水稻抗褐飛虱基因Bph43緊密連鎖KASP標(biāo)記開發(fā)與驗(yàn)證

摘要：為促進(jìn)Bph43基因在抗褐飛虱（Nilaparvata lugens）水稻品種選育中的應(yīng)用，在前期Bph43精細(xì)定位的基礎(chǔ)上，將Bph43基因供體親本IRGC 8678進(jìn)行重測(cè)序，通過(guò)與日本晴參考基因組以及3 000份水稻測(cè)序公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源進(jìn)行SNP變異位點(diǎn)分析，設(shè)計(jì)開發(fā)出Bph43緊密連鎖區(qū)間特異的KASP標(biāo)記（K_11674982、K_11775428和K_11856768）。66份水稻自然群體及200份BC1F2代雜交后代的驗(yàn)證結(jié)果表明，開發(fā)的3個(gè)KASP標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，標(biāo)記基因型分析結(jié)果與抗褐飛虱表型完全符合，能特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出水稻中是否含有Bph43基因?；赟NP位點(diǎn)開發(fā)的Bph43 KASP標(biāo)記可用于發(fā)掘攜帶Bph43基因的新種質(zhì)及抗褐飛虱分子標(biāo)記輔助選擇育種。

關(guān)鍵詞：水稻；褐飛虱（Nilaparvata lugens）；Bph43；KASP標(biāo)記；抗褐飛虱育種

中圖分類號(hào)：S435" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）06-0169-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.031

Development and validation of a tightly linked KASP marker for the rice brown planthopper resistance gene Bph43

DENG Zhao1，2， WANG Kai1， DU Bo3， ZHU Li-li3， YANG Yuan-zhu1，2， CHEN Rong-zhi3，4

（1. Key Laboratory of Southern Rice Innovat amp; Improvement Ministry of Agriculture and Rural Affairs/Hunan Engineering Laboratory for Disease and Pest Resistant Rice Breeding， Yuan Longping High-Tech Agriculture Co.， Ltd.，Changsha" 410128， China；2. College of Agriculture， Hunan Agriconomy University， Changsha" 410128， China； 3.School of Life Sciences/State Key Laboratory of Hybrid Rice，Wuhan University， Wuhan" 430072， China； 4.Shenzhen Research Institute， Wuhan University， Shenzhen" 518057，Guangdong， China）

Abstract： To promote the application of Bph43 in the breeding of rice varieties resistant to brown planthopper，on the basis of fine mapping of Bph43 in the early stage， the Bph43 gene donor parent IRGC 8678 was resequenced. By conducting SNP mutation site analysis with the Japanese reference genome and 3 000 rice sequencing public database resources， the study designed and developed Bph43 tightly linked interval specific KASP markers （K_11674982， K_11775428， and K_11856768）. The validation results of 66 natural populations of rice and 200 BC1F2 hybrid progeny showed that the three developed KASP markers were codominance markers， and the genotype analysis results of the markers were completely consistent with the phenotype of brown planthopper resistance， which could specifically and accurately detect whether there was Bph43 gene in rice. The Bph43 KASP marker developed based on SNP loci could be used to explore new germplasm carrying the Bph43 gene and molecular marker assisted selection breeding for resistance to brown planthopper.

Key words： rice； brown planthopper（Nilaparvata lugens）； Bph43； KASP marker； breeding for resistance to brown planthopper

水稻是中國(guó)最重要的糧食作物之一。褐飛虱（Nilaparvata lugens）是水稻單食性、刺吸式口器害蟲，通過(guò)口針吸食水稻韌皮部中的汁液。褐飛虱的輕度危害可導(dǎo)致水稻植株生長(zhǎng)活力降低、產(chǎn)量下降；重度危害可導(dǎo)致水稻全株死亡，甚至顆粒無(wú)收。全國(guó)農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣服務(wù)中心對(duì)2006—2015年農(nóng)作物主要病蟲害發(fā)生危害情況的統(tǒng)計(jì)和分析表明，中國(guó)年平均發(fā)生稻飛虱（最主要的是褐飛虱）面積為0.002 6億km2次，每年因稻飛虱危害造成的損失位居水稻病蟲害之首，占水稻病蟲害總損失的29.51%［1］。褐飛虱也在泰國(guó)、越南等亞洲各國(guó)大面積發(fā)生，每年造成幾十億美元的經(jīng)濟(jì)損失，導(dǎo)致了2007—2008年全球大米危機(jī)［2］。褐飛虱已成為水稻生產(chǎn)中發(fā)生面積最大、造成危害最嚴(yán)重的害蟲。因此，遏制褐飛虱的發(fā)展和危害對(duì)保障糧食安全、推動(dòng)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義。

