谷子KCS基因家族鑒定及其對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)

摘要：β–酮脂酰輔酶A 合酶（β-ketoacyl-CoA synthase，KCS）是超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成過程中的限速酶，主要負(fù)責(zé)調(diào)控脂肪酸和蠟質(zhì)的合成與積累。為了為谷子抗旱品種的選育提供新的線索，研究利用隱馬爾可夫模型對(duì)谷子KSC 基因家族進(jìn)行鑒定，并利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)谷子KCS 基因家族進(jìn)行系統(tǒng)分析與鑒定，并對(duì)其理化特征、進(jìn)化關(guān)系、保守基序、基因結(jié)構(gòu)、順式調(diào)控元件、亞細(xì)胞定位、共線性進(jìn)行分析和表達(dá)模式分析。結(jié)果表明，從谷子基因組中共鑒定到33 個(gè)KCS 基因；系統(tǒng)進(jìn)化和共線性分析結(jié)果顯示，谷子KCS 基因與高粱、玉米進(jìn)化關(guān)系更近；啟動(dòng)子區(qū)包含許多激素響應(yīng)、逆境響應(yīng)和生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)元件，暗示KCS 基因可能參與多個(gè)生物學(xué)過程；谷子KCS 基因在穗部表達(dá)量最高，其次為葉片，早晚表達(dá)量均高于中午。此外，干旱脅迫下谷子Seita.9G470700 和Seita.9G487500 基因的表達(dá)量顯著高于對(duì)照，表明這2 個(gè)KCS 基因在谷子干旱響應(yīng)中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：谷子；β–酮脂酰輔酶A 合酶；生物信息學(xué)分析；表達(dá)分析；干旱脅迫響應(yīng)

中圖分類號(hào)：S515 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1002?2481（2023）06?0599?11

谷子（Setaria italica Beauv.）是禾本科狗尾草屬1 年生作物，最早在我國北方被馴化，目前谷子區(qū)域布局主要集中在華北地區(qū)，包括黃河中上游流域、東北及內(nèi)蒙等干旱或半干旱地區(qū)[1]。谷子是抗旱性較強(qiáng)的作物，但是由于全球環(huán)境的惡化，氣候變暖、水資源短缺問題嚴(yán)重影響谷物的產(chǎn)量[2]。因此，探索谷子抵御干旱脅迫的機(jī)制，減少干旱環(huán)境對(duì)作物造成的危害，選育優(yōu)良抗逆高產(chǎn)品種，提高谷子抗旱性具有重要意義。目前，國內(nèi)外研究人員對(duì)谷子抗旱特性的研究主要集中在表型特征、生理生化指標(biāo)和分子水平研究[3]。而葉表皮蠟質(zhì)性狀在抗旱方面也有重要作用，植物表皮蠟質(zhì)的增加會(huì)使植物的抗旱性增強(qiáng)。

β–酮脂酰輔酶A合酶（β-ketoacyl-CoA synthase，KCS）是脂肪酸延伸酶復(fù)合體的一部分，也是超長(zhǎng)鏈脂肪酸合成過程中主要的限速酶，催化?；o酶 A 與丙二酰輔酶A 的縮合[4]。KCS 基因最早是在一個(gè)超長(zhǎng)鏈脂肪酸缺失突變體擬南芥植株中篩選分離出來的[5]。隨后在植物界中被廣泛研究分析，在對(duì)多個(gè)物種的KCS 同源基因鑒定及功能多樣性表征后，推斷出編碼β-酮脂酰輔酶A 合酶的基因應(yīng)該屬于一個(gè)具有多個(gè)成員的基因家族[6]。目前，在擬南芥KCS 基因家族中共篩選鑒定出KCS 基因21 個(gè)[7]，參與調(diào)控超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，且具有明顯的底物特異性[8]，故不同基因的催化活性不同[6]。

