決明苯丙氨酸解氨酶（PAL）基因家族的全基因組分析

摘要：利用HMMER、Pfam與SMART等工具，從決明（Senna tora）等不同物種中篩選獲得26條PAL（苯丙氨酸解氨酶）序列，并對其進(jìn)行生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，決明PAL基因家族的基本特征在單雙子葉植物分離之前就已形成，且6個PAL成員被分為3個亞類。決明PAL基因家族成員的二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲組成；含有較高的Ala、Ser和Leu殘基；存在16種不同的保守基序，其中motif12（含有催化關(guān)鍵序列Ala-Ser-Gly）在所有PAL成員中均出現(xiàn)；啟動子區(qū)含有較多的光反應(yīng)、植物激素響應(yīng)與逆境脅迫響應(yīng)元件。進(jìn)一步的GO、轉(zhuǎn)錄組與Pearson分析也強(qiáng)化了以上分析結(jié)果，即決明PAL基因家族成員多集中在葉、莖和花等易感受光的組織，參與抗旱與抗菌等生物學(xué)過程呈現(xiàn)多樣化的特點(diǎn)。以上分析結(jié)果將為決明PAL基因的后續(xù)功能研究及抗逆功能基因篩選提供理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：決明（Senna tora）；丙氨酸解氨酶（PAL）；基因家族；生物信息學(xué)

中圖分類號：S567.219" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：0439-8114（2023）06-0181-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.033 開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Genome wide analysis of the phenylalanine ammonia lyase （PAL） gene family

from Senna tora

ZHAO Yong-yang， CHEN Wei-jia， DING Jing-feng， AO Yi-heng， FENG Ao， ZHOU Jia-yu

（School of Life Science and Engineering， Southwest Jiaotong University， Chengdu" 610031， China）

Abstract： Using tools such as HMMER， Pfam， and SMART， 26 PAL （phenylalanine ammonia lyase） sequences were screened from different species such as Senna tora， and analyzed for bioinformatics. The results showed that the basic characteristics of the PAL gene family of Senna tora had been formed before the isolation of monocotyledonous and dicotyledonous plants， and the six PAL members were divided into three subclasses. The secondary structure of the members of the PAL gene family of Senna tora was mainly composed of α-helixes and irregular curls， containing higher Ala， Ser， and Leu residues； there were 16 different conservative motifs， among which motif12 （containing the catalytic key sequence Ala Ser Gly） appeared in all PAL members； the promoter region contained many elements for light response， plant hormone response， and stress response. Further GO， transcriptome， and Pearson analyses had also reinforced the above analysis results， indicating that members of the PAL gene family of Senna tora were mostly concentrated in light-sensitive tissues such as leaves， stems， and flowers， and participated in diverse biological processes such as drought resistance and antibacterial activities. The above analysis results would provide a theoretical basis for the subsequent functional study of the PAL gene of Senna tora and the screening of stress resistant functional genes.

Key words： Senna tora； alanine ammonia lyase （PAL）； gene family； bioinformatics

苯丙烷代謝是植物次生代謝中的一條重要途徑，由其合成木質(zhì)素、類黃酮與生物堿等次生物質(zhì)，不僅參與植物的多種生理過程，還具有極高的經(jīng)濟(jì)與藥用價值。例如，木質(zhì)素作為植物細(xì)胞壁的重要組成成分，不僅能提高植物的結(jié)構(gòu)剛性，還能承受由于蒸騰作用所導(dǎo)致的負(fù)壓。木質(zhì)素廣泛參與植物對環(huán)境脅迫的響應(yīng)過程，提高木質(zhì)素的含量可以提高植物的抗倒伏、抗病性與抗逆性［1］。類黃酮與生物堿具有藥用活性，其中類黃酮具有良好的抗氧化、抗癌、抗炎癥以及抗菌作用［2］；生物堿可以消炎抑菌，調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)，調(diào)節(jié)心血管機(jī)能［3］。

苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia lyase， PAL）是植物苯丙烷類代謝途徑的關(guān)鍵酶，其基因長度為2 000～2 200 bp，編碼酶蛋白的氨基酸為680～730個［4］。分析歐芹（Petroselinum crispum （Mill.） Hill）與大麥（Hordeum vulgare L.）等PAL的晶體結(jié)構(gòu)［5］，發(fā)現(xiàn)它們的活性形式均為同源四聚體，每個亞基由3個結(jié)構(gòu)域組成，其催化關(guān)鍵序列（Ala-Ser-Gly）位于MIO結(jié)構(gòu)域。PAL具有多種功能，主要催化苯丙氨酸的非氧化脫氨形成反式肉桂酸（Trans-cinnamic acid），參與木質(zhì)素、類黃酮等下游苯丙烷物質(zhì)的合成［6］。過表達(dá)PAL的植物能獲得較高的生長發(fā)育速度與較強(qiáng)的抗逆性，而降低PAL 基因的表達(dá)會減少木質(zhì)素的合成，減弱抗逆性，表明PAL基因與植物抗逆性存在正向關(guān)聯(lián)性［7］。近期研究還發(fā)現(xiàn)，PAL基因的表達(dá)模式較復(fù)雜，Cheng等［8］發(fā)現(xiàn)苦蕎PAL基因在花和種子中的轉(zhuǎn)錄水平均高于根、莖和葉片；然而，施圓圓等［4］發(fā)現(xiàn)異葉天南星的3個PAL轉(zhuǎn)錄本在根中表達(dá)量均最高，表明PAL基因在不同物種中存在組織表達(dá)差異，推測其原因可能為PAL基因的表達(dá)受到MYB等多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［9］。

決明（Senna tora）為豆科（Fabaceae Lindl.）決明屬（Cassia L.）植物，屬于藥食同源的植物，在云南省、四川省等多個省份有豐富的野生資源。決明的種子（又稱為決明子）含有豐富的蒽醌、類黃酮等成分，在治療高血壓、高脂血癥、明目、便秘和白內(nèi)障等病癥都有顯著療效［10］。決明也是常見園林栽培植物，其抗旱能力強(qiáng)于同屬植物望江南與傘葉決明［11］。然而，目前對決明的研究主要集中在藥用成分，對決明代謝與抗逆功能基因的研究較少。例如，Xiang等［12］發(fā)現(xiàn)決明Kunitz抑制劑對棉鈴蟲、菜青蟲等鱗翅目害蟲表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗蟲活性。Deng等［13］對決明種子、根、莖等不同組織開展了3+2代轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)Hsp20家族成員在不同組織具有分布特異性。Kang等［14］首次報(bào)道了決明的全基因組信息，為后續(xù)分子層面的研究奠定了遺傳學(xué)基礎(chǔ)；克隆鑒定了類查爾酮合酶（Chalcone-like）基因，并發(fā)現(xiàn)該基因可能參與了決明蒽醌的合成。本研究基于決明基因組信息，確定PAL基因家族成員，對PAL基因表達(dá)產(chǎn)物的理化性質(zhì)、保守基序進(jìn)行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建決明PAL基因家族成員與其他植物的系統(tǒng)進(jìn)化樹，并結(jié)合實(shí)驗(yàn)室前期獲得的決明不同組織的3+2代轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析決明PAL基因家族成員在不同組織的表達(dá)特征，以上研究成果將為進(jìn)一步認(rèn)識PAL基因在植物體內(nèi)的功能提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 決明PAL 基因家族成員的確認(rèn)

在Phytozome（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）數(shù)據(jù)庫中，初步檢索PAL基因 序列，獲得候選序列。在Pfam 數(shù)據(jù)庫中，選取基因號為KAF7818627.1的PAL基因序列，以其特征結(jié)構(gòu)域的HMM文件作為query［15］，利用基于隱馬爾可夫模型的HMMER 檢索PAL 基因組。根據(jù)分子質(zhì)量進(jìn)行序列剔除，最終獲得決明的6個PAL基因家族成員。

1.2 決明PAL基因的理化性質(zhì)分析

使用ProtParam在線工具（https：//web.expasy.org/protparam/）對6 個決明PAL基因的氨基酸組成和理化性質(zhì)進(jìn)行分析；再利用SOPMA在線工具（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/）分析其結(jié)構(gòu)特征。

1.3 PAL基因的系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析

選取其他物種的PAL基因，利用MEGA 7.0 軟件進(jìn)行多序列比對，再采用鄰接法（Neighbor-Joining method）［16］構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，參數(shù)為：Method：Poisson，Gaps：Pairwise Deletion，Test of inferred phylogeny：Bootstrap，Replications：1 000，其余參數(shù)默認(rèn)。

1.4 PAL蛋白序列的基序分析

利用MEME在線工具（http：//meme-suite.org/tools/meme），分析決明PAL蛋白序列中的保守性基序，基序數(shù)量上限設(shè)為20，其余參數(shù)默認(rèn)。

