厚樸中總鞣質(zhì)提純工藝及抗菌活性研究

摘要：通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）中總鞣質(zhì)的提取工藝，并進(jìn)一步純化。結(jié)果表明，厚樸中總鞣質(zhì)的最佳提取工藝為料液比1∶13、提取時(shí)間100 min、乙醇濃度80%、超聲功率80 W，厚樸總鞣質(zhì)提取量為0.181 0 mg/g，與理論值0.188 8 mg/g差距小。利用正交試驗(yàn)考察明膠溶液沉淀法對(duì)厚樸總鞣質(zhì)的最佳純化工藝為濃縮液比重1.5 mg/mL、明膠溶液濃度4%、明膠溶液添加量8 mL/100 mg，厚樸總鞣質(zhì)提取量為2.743 mg/g。利用最小抑菌濃度測定法比較總鞣質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌活性，表明厚樸中總鞣質(zhì)具有一定的抗菌活性。

關(guān)鍵詞：厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）；總鞣質(zhì)；響應(yīng)面法；正交試驗(yàn)；抗菌活性

中圖分類號(hào)：R284.2" " " " "文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：0439-8114（2023）06-0129-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2023.06.024

Study on the purification technology and antibacterial activity of total tannins from

Magnolia officinalis

YANG Min1，XI Jun-wei2

（1.Shaanxi Institute of International Tradeamp;Commerce，Xi’an" 712046，China；

2.Shaanxi Adverse Drug Reaction Monitoring Center， Xi’an" "710000，China）

Abstract： The extraction process of total tannins from Magnolia officinalis was optimized by response surface design and further purified. The results showed that the best extraction process for total tannins from Magnolia officinalis was the ratio of material to liquid of 1∶13， extraction time of 100 min， ethanol concentration of 80% and ultrasonic power of 80 W. The total tannins extracted from Magnolia officinalis was 0.181 0 mg/g， which was not far from the theoretical value of 0.188 8 mg/g. The optimum purification process of total tannins from Magnolia officinalis by gelatin solution precipitation was studied by an orthogonal test. When the specific gravity of concentrated solution was 1.5 mg/mL， the concentration of gelatin solution was 4%， and the amount of gelatin solution added was 8 mL/100 mg， the total tannins extracted from Magnolia officinalis was 2.743 mg/g. The antibacterial activities of total tannins against Staphylococcus aureus and Escherichia coli were compared by the minimum inhibitory concentration method. The results showed that the total tannins from Magnolia officinalis had certain antibacterial activity.

Key words： Magnolia officinalis Rehd. et Wils.； total tannins； response surface methodology； orthogonal test； antibacterial activity

厚樸（Magnolia officinalis Rehd. et Wils.）為木蘭科植物［1］，在南方地區(qū)分布較多［2］，分為厚樸和凹葉厚樸。厚樸具有很強(qiáng)的抗菌療效，能夠有效地控制牙周病原體、致齲菌和突變菌株的病情發(fā)展。此外還具有促消化［3］、抗氧化［4］、消炎止痛等功效，其組分復(fù)雜，包含約100種成分，其中含量較高的為黃酮類、多糖及木質(zhì)素類，總鞣質(zhì)含量為1%～3%［5］。厚樸酚類物質(zhì)中以厚樸酚以及和厚樸酚為主，其提取、純化工藝及活性已經(jīng)得到廣泛研究。在厚樸酚及和厚樸酚提取純化過程中的鞣質(zhì)類物質(zhì)均以廢棄物處理，越來越多的研究表明，鞣質(zhì)類物質(zhì)具有抗腫瘤［6］、抗氧化［7，8］、抗菌［9］等藥理活性。本試驗(yàn)采用超聲輔助法提取厚樸總鞣質(zhì)，蛋白質(zhì)沉淀法進(jìn)行回收，并測定其抗菌活性，變廢為寶，以充分利用厚樸資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

厚樸（產(chǎn)自陜西安康）、大腸埃希菌（Escherichia coli，CMCC（B）44102）、去離子水、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26003）、沒食子酸對(duì)照品（批號(hào)：140306）、牛肉膏、蛋白胨、NaCl、瓊脂粉、NaOH、生理鹽水、無水碳酸鈉、無水乙醇、磷鉬鎢酸試劑等，試驗(yàn)所用試劑均為分析純。