有研究證明，AtKCS1 同時(shí)參與了蠟質(zhì)合成的脫羰途徑和?；€原途徑，但AtKCS1 缺失突變體不會(huì)導(dǎo)致任何單個(gè)蠟成分的完全喪失或顯著降低總蠟量，說明在蠟合成中涉及的延伸酶KCS 活性存在冗余[9]。LEE 等[10]對(duì)擬南芥中AtKCS20 和AtKCS2基因單突變體和雙突變體在不同組織中的表達(dá)情況分析發(fā)現(xiàn)，單突變體植株角質(zhì)層蠟質(zhì)改變不明顯，雙突變體植株莖和長(zhǎng)角果上的表皮蠟質(zhì)結(jié)晶數(shù)量顯著減少，表明KCS20 和KCS2 在角質(zhì)層蠟質(zhì)合成所需的超長(zhǎng)鏈脂肪酸的延伸中是功能性冗余的。

但也有研究報(bào)道，擬南芥KCS5 為KCS6 的密切旁系同源基因，在調(diào)控蠟質(zhì)代謝中具有相同的作用，同時(shí)也具有非冗余的功能[11]。GAN 等[12]在水稻葉片蠟質(zhì)晶體稀疏突變體（Wax Crystal-Sparse Leaf4，wsl4）的研究中，發(fā)現(xiàn)由于KCS6 基因缺失突變導(dǎo)致葉片蠟質(zhì)含量的降低，證明該基因是水稻葉片表皮蠟質(zhì)積累所必需的。WANG 等[13]研究發(fā)現(xiàn)，冷脅迫處理下的棉花GhKCS13 過表達(dá)植株中葉片鞘脂和甘油脂的組成發(fā)生變化，可能因此改變了細(xì)胞膜在低溫情況下的流動(dòng)性，并且GhKCS13 轉(zhuǎn)基因品系中茉莉酸（JA）水平的差異表明，它可能與溶血磷脂一起介導(dǎo)冷應(yīng)激反應(yīng)。目前，KCS 基因家族在許多物種中被研究報(bào)道，但在谷子中還未被研究報(bào)道。

本研究通過生物信息學(xué)的方法檢索了谷子中的KCS 基因家族成員， 并對(duì)其基因參數(shù)、亞細(xì)胞定位、進(jìn)化關(guān)系、保守基序、啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件等參數(shù)特征分析和預(yù)測(cè)，并對(duì)其組織表達(dá)模式以及在干旱脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，初步探索其在谷子生長(zhǎng)發(fā)育及抗逆中的作用，旨在為后續(xù)研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 數(shù)據(jù)獲取

谷子（Setaria italica v2.2）、擬南芥（Arabidopsisthaliana TAIR10）、水稻（Oryza sativa v7_JGI）、高粱（Soyghum bicolor v3.1.1）和玉米（Zea maysPH207 v1.1）的全基因組序列、CDS 序列、蛋白序列以及注釋文件全部從Phytozome 數(shù)據(jù)庫獲得。

1.2 谷子KCS 家族成員基因鑒定及染色體定位

從Pfam 數(shù)據(jù)庫（http：//pfam. xfam. org/）下載KCS 基因（PF08392）的隱馬爾可夫模型（HMM）文件。使用谷子全部蛋白序列文件和HMM 文件在NCBI 和Pfam 上確定結(jié)構(gòu)域，選擇含有KCS 基因保守結(jié)構(gòu)域的蛋白，確定谷子KCS 基因家族成員。

利用TBtools 中Sequence Toolkits 選項(xiàng)，從谷子基因組注釋文件中獲得谷子KCS 家族各成員基因在染色體上的位置信息，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化，繪制基因染色體定位圖。

1.3 谷子KCS 家族成員的氨基酸信息和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)

利用蛋白質(zhì)在線分析軟件ExPASY-ProtParam（https：//web.expasy.org/ protparam/）分析預(yù)測(cè)谷子KCS 家族中所有蛋白的氨基酸數(shù)目、等電點(diǎn)和分子量等理化性質(zhì)。

