(jìn)而促進(jìn)植物生物量合成，并且影響抗逆性[20-21]。

orf56 基因最初在臘梅（Calycanthus）[22]和天竺葵（Pelargonium）[23]的完整葉綠體基因組中注釋。

根據(jù)之前報(bào)道，擬南芥和水稻中的orf56 基因編碼的蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)，包含一個(gè)核苷酸結(jié)合亞基（NUC）和一個(gè)富含半胱氨酸的區(qū)域（CXXC），這2 個(gè)區(qū)域都被認(rèn)為對(duì)蛋白質(zhì)的功能至關(guān)重要[24]。但是，冰島硫化葉菌（Sulfolobus islandicus）中orf56 編碼的蛋白質(zhì)則包含一個(gè)額外的DNA 結(jié)合區(qū)域[25]，可見，orf56 基因在不同物種中的結(jié)構(gòu)可能會(huì)有所不同。據(jù)報(bào)道，orf56 在不同物種中的同源基因存在一些功能上的差異。有研究表明，orf56 基因參與天冬酰胺合成酶的編碼，在植物氮代謝過程中發(fā)揮重要作用，在水稻中天冬酰胺合成酶基因突變后，植株中天冬酰胺含量顯著下降，天冬酰胺代謝過程發(fā)生紊亂，導(dǎo)致水稻的生長(zhǎng)發(fā)育受到影響[16，26]；而在金露梅屬（Potentilla fruticosa）植物中orf56 基因編碼的蛋白質(zhì)可能參與植物對(duì)鹽脅迫的響應(yīng)，該研究通過轉(zhuǎn)化擬南芥，過表達(dá)SpZFP3 可以增加植物對(duì)鹽脅迫的耐受性，并且orf56 基因的表達(dá)量在這個(gè)過程中得到了提高[27]?？傊?，orf56 在不同他物種中的同源基因之間存在功能上的差異，這可能是由不同物種在生存環(huán)境和進(jìn)化歷史方面的差異所導(dǎo)致的。因此，需要對(duì)不同物種中的orf56 基因進(jìn)行更深入的研究，以確定其結(jié)構(gòu)差異和對(duì)應(yīng)的生物學(xué)功能。

本研究成功克隆了甘薯Iborf56 基因，其完整開放閱讀框長(zhǎng)度為929 bp，編碼60 個(gè)氨基酸，亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)Iborf56 定位在葉綠體基質(zhì)中。系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育中甘薯Iborf56 與三淺裂野牽牛（Ipomoeatrifida）和三裂葉薯（Ipomoea triloba）的親緣關(guān)系最高，推測(cè)該基因在三淺裂野牽牛和甘薯中功能相似。蛋白生物信息學(xué)分析表明，Iborf56 蛋白沒有信號(hào)肽和跨膜區(qū)，不具有分泌蛋白的特性，主要由α-螺旋組成，α-螺旋主要對(duì)蛋白質(zhì)骨架起到穩(wěn)定作用，決定了蛋白質(zhì)的功能[28]。蛋白質(zhì)磷酸化是一種常見且重要的蛋白翻譯后修飾方式，通過對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行磷酸化或去磷酸化來調(diào)節(jié)酶的活性，從而影響信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)以及細(xì)胞周期等多個(gè)重要細(xì)胞過程[29]。本研究中，Iborf56 蛋白具有2 個(gè)蘇氨酸和6 個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)，可能在調(diào)控甘薯抗鹽助迫等逆境中發(fā)揮一定的作用[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，Iborf56基因啟動(dòng)子區(qū)域包括多種重要的順式作用元件，除了轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)元件CAAT-box 外，還有3 個(gè)光響應(yīng)元件Sp1、GATA-motif 和G-box，以及脅迫響應(yīng)和激素響應(yīng)等功能元件。其中，赤霉素和脫落酸響應(yīng)元件說明Iborf56 基因可能在甘薯鹽脅迫等非生物脅迫應(yīng)答等過程中發(fā)揮作用[31-32]，而且該基因的表達(dá)可能受GAs 和ABA 等激素的調(diào)控。

本研究利用不同物種的RNA-seq 數(shù)據(jù)，檢測(cè)Iborf56 基因在不同組織下的表達(dá)水平，分析Iborf56 基因在地上部分組織的表達(dá)顯著高于地下部分組織的表達(dá)，且在葉子中表達(dá)最高，并且在三淺裂野牽牛和甘薯中表達(dá)模式基本一致，進(jìn)一步說明在這2 個(gè)物種中Iborf56 具有相同的作用。分析甘薯栗子香在不同時(shí)間鹽脅迫下的RNA-seq 數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)隨著鹽脅迫時(shí)間增加，Iborf56 的表達(dá)呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，表明Iborf56 能快速響應(yīng)鹽脅迫的誘導(dǎo)表達(dá)，增強(qiáng)甘薯苗對(duì)鹽的抗脅迫性。

進(jìn)一步對(duì)甘薯不同發(fā)育時(shí)期以及不同時(shí)間鹽脅迫處理下的Iborf56 基因進(jìn)行了qRT-PCR 定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Iborf56 在甘薯葉片中的表達(dá)量隨生長(zhǎng)時(shí)間呈顯著上升趨勢(shì)，且在12 h 表達(dá)量最高，推測(cè)該基因參與甘薯的生長(zhǎng)發(fā)育；此外，Iborf56 基因的表達(dá)量隨鹽脅迫時(shí)間表現(xiàn)出先升后降的趨勢(shì)，且該基因在鹽脅迫下12h 時(shí)達(dá)到了臨界值，與轉(zhuǎn)錄組結(jié)果一致。結(jié)合前人研究，推斷Iborf56 基因可能參與甘薯生長(zhǎng)發(fā)育以及響應(yīng)鹽脅迫的生物過程，這些結(jié)果為甘薯生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆分子機(jī)制提供了參考依據(jù)。