實(shí)踐證明，農(nóng)作物病蟲害綜合治理與持續(xù)控制的基礎(chǔ)是選育和種植抗性品種。利用作物自身抗病蟲基因培育抗病蟲新品種是病蟲害防治中最經(jīng)濟(jì)有效和環(huán)境友好的措施，也是未來(lái)農(nóng)業(yè)綠色發(fā)展的必由之路［3］。目前從栽培稻和野生稻資源中鑒定出的抗褐飛虱基因超過(guò)40個(gè)，其基因資源和分子標(biāo)記正應(yīng)用于抗褐飛虱分子標(biāo)記輔助選擇育種中［4］。袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司應(yīng)用Bph6和Bph9培育出通過(guò)國(guó)家審定的超級(jí)雜交中稻品種瑋兩優(yōu)7713，抗褐飛虱3級(jí)。在中華人民共和國(guó)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織的超級(jí)稻測(cè)產(chǎn)驗(yàn)收中，瑋兩優(yōu)7713平均產(chǎn)量達(dá)1 083.6 kg/666.7 m2，且未發(fā)現(xiàn)稻飛虱危害。推廣和應(yīng)用抗褐飛虱水稻品種，對(duì)防治褐飛虱危害發(fā)揮重要作用。

水稻和褐飛虱在長(zhǎng)期的協(xié)同進(jìn)化過(guò)程中，水稻形成了抗性基因，而褐飛虱在水稻抗性基因的選擇壓力下可發(fā)生致害性變異。目前已報(bào)道的褐飛虱生物型有10余種，且致害能力有逐漸增強(qiáng)的趨勢(shì)［5］。褐飛虱致害性變異導(dǎo)致水稻抗性喪失是褐飛虱持續(xù)防控面臨的潛在挑戰(zhàn)。為應(yīng)對(duì)褐飛虱生物型變異，需進(jìn)一步發(fā)掘水稻種質(zhì)資源中新的抗褐飛虱基因。前期從抗源IRGC 8678中發(fā)掘并精細(xì)定位了新型廣譜抗褐飛虱基因Bph43［6］。本研究進(jìn)一步開發(fā)與Bph43緊密連鎖且特異的KASP標(biāo)記，并在水稻自然群體與基因分離群體中進(jìn)行驗(yàn)證，為Bph43在抗褐飛虱分子標(biāo)記輔助選擇育種中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究所用的Bph43基因供體親本IRGC 8678來(lái)源于國(guó)際水稻研究所，珞揚(yáng)9號(hào)、9311以及9311/IRGC 8678//9311的BC1F2群體來(lái)源于雜交水稻全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，其余供試材料來(lái)源于袁隆平農(nóng)業(yè)高科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 水稻基因組DNA的提取 取供試水稻品種苗期幼嫩葉片，采用CTAB法提取水稻高質(zhì)量基因組DNA［7］。并將基因組DNA溶解于TE 緩沖液，用于后續(xù)的重測(cè)序或KASP標(biāo)記基因型檢測(cè)。

1.2.2 基因組重測(cè)序 為保證文庫(kù)構(gòu)建質(zhì)量，首先對(duì)IRGC 8678基因組DNA質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)顯示基因組DNA主帶完整清晰，且無(wú)降解和RNA污染。Nanodrop檢測(cè)OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.2，無(wú)蛋白質(zhì)污染。質(zhì)檢合格的基因組DNA，嚴(yán)格按照NEBNext? Ultra? II FS DNA Library Prep Kit for Illumina?中提供的方法進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。使用Qubit 3.0軟件對(duì)構(gòu)建完成的文庫(kù)進(jìn)行初步定量，利用Agilent 2100檢測(cè)文庫(kù)插入片段大小，再通過(guò)ANALYTIKJENA QTOWER 實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀對(duì)文庫(kù)的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，有效濃度＞2 nmol/L為合格文庫(kù)。最后按照目標(biāo)下機(jī)數(shù)據(jù)量對(duì)文庫(kù)進(jìn)行pooling，用Illumina HiSeq X TEN平臺(tái)進(jìn)行Paired-end 150 bp（PE150）測(cè)序。水稻基因組重測(cè)序由武漢基諾賽克科技有限公司完成。