1.4 谷子KCS 家族成員系統(tǒng)進(jìn)化分析和基因結(jié)構(gòu)分析

利用MEGA11 軟件對(duì)谷子與擬南芥、水稻、高粱、玉米KCS 家族成員的的蛋白序列聚類和進(jìn)化分析；利用iTOL（https：//itol.embl.de/）在線工具對(duì)系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行編輯和美化[14]。

利用TBtools 中Gene Structure View 功能，使用谷子KCS 家族蛋白進(jìn)化樹文件和谷子基因組注釋文件，分析得出谷子KCS 基因序列中編碼區(qū)（CDS）和非編碼區(qū)（UTR）的分布情況，繪制基因結(jié)構(gòu)圖。

1.5 谷子KCS 家族蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

利用在線軟件MEME（http：//meme-suite.org/tools/meme）分析預(yù)測(cè)谷子KCS 蛋白氨基酸序列中的保守基序，并使用TBtools 工具進(jìn)行可視化。

1.6 谷子KCS 基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件分析

利用 PlantCARE 在線軟件（http：//bioinformatics.psb. ugent.be/webtools/plantcare/html）獲取谷子KCS 基因啟動(dòng)子區(qū)域中的順式元件，并利用TBtools 進(jìn)行可視化。啟動(dòng)子區(qū)域定為起始密碼子上游2 000 bp 的序列。

1.7 谷子KCS 基因的表達(dá)分析

試驗(yàn)材料為2 個(gè)抗旱的谷子品種豫谷1 號(hào)（YG1）、沁黃2 號(hào)（QH2）和干旱敏感型谷子品種安-04（AN-04），種植于旱棚，設(shè)置正常澆水對(duì)照和自然干旱處理，間苗后待干旱處理材料出現(xiàn)萎蔫時(shí)，在第2 天取植株頂部第2 片完全展開葉，設(shè)置3 次重復(fù)，用液氮速凍，放-80 ℃超低溫冰箱存放。

利用Trizol 法分別提取葉片的總RNA，并利用TaKaRa 公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。隨后采用2×M5 HiPer Realtime PCR Super mix（SYBRgreen， with anti-Taq）定量試劑盒進(jìn)行qRT-PCR 分析，根據(jù)2-ΔΔCt 計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

引物由Primer 5.0 軟件設(shè)計(jì)（表1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子KCS 基因家族鑒定及染色體定位

在谷子基因組中篩選鑒定到33 個(gè)KCS 基因家族成員，基因染色體定位圖1 中顯示，谷子9 條染色體中有8 條染色體上存在 KCS 基因，其中8 號(hào)染色體上最少只有一個(gè)，1 號(hào)和7 號(hào)染色體上有4 個(gè)，2 號(hào)和4 號(hào)染色體上有5 個(gè)，3 號(hào)和5 號(hào)染色體上分別有3 個(gè)和2 個(gè)，9 號(hào)染色體上最多有9 個(gè)。

2.2 谷子KCS 基因家族理化性質(zhì)分析

對(duì)谷子KCS 的蛋白信息和理化性質(zhì)預(yù)測(cè)，結(jié)果如表2 所示，谷子KCS 蛋白氨基酸數(shù)目為373～542 個(gè)，其中，Seita.3G103400 和Seita.9G517700 基因編碼的氨基酸數(shù)目最多，Seita.1G123100 基因編碼氨基酸數(shù)目最少。KCS 蛋白的分子質(zhì)量為39.96～60.33 ku，蛋白質(zhì)等電點(diǎn)為5.82～10.20，其中有4 個(gè)KCS 蛋白等電點(diǎn)小于7 呈酸性，其余29 個(gè)成員蛋白質(zhì)等電點(diǎn)均大于7，呈堿性。使用Psort 在線工具對(duì)谷子KCS 家族蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，谷子KCS 蛋白主要定位在細(xì)胞質(zhì)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體和線粒體。這些細(xì)胞器的主要功能包括脂類物質(zhì)的合成、修飾和轉(zhuǎn)運(yùn)等，同時(shí)也是蠟質(zhì)合成和分泌的主要途徑。據(jù)此推測(cè)，KCS 蛋白可能在這些細(xì)胞器調(diào)控長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，進(jìn)而影響蠟質(zhì)成分的積累。