1.5 基因順勢結(jié)構(gòu)元件分析

利用TBtools工具，提取決明6條PAL基因起始密碼子上游1 500 bp的序列，并將其作為啟動子序列，利用PlantCare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcarehtml）分析啟動子中的順式作用元件。

1.6 基因表達(dá)量分析

Deng等［13］前期研究已獲得轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。利用MolPure? Plant RNA Kit 植物RNA提取試劑盒提取決明種子、根、莖、葉、花5種植物樣本，并對RNA 的濃度、純度及完整性進(jìn)行檢測，達(dá)到要求后進(jìn)行文庫構(gòu)建。庫檢合格后，用單分子測序（SMRT）與Illumina平臺進(jìn)行3+2代測序，以FPKM（每千個堿基的轉(zhuǎn)錄每百萬映射讀取的fragments）為衡量基因表達(dá)水平的指標(biāo)。使用TBtools提取PAL基因注釋信息，利用eggNOG-mapper（http：//eggnog-mapper.embl.de）完成GO富集分析，并繪制差異表達(dá)基因 GO 注釋與功能分類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 決明PAL基因家族成員的確定

采用Megablast工具，分別以AT3G53260.1、AWW24969.1與BAM63315.2基因的特征結(jié)構(gòu)域?yàn)闄z索序列，以決明基因組為模板，同源檢索得到候選序列，隨后通過HMMER、SMART 和 Pfam工具進(jìn)行驗(yàn)證，最終獲得6個PAL基因家族成員（表1）。

2.2 決明 PAL的理化性質(zhì)分析

利用ProtParam在線分析工具對6個決明PAL的氨基酸序列進(jìn)行分析。由圖1可知，決明PAL基因編碼的蛋白質(zhì)約由700個氨基酸組成，分子質(zhì)量約為77 ku。Ala、Glu、Gly、Leu、Ser和Val 6種氨基酸的含量最豐富，占比約50.00%，其中，含量最高的3種氨基酸分別為Leu、Ala和Ser，平均占比分別為10.75%、8.70%和7.87%。

利用SOPMA在線網(wǎng)站分析二級結(jié)構(gòu)（表2），結(jié)果表明，各PAL成員的二級結(jié)構(gòu)組成占比相似，均由α-螺旋、β-折疊、無規(guī)卷曲和延伸鏈組成。其中，α-螺旋與無規(guī)卷曲是二級結(jié)構(gòu)的主要組成部分，占比分別為53.83%～59.32%、27.88%～32.51%。

2.3 植物 PAL基因系統(tǒng)發(fā)育分析

為了評估決明PAL成員的進(jìn)化關(guān)系，利用鄰接法獲得系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2），該進(jìn)化樹中Bootstrap值超過70的節(jié)點(diǎn)達(dá)65.6%，超過90的節(jié)點(diǎn)達(dá)46.9%，表明該系統(tǒng)進(jìn)化樹的可信度較高。系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，PAL氨基酸序列嚴(yán)格按照種屬關(guān)系分為2簇（Bootstrap的值均為100），第1簇由被子植物組成，包含雙子葉植物與單子葉植物；第2簇由裸子植物（穗烏毛蕨、問荊）與苔蘚植物（溪苔）2種蕨類植物組成。形成第2簇的可能原因是，相較于穗烏毛蕨，問荊是蕨類植物中較原始的種類，與苔蘚植物有更近的親緣關(guān)系。第1簇雙子葉植物亞簇中包括豆科植物、擬南芥。決明的6個PAL成員被分為3個亞組，第1亞組由KAF7804446.1、KAF7801471.1和KAF7818627.1組成；第2亞組由KAF7820144.1組成，第3亞組有2個成員（KAF7827046.1與KAF7805612.1），推測現(xiàn)有PAL成員起源于3個PAL祖先基因，通過復(fù)制形成。KAF7820144.1與XP 028773595.1 PAL Prosopis alba互為直系同源基因，KAF7805612.1與XP 028808004.1 PAL Prosopis_alba互為直系同源基因，表明決明與角豆的親緣關(guān)系最近，這與它們均屬于云實(shí)亞科植物相吻合。