1.2.3 KASP標(biāo)記開發(fā) 對(duì)測(cè)序獲得的原始數(shù)據(jù)（raw data 或raw reads），使用Cutadapt軟件（version 1.13）去除reads中含有的接頭序列，使用Trimmomatic軟件（version 0.36）去除reads中的低質(zhì)量堿基。使用BWA軟件（version 0.7.15-r1140）的MEM算法將測(cè)序數(shù)據(jù)與日本晴參考基因組（版本號(hào)IRGSP 1.0）進(jìn)行比對(duì)，得到SAM格式的比對(duì)結(jié)果［8］。使用Samtools軟件（version 1.3.1）將SAM格式文件轉(zhuǎn)換成BAM格式，用Picard工具（version 1.91）中的SortSam對(duì)BAM文件中的reads進(jìn)行排序，并使用Samtools的rmdup去除PCR重復(fù)，最終得到的BAM文件，用于覆蓋度和覆蓋深度統(tǒng)計(jì)以及variant calling［9］。最后，應(yīng)用GATK（version 3.7）軟件包中的GenotypeGVCFs模塊進(jìn)行SNP變異檢測(cè)［10］。進(jìn)而調(diào)出Bph43基因精細(xì)定位區(qū)間對(duì)應(yīng)日本晴參考基因組（版本號(hào)IRGSP1.0）第11號(hào)染色體16 642 878 bp至16 918 771 bp的SNP，進(jìn)一步結(jié)合3 000份水稻測(cè)序公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源分析SNP位點(diǎn)的分布頻率，篩選出Bph43基因緊密連鎖區(qū)間特有的SNP位點(diǎn)。以獲得的Bph43區(qū)間特有的SNP位點(diǎn)為靶點(diǎn)，分別獲取其在日本晴參考基因組上下游各200 bp的序列進(jìn)行KASP引物設(shè)計(jì)，對(duì)設(shè)計(jì)的KASP引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，測(cè)試引物的分型效果。

1.2.4 KASP標(biāo)記分型 以待測(cè)水稻基因組DNA作為模板，利用KASP標(biāo)記K_11674982、K_11775428和K_11856768進(jìn)行KASP反應(yīng)檢測(cè)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系以2 μL計(jì)：1 μL模板DNA，100 μmol/L的Fam和Hex引物各0.007 μL，100 μmol/L的Com引物0.015 μL，以2×KASP Master Mix補(bǔ)足至總體積2 μL。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：反應(yīng)在水浴熱循環(huán)儀中完成，第一步擴(kuò)增反應(yīng)，94 ℃預(yù)變性15 min，94 ℃變性20 s，65～57 ℃退火并延伸60 s，10個(gè)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)退火及延伸的溫度降低0.8 ℃；第二步擴(kuò)增反應(yīng)，94 ℃變性20 s，57 ℃退火并延伸60 s，26個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后利用LGC IntelliQube基因分型平臺(tái)對(duì)PCR反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行熒光掃描和基因分型。KASP標(biāo)記PCR產(chǎn)物檢測(cè)到Hex熒光信號(hào)，表明待測(cè)水稻樣品中含純合抗褐飛虱基因Bph43；若檢測(cè)到Fam熒光信號(hào)，表明待測(cè)水稻樣品不含抗褐飛虱基因Bph43；若同時(shí)檢測(cè)到Fam熒光和Hex熒光，則表明待測(cè)水稻樣品中Bph43為雜合型。

2 結(jié)果與分析

2.1 Bph43緊密連鎖的KASP標(biāo)記開發(fā)

Bph43基因精細(xì)定位區(qū)間對(duì)應(yīng)日本晴參考基因組（版本號(hào)IRGSP 1.0）第11號(hào)染色體16 642 878 bp至16 918 771 bp的SMP。將Bph43基因供體親本IRGC 8678進(jìn)行30X覆蓋的基因組重測(cè)序，與日本晴參考基因組序列進(jìn)行對(duì)比，獲取Bph43緊密連鎖區(qū)間內(nèi)SNP變異位點(diǎn)。進(jìn)一步利用3 000份水稻測(cè)序公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源分析SNP位點(diǎn)的分布頻率，篩選Bph43基因緊密連鎖區(qū)間特有的SNP位點(diǎn)。最終將位于參考基因組（IRGSP1.0）日本晴第11號(hào)染色體11 674 982、11 775 428、11 856 768 bp處的SNP位點(diǎn)作為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)相應(yīng)的KASP標(biāo)記K_11674982（Bph43抗褐飛虱基因在該SNP位點(diǎn)為T等位，其余水稻資源在該位點(diǎn)為A等位）、K_11775428（Bph43抗褐飛虱基因在該SNP位點(diǎn)為T等位，其余水稻資源在該位點(diǎn)為C等位）和K_11856768（Bph43抗褐飛虱基因在該SNP位點(diǎn)為G等位，其余水稻資源在該位點(diǎn)為A等位）。KASP引物序列見表1。3個(gè)KASP標(biāo)記檢測(cè)Bph43抗蟲等位的引物序列都帶有Hex標(biāo)簽序列，而檢測(cè)Bph43感蟲等位的引物序列都帶有Fam標(biāo)簽序列，因此在利用3個(gè)KASP標(biāo)記PCR擴(kuò)增攜帶純合Bph43的水稻樣品時(shí)可產(chǎn)生Hex熒光信號(hào)，擴(kuò)增不含Bph43的水稻樣品產(chǎn)生Fam熒光信號(hào)，而雜合型水稻樣品可產(chǎn)生Fam和Hex 2種熒光信號(hào)。