2.3 KCS 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析

選取谷子、擬南芥、水稻、高粱和玉米中的33、21、20、28、24 條KCS 蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，分析5 個(gè)物種間KCS 蛋白的進(jìn)化關(guān)系如圖2 所示。

圖2 結(jié)果顯示，可以將5 個(gè)物種中所有的KCS基因分為6 個(gè)亞家族，在第1 和第2 亞家族中分別有3、6 個(gè)谷子KCS 成員；第3 亞家族均為擬南芥KCS成員；第4 亞家族有2 個(gè)谷子KCS 成員，他們與其他KCS 成員親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，推測(cè)其在谷子中具有特異生物學(xué)功能；第5 亞家族中有10 個(gè)谷子KCS 成員；第6 亞家族中谷子KCS 成員最多，有12 個(gè)，且其中還有16 個(gè)擬南芥KCS 成員，因此推測(cè)這一部分中的KCS 基因可能發(fā)揮著重要的作用。同時(shí)在其中也發(fā)現(xiàn)一些同源基因?qū)?，有Seita. 7G036600 和Seita.7G036700、Seita.2G279100和Seita.2G279200、Seita.7G091200 和Seita.7G091500 等旁系同源物，另外其他谷子KCS 基因與不同物種聚類在一起則為直系同源物，如Seita.2G184500和Zm00008a027817、S e ita .4 G 1 1 6 4 0 0 和S o b ic .0 1 0 G 1 0 7 4 0 0 、S e ita .1G042400 和AT2G26640 等。其中谷子KCS 基因大部分與高粱、玉米KCS 基因聚在一起，可能是由于同作為C4植物，谷子和高粱、玉米親緣關(guān)系更近，據(jù)此推測(cè)，他們具有類似的生物學(xué)功能。

2.4 谷子KCS 基因家族的生物信息學(xué)分析

KCS 基因家族結(jié)構(gòu)如圖3 所示，其中有17 個(gè)成員不含有內(nèi)含子，有11 個(gè)KCS 家族成員含有1 個(gè)內(nèi)含子，有3 個(gè)成員含有2 個(gè)內(nèi)含子，其余2 個(gè)成員含有3 個(gè)內(nèi)含子。通過MEME 在線網(wǎng)站預(yù)測(cè)谷子KCS蛋白保守基序，并利用TBTools 進(jìn)行可視化。谷子KCS 基因的生物信息學(xué)分析如圖3 所示。

從圖3 可以看出，不同聚類之間含有不同的保守基序。在谷子KCS 基因家族33 個(gè)成員中，除Seita.4G116500 外都含有motif 3 和motif 4 這2 個(gè)基序，除Seita. 2G154200 外均含有motif 8，除Seita. 2G021000、Seita. 4G116500 外均含有motif 10，除Seita.2G021000、Seita.7G036700、Seita.7G036600外均含有motif 6，除Seita.2G154200、Seita.2G021000、Seita.7G036700 和Seita.7G036600外均含有motif 5。

對(duì)比FAE1_CUT1_RppA（PF08392）隱馬爾可夫模型標(biāo)志確定motif 3、motif 4、motif 5、motif 6、motif 8和motif 10 都是β-酮脂酰輔酶A 合酶的保守基序。

谷子KCS 家族中大多數(shù)成員也含有motif 1、motif 2、motif 5、motif 6、motif 7、motif 9 和motif 11，這些保守基序可能與谷子的生長(zhǎng)發(fā)育有關(guān)。