2.4 PAL家族成員保守基序分析

通過 MEME 在線工具對6 個決明PAL成員進(jìn)行保守性基序的預(yù)測，鑒定出16個不同的保守基序（圖3），motif12出現(xiàn)頻率為 100%，表示motif12在所有的決明PAL基因中均出現(xiàn)（圖3a）。字母的相對大小表示它們在序列中出現(xiàn)的頻率。每個字母的高度與該位置相應(yīng)堿基的出現(xiàn)頻率成正比。Motif12含有PAL催化所需的關(guān)鍵序列Ala-Ser-Gly （圖3b），該三肽序列經(jīng)環(huán)化和脫水后形成4-methylidene-imidazole-5-one（MIO）。MIO作為親電基團(tuán)，與苯丙氨酸的芳香環(huán)發(fā)生相互作用，并最終導(dǎo)致苯丙氨酸脫氨形成反式肉桂酸。

2.5 決明PAL家族成員基因啟動子分析

將決明中PAL家族成員基因起始密碼子上游" "1 500 bp作為啟動子序列，利用PlantCare分析順式作用元件。由圖4可知，6條序列均含有光響應(yīng)元件（Light）。除KAF7827046.1外，其余5個成員均存在脫落酸響應(yīng)元件（Abscisic acid）。KAF7801471.1、KAF7804446.1和KAF7827046.1的啟動子中還存在赤霉素響應(yīng)元件（Gibberellin）。KAF7804446.1和KAF7820144.1可能同時響應(yīng)水楊酸（Salicylic acid）與茉莉酸甲酯（MeJA）。并且KAF7820144.1、KAF7801471.1和KAF7818627.1含有干旱響應(yīng)元件（Drought），可能參與干旱響應(yīng)。KAF7804446.1、KAF7805612.1和KAF7827046.1的啟動子區(qū)存在無氧響應(yīng)元件（Anaerobic）。結(jié)果表明，6個決明PAL成員擁有多樣性的生物學(xué)功能，可能參與決明生長發(fā)育、激素應(yīng)答和環(huán)境脅迫響應(yīng)等過程。

2.6 決明PAL基因表達(dá)分析

在前期研究中，已獲得決明種子、根、莖、葉與花等不同組織的“3+2”全長轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)［13］。6個PAL基因家族成員分別在決明不同組織的FPKM見表3。不同PAL成員在決明不同組織中的表達(dá)差異較明顯，KAF7804446.1在根、莖中的表達(dá)量最高，F(xiàn)PKM分別為209.773、382.133；KAF7827046.1在葉中的表達(dá)量最高，F(xiàn)PKM為98.243；KAF7820144.1是花中表達(dá)量最高的成員（90.677）；而在種子中，KAF7805612.1的表達(dá)量最高（8.083）。不同成員的表達(dá)呈組織特異性的趨勢，KAF7827046.1和KAF7818627.1在葉中的表達(dá)量明顯高于其他組織；KAF7820144.1、KAF7805612.1和KAF7801471.1在花中的表達(dá)量明顯高于其他組織。

進(jìn)一步對6個PAL成員進(jìn)行GO（Gene ontology）分析和功能分類（圖5）。發(fā)現(xiàn)只有KAF7805612.1不參與任何生物學(xué)過程，其余5個PAL成員可能均具有PAL活性，參與了響應(yīng)放線菌酮、殺真菌劑及對赤霉素等生物學(xué)過程。

3 小結(jié)與討論

本研究利用隱馬爾可夫模型，依托NCBI數(shù)據(jù)庫中決明的全基因組信息，篩選獲得6個決明PAL基因家族成員。它們的分子質(zhì)量為76.51～79.72 ku，與歐芹［5］、大麥［6］與異葉天南星等植物PAL的分子質(zhì)量大小吻合［4］。Leu、Ala和Ser 3種氨基酸的含量最豐富，其中Ala、Ser是α-螺旋中常見的氨基酸殘基。α-螺旋和無規(guī)則卷曲是構(gòu)成PAL二級結(jié)構(gòu)的主要組成，該結(jié)果與大麥等植物PAL的氨基酸組成與二級結(jié)構(gòu)特性［7］基本相同，表明PAL的氨基酸組成與二級結(jié)構(gòu)特性相吻合。同時，以上數(shù)據(jù)表明，不同植物來源的PAL具有較高的二級結(jié)構(gòu)相似性，推測盡管不同植物來源的PAL在一級結(jié)構(gòu)上有一定的差異，但它們具有高度相似的二級結(jié)構(gòu)單元，導(dǎo)致它們可能行使相近的功能。