2.2 Bph43 KASP標(biāo)記在水稻自然群體的驗(yàn)證

為了驗(yàn)證Bph43緊密連鎖的KASP標(biāo)記在水稻自然群體中的適用性和通用性，本研究應(yīng)用K_11674982、K_11775428和K_11856768對(duì)Bph43基因供體親本IRGC 8678、含Bph9基因的珞揚(yáng)9號(hào)以及其他64份水稻品種進(jìn)行鑒定。標(biāo)記的分型效果如圖1所示，本研究開發(fā)的3個(gè)KASP標(biāo)記均在Bph43基因供體親本IRGC 8678中檢測(cè)到強(qiáng)的Hex熒光信號(hào)，即含Bph43純合基因型；在含Bph9基因的珞揚(yáng)9號(hào)、其他64份水稻品種檢測(cè)到強(qiáng)的Fam熒光信號(hào)，表明這些水稻品種不含Bph43。親本基因型結(jié)果（表2）表明，3個(gè)KASP熒光標(biāo)記具有較強(qiáng)的特異性，能準(zhǔn)確檢測(cè)出水稻中是否含有Bph43基因，這將有助于發(fā)掘攜帶Bph43基因的新種質(zhì)，并提高Bph43基因在抗褐飛虱育種中的利用率。

2.3 Bph43 KASP標(biāo)記在分離群體的驗(yàn)證

本研究進(jìn)一步利用開發(fā)的3個(gè)Bph43 KASP標(biāo)記（K_11674982、K_11775428和K_11856768）對(duì)9311/IRGC8678//9311的BC1F2群體中的200個(gè)單株進(jìn)行基因型分型。結(jié)果（圖2）表明，3個(gè)KASP標(biāo)記Bph43基因型檢測(cè)結(jié)果均一致（一一對(duì)應(yīng)），3種不同基因型Bph43純合（Hex熒光信號(hào)，藍(lán)色標(biāo)記點(diǎn)）、Bph43雜合（同時(shí)檢測(cè)到Fam和Hex熒光信號(hào)，紫色標(biāo)記點(diǎn)）以及bph43純合（不含Bph43，F(xiàn)am熒光信號(hào)，紅色標(biāo)記點(diǎn)）的分離比為45∶106∶49，經(jīng)卡方檢驗(yàn)符合1∶2∶1的孟德爾單基因分離比（χ2＝0.88lt;χ20.05＝5.99）。3個(gè)KASP標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，可以將2種不同的純合子以及雜合子區(qū)分開，檢測(cè)位點(diǎn)同時(shí)表現(xiàn)為單基因分離。

為了進(jìn)一步明確KASP標(biāo)記（K_11674982、K_11775428和K_11856768）檢測(cè)的BC1F2材料基因型與其抗褐飛虱表型是否一致，各隨機(jī)選擇經(jīng)KASP標(biāo)記確定的20份Bph43純合基因型、20份Bph43雜合基因型以及20份不含Bph43的BC1F2材料。將BC1F2材料進(jìn)行自交，得到對(duì)應(yīng)的BC1F23材料，采用苗期集團(tuán)法考察60份BC1F23材料的抗性表現(xiàn)（以BC1F23家系抗性級(jí)別代表BC1F2單株的抗褐飛虱表型）。Bph43純合基因型BC1F2材料平均抗性值均為2.5，抗褐飛虱；Bph43雜合基因型BC1F2材料平均抗性值在4.1～4.5，對(duì)褐飛虱表現(xiàn)為雜合抗性；不含Bph43的BC1F2材料均對(duì)褐飛虱表現(xiàn)為感性，抗性值約為9。結(jié)果表明，3個(gè)Bph43 KASP標(biāo)記基因型與抗褐飛虱表型完全符合，可應(yīng)用于Bph43的分子標(biāo)記輔助選擇育種實(shí)踐。