利用PlantCare 在線軟件對(duì)谷子KCS 基因上游2 000 bp 序列進(jìn)行了分析預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在谷子KCS 基因啟動(dòng)子區(qū)域順式作用元件主要包括光響應(yīng)元件、各種激素響應(yīng)元件、逆境響應(yīng)元件和一些生長(zhǎng)發(fā)育所必需的調(diào)控元件。其中大多數(shù)成員都含有光響應(yīng)元件、MYB 結(jié)合位點(diǎn)、脫落酸響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件和厭氧誘導(dǎo)必需元件。另外，含有水楊酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件、防御和應(yīng)激響應(yīng)元件、低溫響應(yīng)元件、晝夜節(jié)律響應(yīng)、分生組織表達(dá)、玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)、胚乳表達(dá)的成員分別有8、12、9、12、19、5、15、11、5 個(gè)，只有1 個(gè)成員含有創(chuàng)傷響應(yīng)元件。說明KCS 基因主要在谷子生長(zhǎng)發(fā)育和響應(yīng)逆境脅迫中發(fā)揮重要作用。

利用Phytozome 數(shù)據(jù)庫獲得谷子KCS 基因不同組織表達(dá)量數(shù)據(jù)，繪制熱圖進(jìn)行可視化，谷子KCS 基因主要在穗部表達(dá)，且表達(dá)量較高，只有少量基因在根中表達(dá)。其中，Seita.4G225400、Seita. 8G168900、Seita. 3G142500、Seita. 9G470700和Seita.9G487500在葉、穗、根、分蘗和莖中均有表達(dá)；Seita. 9G517700、Seita. 3G103400、Seita. 9G263300、Seita.9G225000、Seita.9G383400 和Seita.1G362000在除根外其他4 個(gè)組織中表達(dá)，且在穗部的表達(dá)量較高。表明谷子KCS 基因在谷子芽、葉、分蘗和穗的發(fā)育有重要的作用，且多數(shù)基因在穗部表達(dá)量較高，這點(diǎn)也可能與籽粒的形成有關(guān)。據(jù)此推測(cè)，谷子KCS 基因不僅可以通過調(diào)控超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成，影響植株表皮蠟質(zhì)的積累，可能還與籽粒形成中脂肪酸的積累有關(guān)。

2.5 KCS 基因的共線性分析

為了進(jìn)一步了解谷子KCS 基因家族在谷子基因組和其他物種基因組中的進(jìn)化和擴(kuò)展機(jī)制，進(jìn)行了共線性分析。谷子KCS 基因重復(fù)基于串聯(lián)或片段重復(fù)進(jìn)行評(píng)估。谷子33 個(gè)KCS 基因在物種內(nèi)共線性分析結(jié)果如圖4 所示。

由圖4 可知，谷子33 個(gè)KCS 基因在物種內(nèi)共有6 個(gè)基因?qū)Γ渲? 個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因?qū)υ? 號(hào)染色體上，包括Seita. 9G285300 和Seita. 9G470700、Seita.9G263300 和Seita.9G531000，其余4 對(duì)為片段重復(fù)基因?qū)Ψ謩e位于1、3、4、9號(hào)染色體上，包括Seita.1G308900 和Seita. 4G116200、Seita. 1G042400 和Seita.4G225400、Seita.1G362000和Seita.9G225000、Seita.3G103400 和Seita.4G225400。重復(fù)的基因?qū)儆诓煌娜旧w，其中在9 號(hào)染色體上的最多。這些結(jié)果表明，基因重復(fù)可能在SiKCS 基因家族和谷子基因組的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。此外，計(jì)算重復(fù)基因中的Ka/Ks 比率以評(píng)估進(jìn)化速率和選擇壓力。

一般來說，Ka/Ks 值大于1 表示基因被正向選擇，比值小于1 表示純化選擇，比值等于1 表示中性選擇。

結(jié)果顯示，所有重復(fù)的谷子KCS 基因?qū)Φ腒a/Ks值均小于1，表明這些基因經(jīng)過了純化選擇。

谷子KCS 基因與水稻、高粱和玉米全基因組進(jìn)行綜合共線性分析，共發(fā)現(xiàn)95 個(gè)重復(fù)基因?qū)?，其中，?2 個(gè)谷子KCS 基因與水稻中20 個(gè)KCS 基因發(fā)現(xiàn)26 個(gè)重復(fù)基因?qū)?，?8 個(gè)谷子KCS 基因與玉米中25 個(gè)KCS 基因發(fā)現(xiàn)35 個(gè)基因?qū)?，?0 個(gè)谷子KCS 基因與高粱中20 個(gè)KCS 基因發(fā)現(xiàn)34 個(gè)基因?qū)ΑＧ疫@些重復(fù)基因?qū)a/Ks 值都小于1，表示這些基因在進(jìn)化過程中全部通過純化選擇。