1.2 試驗(yàn)儀器

FA20048型電子天平，上海精密儀器有限公司；TU-1810型紫外可見光-分光光度計(jì)，上海長城制造有限公司；YXQ-LS-50SII型高壓蒸汽滅菌器，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗機(jī)，昆山超聲儀器有限公司；SW-CJ-2FD型超凈工作臺(tái)，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；GDW-100型恒溫培養(yǎng)箱，天津市泰斯特儀器有限公司；XZ-1B型濁度儀，常州德杜精密儀器有限公司；YP202N型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司；RE-2000E型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，鞏義市瑞力儀器設(shè)備有限公司；SHZ-III型循環(huán)水真空泵，鄭州賽特利斯生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 總鞣質(zhì)的測定

1）沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。精密稱量5 mg沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，配制0.5 mg/mL水溶液，取不同體積標(biāo)準(zhǔn)液，通過磷鉬鎢酸比色法，在760 nm的波長下測定其吸光度，建立沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線［10］，線性關(guān)系在試驗(yàn)范圍內(nèi)有效（圖1）。

2）總鞣質(zhì)含量的計(jì)算。計(jì)算公式：總鞣質(zhì)含量=總酚量-不被吸收的多酚量。

其中，總酚含量的測定依據(jù)“1.3.1”的方法進(jìn)行測定，不被吸收的多酚量依據(jù)干酪素反應(yīng)進(jìn)行測定［11］。

1.3.2 厚樸總鞣質(zhì)提純方法 稱取定量鮮厚樸原料，用一定濃度的乙醇溶液進(jìn)行超聲提取，提取液濃縮成不同的比重，趁熱分別加入不同比例的明膠溶液至沉淀完全，放冷濾過，濾渣加入乙醇進(jìn)行溶解，蒸干溶劑即可得總鞣質(zhì)提純物。

1.3.3 厚樸總鞣質(zhì)抗菌活性測定

1）菌種活化及菌懸液制備。將凍干菌種粉末在無菌條件下接種于復(fù)壯液中，37 ℃培養(yǎng)18 h，將細(xì)菌培養(yǎng)液均勻涂布在平板中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，再選取對(duì)數(shù)生長曲線內(nèi)的細(xì)菌菌落接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24 h，將菌液用無菌水稀釋，經(jīng)比濁儀對(duì)比，將其濃度調(diào)整為1×107 CFU/mL。

2）總鞣質(zhì)溶液制備及MIC測定。將粗總鞣質(zhì)（樣品1）及總鞣質(zhì)精品（樣品2）分別配制成16 mg/mL和6 mg/mL的溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，利用試管稀釋法［12］測定總鞣質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC，取12支試管，2～11號(hào)試管用液體培養(yǎng)基對(duì)樣品溶液進(jìn)行梯度稀釋，總體積為" " 1 mL，再分別加入1 mL制備好的菌懸液，1號(hào)試管加入1 mL樣品溶液和1 mL菌懸液作為陽性對(duì)照，12號(hào)試管加入2 mL液體培養(yǎng)基作為陰性對(duì)照，于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察溶液不出現(xiàn)渾濁時(shí)所對(duì)應(yīng)的濃度為該細(xì)菌的MIC。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 提取時(shí)間對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響 在超聲功率140 W、料液比1∶20和乙醇濃度80%的條件下，考察提取時(shí)間對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響。由圖2可知，提取時(shí)間在20～80 min時(shí)，厚樸總鞣質(zhì)提取量呈先減少后增加的趨勢，60～80 min時(shí)，總鞣質(zhì)提取量變化比較大，當(dāng)提取時(shí)間為80 min時(shí)，總鞣質(zhì)提取量達(dá)到最大值0.120 mg/g。隨著提取時(shí)間繼續(xù)增加，總鞣質(zhì)的提取量逐漸減少。其原因可能是由于超聲波空化時(shí)產(chǎn)生的高溫條件，使得大分子物質(zhì)斷裂而損失。故最佳提取時(shí)間為80 min。