3 小結(jié)與討論

褐飛虱是水稻生產(chǎn)中發(fā)生面積最大、造成危害最嚴(yán)重的害蟲。遏制褐飛虱的發(fā)展和危害對(duì)保障中國(guó)糧食安全具有重要意義。實(shí)踐證明，培育和種植抗褐飛虱水稻品種是褐飛虱綜合防治的基礎(chǔ)。新的《主要農(nóng)作物品種審定標(biāo)準(zhǔn)（國(guó)家級(jí)）》強(qiáng)調(diào)品種安全性，突出綠色發(fā)展，要求對(duì)華南稻區(qū)、長(zhǎng)江上游稻區(qū)及長(zhǎng)江中下游稻區(qū)水稻褐飛虱抗性進(jìn)行鑒定，且抗蟲品種可作為綠色優(yōu)質(zhì)品種進(jìn)行分類審定。而培育抗蟲水稻品種的關(guān)鍵在于稻種資源中所蘊(yùn)藏的抗褐飛虱基因。目前已從栽培稻和野生稻資源中鑒定了40多個(gè)抗褐飛虱基因［4］，其中，較多的抗褐飛虱基因成簇分布在染色體相同或者相近的區(qū)域，大多是同一基因或同一基因的等位變異，能在生產(chǎn)上大面積使用的抗褐飛虱基因并不多，加上褐飛虱存在生物型變異，因此，仍需發(fā)掘更多具有重大育種應(yīng)用價(jià)值的抗褐飛虱新基因。

傳統(tǒng)的水稻抗蟲育種是通過(guò)抗蟲性狀鑒定對(duì)植株進(jìn)行表型選擇。由于水稻材料抗蟲性鑒定的復(fù)雜性，利用常規(guī)育種手段進(jìn)行抗蟲基因的轉(zhuǎn)育效率較低?？购诛w虱基因定位或克隆后，與抗褐飛虱基因緊密連鎖的分子標(biāo)記、基因特異性分子標(biāo)記或基因功能標(biāo)記已經(jīng)或正在應(yīng)用于抗褐飛虱分子標(biāo)記輔助選擇育種中［11-16］。這些標(biāo)記大多為SSR或者InDel標(biāo)記，依賴于瓊脂糖凝膠電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分析，試驗(yàn)費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本研究在前期從抗源IRGC 8678中發(fā)掘并精細(xì)定位其中的新型廣譜抗褐飛虱基因Bph43基礎(chǔ)上，通過(guò)抗褐飛虱基因Bph43親本材料的基因組重測(cè)序，將與Bph43緊密連鎖或共分離的區(qū)域序列，與3 000份水稻測(cè)序公共數(shù)據(jù)庫(kù)資源進(jìn)行對(duì)比分析，篩選出Bph43緊密連鎖區(qū)間稀有或特有的SNP位點(diǎn)，開發(fā)出Bph43特異的KASP標(biāo)記。相對(duì)于傳統(tǒng)的分子標(biāo)記，KASP標(biāo)記不需要進(jìn)行電泳，可通過(guò)熒光掃描直接讀取基因型的信號(hào)實(shí)現(xiàn)基因分型，具有穩(wěn)定性好、準(zhǔn)確性高、檢測(cè)效率高、檢測(cè)成本低等優(yōu)勢(shì)。水稻自然群體與基因分離群體的驗(yàn)證結(jié)果表明，本研究開發(fā)的Bph43特異KASP標(biāo)記是共顯性標(biāo)記，標(biāo)記基因型分析結(jié)果與抗褐飛虱表型符合，能特異、準(zhǔn)確地檢測(cè)出水稻中是否含有Bph43基因，可準(zhǔn)確進(jìn)行Bph43基因的導(dǎo)入和聚合，高效選育含Bph43基因的抗褐飛虱水稻品種，從而為少打農(nóng)藥、減少糧食損失、發(fā)展環(huán)境友好型和資源節(jié)約型農(nóng)業(yè)做出重要貢獻(xiàn)。

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收稿日期：2022-05-20

基金項(xiàng)目：深圳市基礎(chǔ)研究項(xiàng)目（JCYJ20180302173435080）

作者簡(jiǎn)介：鄧 釗（1989-），男，湖南邵陽(yáng)人，在讀博士研究生，研究方向?yàn)樗痉肿舆z傳育種，（電話）18508420628（電子信箱）470571084@qq.com；通信作者，楊遠(yuǎn)柱（1962-），男，湖南懷化人，研究員，主要從事雜交水稻育種研究，（電話）13607442126（電子信箱）yzhuyah@163.com；陳榮智（1976-），男，重慶人，副教授，博士，主要從事水稻抗褐飛虱基因發(fā)掘與利用研究，（電話）15972013776（電子信箱）rzchen@whu.edu.cn。