2.6 谷子KCS 基因家族的表達(dá)分析

利用雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室已有的谷子田間和溫室自然干旱脅迫下不同時(shí)間點(diǎn)葉片轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)田間和溫室自然干旱脅迫下不同抗旱性谷子品種（AN-04、QH2、YG1）KCS 家族基因田間干旱脅迫下的表達(dá)情況進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5 所示。

由圖5 可知，大多數(shù)KCS 基因無表達(dá)或表達(dá)量很低，且在中午的表達(dá)量略低于早上和晚上。此外，有6 個(gè)KCS 基因在不同品種和不同時(shí)間點(diǎn)均有較高的表達(dá)，包括Seita.8G168900、Seita.9G470700、Seita. 3G103400、Seita. 9G487500、Seita. 9G517700和Seita.4G116400。有6 個(gè)KCS 基因在不同處理和不同時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)差異明顯，例如Seita.3G103400、Seita. 9G517700、Seita. 3G142500、Seita. 9G383400、Seita.1G042400 和Seita.1G308900 在不同品種中午的表達(dá)量都有明顯的下降；Seita. 1G042400 和Seita.1G308900 在不同品種干旱處理后的表達(dá)量均有所上升，Seita. 9G517700、Seita. 3G142500 和Seita.9G383400 在不同品種干旱處理后表達(dá)量略有下降。

圖6 為不同品種谷子KCS 基因溫室干旱脅迫下的表達(dá)情況，與大田中的表達(dá)情況類似，部分KCS 基因不表達(dá)或表達(dá)量很低，許多KCS 基因表達(dá)量在干旱脅迫下有明顯的上調(diào)，如Seita. 1G042400、Seita. 3G137500、Seita. 8G168900、Seita. 9G470700、Seita.9G487500、Seita.1G308900和Seita.4G116400。

部分基因的表達(dá)量在干旱處理下顯示下調(diào)，如Seita. 4G225400、Seita. 3G142500、Seita. 9G383400和Seita.1G362000。大多數(shù)KCS 基因在有光照的情況下的表達(dá)量高于無光照情況。

綜合不同處理下的表達(dá)情況，從KCS 基因家族中選取表達(dá)量高且在干旱處理下有顯著差異表達(dá)的成員Seita. 1G042400、Seita. 1G308900、Seita. 4G116400、Seita. 8G168900、Seita. 9G470700和Seita. 9G487500 進(jìn)行qRT-PCR 分析KCS 基因在不同抗旱性品種谷子對(duì)干旱處理的響應(yīng)情況，結(jié)果如圖7 所示，其中除Seita.4G116400 基因在干旱處理的AN04 中表達(dá)量下調(diào)及Seita.8G168900 基因在干旱處理的在沁黃2 號(hào)中表達(dá)量下調(diào)外，其他所有基因在3 個(gè)品種谷子干旱處理情況下表達(dá)量都有明顯升高。在干旱脅迫處理下，豫谷1 號(hào)中6 個(gè)KCS 基因的表達(dá)均上調(diào)，AN04 中除Seita.4G116400外也都顯示表達(dá)量上調(diào)，且Seita. 1G042400、Seita.9G470700 的上調(diào)幅度最大，說明這些基因在谷子干旱脅迫響應(yīng)過程中起到重要作用。