2.1.2 料液比對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響 在超聲功率140 W、提取時(shí)間80 min和乙醇濃度80%的條件下，考察料液比對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響。由圖3可知，在1∶10至1∶40的范圍內(nèi)，隨著提取劑添加量不斷加大，厚樸中總鞣質(zhì)提取量總體呈先增加再減少的趨勢。在1∶15至1∶40的范圍內(nèi)，隨著溶劑的不斷增加，厚樸中總鞣質(zhì)提取量呈迅速下降、緩慢上升又繼續(xù)下降的趨勢。分析其原因可能是，當(dāng)乙醇溶液達(dá)到一定量時(shí)，厚樸中總鞣質(zhì)溶解已經(jīng)達(dá)到飽和，再增加乙醇溶液也不會(huì)使厚樸中總鞣質(zhì)含量增加，但此時(shí)隨著鞣質(zhì)溶出的雜質(zhì)卻增多，從而導(dǎo)致有效成分的相對(duì)含量逐漸減少。厚樸中總鞣質(zhì)提取量在料液比為1∶15 時(shí)為最大值。

2.1.3 乙醇濃度對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響 在超聲功率140 W、料液比1∶15和提取時(shí)間80 min的條件下，考察乙醇濃度對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響。由圖4可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)持續(xù)增加，從厚樸中提取的總鞣質(zhì)量呈先增加后減少的趨勢。當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，從厚樸中提取的總鞣質(zhì)量最大。當(dāng)乙醇濃度超過80%時(shí)，厚樸總鞣質(zhì)提取量急劇下降。分析原因可能是，乙醇濃度的增大有助于厚樸中總鞣質(zhì)的浸出，但由于總鞣質(zhì)中含有大量酚羥基，當(dāng)乙醇濃度高時(shí)，脂溶性組分的沉淀限制了總鞣質(zhì)的提取。因此，最佳乙醇濃度為80%。

2.1.4 超聲功率對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響 在乙醇濃度80%、料液比1∶15和提取時(shí)間80 min的條件下，考察超聲功率對(duì)厚樸中總鞣質(zhì)提取量的影響。由圖5可知，隨著超聲功率增大，厚樸中總鞣質(zhì)的提取量先增大后減小。當(dāng)超聲功率在40～100 W時(shí)，總鞣質(zhì)提取量由0.052 2 mg/g增加至0.209 7 mg/g。而當(dāng)達(dá)到100 W后，隨著超聲功率的增加提取量減小，此時(shí)超聲功率對(duì)總鞣質(zhì)的提取未出現(xiàn)促進(jìn)作用。這可能是由于對(duì)于一定強(qiáng)度和發(fā)射表面的超聲波，功率增加時(shí)聲音強(qiáng)度增加，聲壓幅度和液體中的壓力也增加，產(chǎn)生的空化氣泡破裂所需的時(shí)間將變短，從而有利于提取量的增加，但當(dāng)溶質(zhì)擴(kuò)散濃度達(dá)到平衡時(shí)，增大超聲功率反而造成提取量的下降。由此可得最佳超聲功率為100 W，可選擇該功率用于隨后的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

2.2 Box-Behnken試驗(yàn)的結(jié)果分析

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇提取時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）、超聲功率（D），利用Design-Expert 8. 0. 6軟件進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，結(jié)果如表1、表2所示。

對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)統(tǒng)計(jì)和分析，求得總鞣質(zhì)提取量（Y）對(duì)提取時(shí)間（A）、料液比（B）、乙醇濃度（C）和超聲功率（D）的回歸模型為：Y=0.16+0.005 24A-0.009 367B-0.008 417C-0.008 575D-0.002 425AB+0.020AC - 0.013AD + 0.003 650BC + 0.004 975BD -0.003 725CD-0.011A2-0.021B2-0.019C2-0.001 745D2。

由表3可知，回歸模型（Plt;0.05）顯著，失擬項(xiàng)不顯著（P=0.117 0gt;0.05），可信度較高。方程的決定系數(shù)R2=0.966 9，Radj2=0.933 8，說明實(shí)際數(shù)據(jù)非常接近理論值，可解釋度高。4個(gè)因素中，提取時(shí)間對(duì)厚樸總鞣質(zhì)的提取量影響不顯著，提取時(shí)間與乙醇濃度、超聲功率之間的交互作用明顯，四因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小為料液比gt;超聲功率gt;乙醇濃度gt;提取時(shí)間。