系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果顯示，雙子葉植物與單子葉植物的PAL形成被子植物簇，并與蕨類植物、裸子植物的遺傳距離較遠(yuǎn)。PAL基因的進(jìn)化與植物進(jìn)化過程基本一致，進(jìn)一步證明PAL基因在植物的進(jìn)化過程中具有較高的保守性，與Huang等［9］的報(bào)道相似。決明PAL成員由3個亞組組成，處于亞組內(nèi)部的成員（KAF7827046.1與KAF7805612.1）具有較近的遺傳距離，推測它們在功能上也有相似性。不同亞組間的遺傳距離較遠(yuǎn)，推測各亞組的形成發(fā)生在決明與角豆物種分化前，隨后，經(jīng)過復(fù)制與物種內(nèi)分化形成6個PAL成員。

通過MEME 在線工具鑒定出決明PAL基因家族有16 條不同的保守基序，其中motif12出現(xiàn)頻率最高。Motif12中出現(xiàn)一段PAL基因家族成員的特征性保守序列，該結(jié)果與Mahesh等［17］的結(jié)果一致。該特征性序列中含有一個與催化作用相關(guān)的關(guān)鍵三肽，即Ala-Ser-Gly，可見在PAL基因家族中Ala與Ser具有較高的保守性。觀察大麥SbPAL1的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)該三肽形成的MIO與Gln475、Asn247及鄰近亞基的Tyr338形成氫鍵，穩(wěn)定其空間位置［18］。MIO中的次甲基作為親電基團(tuán)，與苯環(huán)上的鄰位碳原子發(fā)生Friedel-Crafts反應(yīng)，促進(jìn)苯丙氨酸的非氧化脫氨［5］。本研究發(fā)現(xiàn)，該保守序列同樣出現(xiàn)在MIO結(jié)構(gòu)域，位于第7個α-螺旋與第8個α-螺旋間（部分位于第8個α-螺旋），正好位于底物口袋中，推測可能具有結(jié)合并催化苯丙氨酸的作用。相關(guān)位點(diǎn)也可能成為PAL改造的重要候選位點(diǎn)，在后期的分子育種中可對它們加以利用。

PAL作為植物木質(zhì)素、類黃酮等物質(zhì)合成途徑的關(guān)鍵酶之一，在植物不同組織中的表達(dá)模式受到研究人員的廣泛關(guān)注。決明PAL成員在不同組織中的表達(dá)量有明顯差異，KAF7804446.1的總體表達(dá)量最高，KAF7805612.1的總體表達(dá)量最低；KAF7805612.1僅在種子時期表達(dá)量最高，但FPKM仍然較低，說明PAL在種子時期幾乎不表達(dá)。決明PAL成員主要集中的葉、花、莖等易感受光的組織，這與順式作用元件分析結(jié)果一致，也與齊學(xué)會等［19］的結(jié)果相近。決明PAL的啟動子區(qū)不僅含有較多的光反應(yīng)元件，還含有較多的植物激素響應(yīng)元件、逆境脅迫響應(yīng)元件和生長發(fā)育相關(guān)的元件，表明了決明PAL可能參與生長發(fā)育和抗逆防御等生理過程，與PAL參與紫外線、干旱與受傷時的表達(dá)模式［11，16，20，21］變化一致。進(jìn)一步的GO分析發(fā)現(xiàn)，PAL參與了響應(yīng)放線菌酮及赤霉素等生物過程，部分結(jié)果也強(qiáng)化了順式元件的分析結(jié)果。只有KAF7805612.1不參與任何生物學(xué)過程，其余成員有相似的生物學(xué)功能，幾乎參與所有生物學(xué)過程，推測KAF7805612.1為假基因，這與其表達(dá)量最低的結(jié)果吻合。

本研究結(jié)果可以為將來深入開展決明PAL基因功能提供理論基礎(chǔ)，可能提高植物對生物及非生物脅迫的抗性，對提高糧食作物產(chǎn)量具有重要意義。

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收稿日期：2022-02-09

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31500276）；四川省中醫(yī)藥管理局項(xiàng)目（2021MS116）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)醫(yī)工結(jié)合項(xiàng)目（2682021ZTPY017）；國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃資助項(xiàng)目（202110613083）；西南交通大學(xué)個性化實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目（GX20211600310001）

作者簡介：趙詠洋（2001-），女，天津人，在讀本科生，專業(yè)方向?yàn)樯锕こ?，（電話?5922009066（電子信箱）1423963396@qq.com；通信作者，周嘉裕（1976-），女，四川宜賓人，副教授，博士，主要從事植物分子生物學(xué)研究，（電話）1550204560（電子信箱）spinezhou@home.swjtu.edu.cn。