3 結(jié)論與討論

超長(zhǎng)鏈脂肪酸在植物的生存和發(fā)育中發(fā)揮重要作用，也是蠟質(zhì)合成的關(guān)鍵前體物質(zhì)，超長(zhǎng)鏈脂肪酸的合成受β-酮脂酰輔酶A 合酶（KCS）的調(diào)節(jié)，該酶主要負(fù)責(zé)催化?；o酶A 與丙二酰輔酶A 的縮合[15]。有研究表明，擬南芥中共有2 類KCS 基因，一類為FAE 型共有21 個(gè)，一類為ELO 型有2 個(gè)，其中ELO 型功能尚不明確[16]。本研究中的谷子KCS 基因?yàn)镕AE 型，共鑒定出33 個(gè)谷子KCS 基因，這些基因分別位于8 條染色體上，在6 號(hào)染色體上未發(fā)現(xiàn)KCS 基因，可能是由進(jìn)化過程中的染色體移位或片段丟失引起的。多數(shù)谷子KCS 蛋白等電點(diǎn)大于7，呈堿性，與辣椒KCS 蛋白分析結(jié)果相似[17]。5 個(gè)物種KCS 蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析顯示，谷子KCS 家族成員大多與與高粱、玉米聚集在一起，說明谷子和高粱、玉米之間的親緣關(guān)系最近，其次是水稻，而谷子和擬南芥親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，與谷子PEPC 基因家族的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果相似[18]，可能與谷子和高粱、玉米同屬禾本科C4作物有關(guān)。

脂質(zhì)代謝途徑主要位于植物的質(zhì)體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和過氧化物酶體中[19]。在之前的研究中已證實(shí)擬南芥中蠟質(zhì)合成的基因主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中表達(dá)，如AtKCS9[20]和AtCER10[21]蛋白均定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。然而，大多數(shù)谷子KCS 蛋白預(yù)計(jì)主要在質(zhì)膜中表達(dá)，少數(shù)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體中表達(dá)。預(yù)測(cè)結(jié)果與高粱KCS 蛋白預(yù)測(cè)結(jié)果一致[22]，與擬南芥存在差異。谷子KCS 蛋白亞細(xì)胞位置的差異可能表明這些基因以不同的方式發(fā)揮作用。谷子KCS 蛋白主要分為5 個(gè)不同的亞組。大多數(shù)谷子KCS 基因在其開放閱讀框區(qū)域沒有或只有1 個(gè)內(nèi)含子，基因結(jié)構(gòu)的典型模式與擬南芥[16]和蘋果[23]中的基因結(jié)構(gòu)模式一致。進(jìn)一步分析了谷子KCS 蛋白的保守基序，大多數(shù)KCS 蛋白都具有相同的基序組成和相似的位置分布，表明這些蛋白在植物中可能具有相似的功能。然而，對(duì)這些基序的研究仍然有限，其調(diào)控功能有待進(jìn)一步探討。此外，通過識(shí)別谷子KCS 基因上游順式作用元件，同棉花大多數(shù)KCS 家族基因含有GA 響應(yīng)元件[24]，可能具有響應(yīng)外源赤霉素誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)細(xì)胞壁厚度的功能；同時(shí)在谷子KCS基因家族成員中大多都具有脫落酸響應(yīng)元件和MYB 結(jié)合位點(diǎn)，通過前人在獼猴桃[25]和柑橘[26]中的研究，預(yù)測(cè)谷子KCS 基因可能受MYB 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控激活，以防御干旱脅迫中發(fā)揮重要作用[27-28]。