圖6為各因素交互作用對(duì)總鞣質(zhì)提取量的影響，由3D圖陡峭程度可知，因素AC、AD交互作用明顯。料液比最佳取值范圍為1∶12至1∶15，提取時(shí)間在90～100 min有最大值，乙醇濃度在75%～85%對(duì)響應(yīng)值的影響顯著，提取功率的最佳取值范圍為80～96 W，得到的最佳提取工藝為料液比1∶13.12、提取時(shí)間100 min、乙醇濃度83.57%、超聲功率80 W，厚樸總鞣質(zhì)提取量為0.188 8 mg/g。根據(jù)實(shí)際情況可將工藝調(diào)整為料液比1∶13、提取時(shí)間100 min、乙醇濃度80%、超聲功率80 W，將原料量擴(kuò)大10倍，按照優(yōu)化的工藝進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，厚樸中總鞣質(zhì)提取量分別為0.181 3、0.179 2、0.182 6 mg/g，平均值為0.181 0 mg/g，與理論值相差小，故工藝可行。

2.3 厚樸總鞣質(zhì)純化結(jié)果

稱取500 g厚樸鮮原料，經(jīng)粉碎，以最優(yōu)工藝提取3次，提取液合并濃縮，使其比重為2.5 mg/mL，稀釋為2.0、1.5、1.0、0.5 mg/mL濃度的溶液，配制1%、2%、3%、4%、5%明膠溶液，以2、4、6、8、10、12 mL/100 mg作為添加量，經(jīng)單因素試驗(yàn)確定最佳取值范圍，利用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)確定最優(yōu)組合，結(jié)果見表4、表5。

分析正交試驗(yàn)結(jié)果，均值響應(yīng)表顯示響應(yīng)值影響大小為明膠溶液添加量gt;明膠溶液濃度gt;濃縮液比重，其最佳組合為X12X22X33，即濃縮液比重1.5 mg/mL、明膠溶液濃度4%、明膠溶液添加量8 mL/100 mg，從方差分析結(jié)果（表6）可知，明膠溶液添加量對(duì)響應(yīng)值影響最顯著。

2.4 厚樸總鞣質(zhì)抗菌活性測定結(jié)果

通過梯度稀釋法測定粗總鞣質(zhì)（樣品1）及總鞣質(zhì)精品（樣品2）對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的MIC。表7結(jié)果顯示，樣品1對(duì)大腸埃希菌的MIC為0.25 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為0.125 mg/mL；樣品2對(duì)大腸埃希菌的MIC為4.69×10-2 mg/mL，對(duì)金黃色葡萄球菌的MIC為2.34×10-2 mg/mL。通過抗菌活性的測定可以看出，厚樸總鞣質(zhì)的純度越高抗菌活性越強(qiáng)，同一濃度下，其對(duì)金黃色葡萄球菌的抗菌活性大于對(duì)大腸埃希菌的抗菌活性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化厚樸中總鞣質(zhì)的提取工藝，并進(jìn)一步純化，其中，提取工藝為料液比1∶13、提取時(shí)間100 min、乙醇濃度80 %、提取功率80 W；純化工藝為濃縮液比重1.5 mg/mL、明膠溶液濃度4%、明膠溶液添加量8 mL/100 mg，工藝可靠，在純化過程中對(duì)其他成分的破壞性??；利用最小抑菌濃度測定法比較總鞣質(zhì)對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的抗菌活性，結(jié)果表明，厚樸中的總鞣質(zhì)具有一定的抗菌活性，且對(duì)革蘭氏陽性菌的抗菌活性大于革蘭氏陰性菌，研究結(jié)果可對(duì)厚樸藥材資源的充分利用與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

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收稿日期：2023-03-13

基金項(xiàng)目：國家科技部重大新藥創(chuàng)制項(xiàng)目（2018ZX09721-005-009-013）；陜西國際商貿(mào)學(xué)院中藥質(zhì)量標(biāo)志物創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（SSY18TD02）

作者簡介：楊 敏（1986-），女，陜西咸陽人，實(shí)驗(yàn)師，主要從事中藥制藥及成分分析研究，（電話）18091041916（電子信箱）375477274@qq.com；通信作者，奚軍偉（1979-），男，陜西大荔人，副主任藥師，主要從事中藥制藥及藥品不良反應(yīng)研究，（電話）13575571093（電子信箱）315948175@qq.com。