本研究中，預(yù)測(cè)到谷子KCS 基因啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件中存在大量MYB 的結(jié)合位點(diǎn)，已有研究證明，MYB 轉(zhuǎn)錄因子在作物中主要參與干旱響應(yīng)，其在應(yīng)對(duì)干旱脅迫中有特定的作用，如調(diào)節(jié)氣孔運(yùn)動(dòng)、控制木栓質(zhì)和表皮蠟的合成以及調(diào)節(jié)花穗發(fā)育[29]。有研究發(fā)現(xiàn)，PeKCS 基因受包括MYB 在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，且在干旱脅迫條件下PeKCS 基因在葉片中的表達(dá)顯著上調(diào)，在莖和根中未表達(dá)[30]，這可能與其調(diào)節(jié)氣孔開閉及蠟質(zhì)積累應(yīng)對(duì)干旱脅迫有關(guān)。這些結(jié)果與谷子KCS 基因表達(dá)情況相似，可以推測(cè)在谷子中KCS 基因的表達(dá)可能受到多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控，其中MYB 轉(zhuǎn)錄因子可能對(duì)KCS 基因的表達(dá)影響最大，可能是導(dǎo)致KCS 基因在穗和葉中具有較高表達(dá)的原因，但還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

基因表達(dá)模式是判斷基因功能的重要依據(jù)，本研究對(duì)谷子KCS 基因在不同組織中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)KCS 基因在穗和葉片中具有較高的表達(dá)量，只有少數(shù)基因在根中表達(dá)。有研究報(bào)道，苜蓿KCS 基因在氣生器官的發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，KCS 基因缺失突變體中植株角質(zhì)層蠟質(zhì)缺失造成植株形態(tài)改變，發(fā)育缺陷，同時(shí)在野生型中定量PCR 結(jié)果顯示KCS 基因在野生型的葉片、花和莖尖分生組織等氣生器官中廣泛表達(dá)，但在根中表達(dá)水平較低[31]。本研究對(duì)3 種不同抗旱性谷子品種分別進(jìn)行田間和溫室自然干旱處理，分析谷子KCS 基因在其中的表達(dá)情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多數(shù)基因在3 個(gè)品種干旱處理下顯示表達(dá)上調(diào)，其中Seita.9G470700 和Seita.9G487500 基因在不同品種不同時(shí)間均有很高的表達(dá)量，且在干旱脅迫下表達(dá)量顯著升高。qRTPCR結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)類似，其中Seita.1G042400、Seita. 1G308900、Seita. 9G470700 和Seita. 9G487500在3 個(gè)品種中干旱處理下均顯示表達(dá)量上調(diào)，且Seita. 1G042400、Seita. 9G470700 在干旱敏感型品種安-04 中差異表達(dá)顯著，對(duì)干旱脅迫的響應(yīng)水平較高。此外Seita.4G116400 基因和Seita.8G168900基因分別在干旱敏感品種安-04 和抗旱品種沁黃2 號(hào)中干旱脅迫下表達(dá)量降低，表明其響應(yīng)干旱脅迫的水平較低，推測(cè)其主要功能不在于響應(yīng)干旱脅迫，可能參與其他生物學(xué)功能。

本研究對(duì)谷子基因組中的33 個(gè)KCS 基因進(jìn)行了系統(tǒng)分析和鑒定，根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹將其分為6 個(gè)亞家族，谷子和高粱、玉米KCS 蛋白顯示出更緊密的進(jìn)化關(guān)系。對(duì)谷子KCS 基因上游啟動(dòng)子區(qū)順式作用元件分析預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)KCS 基因中含有多種激素和逆境響應(yīng)元件及轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中脫落酸響應(yīng)元件和MYB 結(jié)合位點(diǎn)較多，推測(cè)KCS 基因在響應(yīng)干旱脅迫時(shí)可能受脫落酸和MYB 轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。谷子KCS 基因表達(dá)模式顯示，他們?cè)谒牒腿~片中表達(dá)量較高，且多數(shù)基因響應(yīng)干旱脅迫。

其中Seita.9G470700 和Seita.9G487500 基因在不同抗旱品種中都擁有較高的表達(dá)量且均受干旱脅迫誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)均含有大量motif 基序和各種響應(yīng)元件，據(jù)此推測(cè)，他們?cè)诠茸由L(zhǎng)發(fā)育及響應(yīng)干旱脅迫中發(fā)揮重要作用。這些發(fā)現(xiàn)為研究谷子中KCS 基因的功能提供了基礎(chǔ)，為谷子抗旱性品種的選擇和創(chuàng)制提供了新的線索。