?高效降解廚余垃圾復(fù)合菌劑的構(gòu)建及應(yīng)用

摘 要：選取10種微生物菌株，分析其產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力，根據(jù)廚余垃圾中有機(jī)質(zhì)成分及酶活功能信息構(gòu)建一種高效降解廚余垃圾復(fù)合菌劑，并進(jìn)行廚余垃圾堆肥的應(yīng)用研究。結(jié)果表明：釀酒酵母產(chǎn)淀粉酶的能力最高，地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力最高，米曲霉產(chǎn)纖維素酶的能力最高，枯草芽孢桿菌產(chǎn)脂肪酶能力最高。拮抗性試驗發(fā)現(xiàn)只有短芽孢桿菌屬與地衣芽孢桿菌存在拮抗性關(guān)系。分別選取5株高酶活微生物構(gòu)建4組復(fù)合菌劑，酶活測定結(jié)果表明，由鹽居固氮菌（Azotobacter salinestris）、綠色木霉（Trichoderma viride）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、蠟樣芽孢桿菌（Bacillus cereus）和米曲霉（Aspergillus oryzae）組配的F2微生物復(fù)合菌劑的產(chǎn)酶能力較好，其中淀粉酶為25.0 U/mL，蛋白酶為0.13 U/mL，纖維素酶為1 244 U/mL，脂肪酶為4.09 U/mL。堆肥結(jié)果表明：添加復(fù)合菌劑F2組最高溫達(dá)到67 ℃，高溫期持續(xù)14 d，C/N為18.31，pH值為9.08，種子發(fā)芽指數(shù)為103.17%，相較于CK組堆肥效果更好，可使堆肥高溫期延長4 d，堆肥提前6 d達(dá)到完全腐熟。

關(guān)鍵詞：廚余垃圾；微生物菌劑；篩選；堆肥

中圖分類號：S141.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號： 1006-060X（2023）03-0061-06

Abstract：According to organic matter components， and microbial enzyme activities and functions of kitchen waste， 10 microbial strains were selected and their abilities of producing amylase， protease， cellulase and lipase were analyzed so as to construct a compound microbial agent for kitchen waste efficient degradation. Then the constructed compound microbial agent was applied in the kitchen waste composting experiment. The results showed that the following strains had the strongest capacity to produce a specific enzyme： Saccharomyces cerevisiae for amylase， Bacillus licheniformis for protease， Aspergillus oryzae for cellulase， and Bacillus subtilis for lipase. Antagonistic test found that antagonistic relationship was only presented between Brevibacillus and Bacillus licheniformis. Eventually， five kinds of strains with high enzyme activity were selected to construct four groups of compound microbial agents. The results of enzyme activity test showed that the F2 compound microbial agent composed of Azotobacter salinestris， Trichoderma viride， Bacillus licheniformis， Bacillus cereus and Aspergillus oryzae had good enzyme production ability， of which the amylase activity was 25.0 U/mL， protease 0.13 U/mL， cellulase 1 244 U/mL and lipase 4.09 U/mL. Results of the composting experiment showed that in F2 group the maximum temperature reached 67 ℃， the high temperature period lasted for 14 days， the C/N was 18.31， the pH was 9.08， and the seed germination rate was 103.17%; compared with CK group， F2 group had better composting effect， in which the high temperature period was extended by 4 days， and the compost reached complete maturation 6 days in advance.

Key words：kitchen waste; microbial agent; select; compost

隨著經(jīng)濟(jì)社會的發(fā)展，人們生活水平逐漸提高，我國廚余垃圾的產(chǎn)生量也在急劇增長。廚余垃圾主要成分為水、淀粉、蛋白質(zhì)、油脂和纖維素，以及無機(jī)鹽等[1]，容易腐爛變質(zhì)，對環(huán)境衛(wèi)生造成惡劣影響[2]。因此，如何將廚余垃圾進(jìn)行清潔處理并資源化利用受到越來越多研究者的關(guān)注。目前廚余垃圾資源化利用技術(shù)主要是厭氧消化、好氧堆肥、生物養(yǎng)殖以及化學(xué)煉制[3]，其中厭氧消化是最主要的處理方式，但是厭氧消化工程投資較大、產(chǎn)生的沼液需二次處理。而好氧堆肥因為工程投資較小、堆體腐熟后可以制成有機(jī)肥料[4]等優(yōu)點(diǎn)而受到關(guān)注，但是傳統(tǒng)好氧堆肥仍存在處理周期較長、有機(jī)物降解率不高等問題[5]。因此，很多學(xué)者通過添加微生物菌劑來縮短發(fā)酵周期，提高腐殖化率[6-7]。

在好氧堆肥中常常以單一菌劑或復(fù)合菌劑的方式添加微生物[8-10]，其中復(fù)合菌劑一般具有種類全、配伍合理、功能性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[11-15]，通過微生物的協(xié)同作用，堆肥降解率及腐熟效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于單一菌劑。為了獲取高效降解菌株，學(xué)者通常采用定向篩選法，即以特定培養(yǎng)基通過降解圈篩選出降解菌。例如咸芳[16]通過測定有機(jī)質(zhì)降解圈從餐廚垃圾中篩選出具有淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素及油脂降解效果的菌株復(fù)配成復(fù)合菌劑，并進(jìn)行餐廚垃圾堆肥試驗，結(jié)果表明添加復(fù)合菌劑能快速分解餐廚垃圾，可以加快腐熟進(jìn)程，實現(xiàn)餐廚垃圾的有效減量化；石娟[17]以大豆油為唯一碳源，通過測定生物量、脂肪酶活性和油脂降解率分離篩選出一株嗜熱嗜氣解硫胺素芽孢桿菌。然而這種篩選方法耗時長，且能夠通過培養(yǎng)方法篩選出來的微生物很少，而通過測定菌株培養(yǎng)發(fā)酵液的酶活能更直觀的體現(xiàn)菌株的功能信息，比較各菌株的酶活大小，篩選出優(yōu)勢菌，耗時更短。因此，基于微生物產(chǎn)酶功能信息有針對性地挑選功能菌株將更加精準(zhǔn)且高效[18-19]。

筆者選取10株微生物菌株，分析其產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力，從而得到各菌株的微生物產(chǎn)酶功能信息，并根據(jù)堆肥原料中有機(jī)質(zhì)成分挑選出對應(yīng)的高產(chǎn)酶菌株?；谖⑸镛卓剐栽囼灒鶕?jù)廚余垃圾中有機(jī)質(zhì)的比例，選擇5種產(chǎn)酶能力不同的微生物菌株構(gòu)建4種復(fù)合微生物菌劑，測定其產(chǎn)酶能力，由鹽居固氮菌、綠色木霉、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和米曲霉組配的F2復(fù)合菌劑的產(chǎn)酶能力較好，選取F2組復(fù)合菌劑進(jìn)行以廚余垃圾為原料，秸稈為調(diào)理劑的堆肥應(yīng)用研究。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株與培養(yǎng)基

試驗菌株購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心。采購的菌株包括4株細(xì)菌：a-枯草芽孢桿菌、b-蠟樣芽孢桿菌、c-短芽孢桿菌屬、d-地衣芽孢桿菌；1株霉菌：e-綠色木霉；2株酵母菌：f-釀酒酵母、g-米曲霉；1株放線菌：h-鏈霉菌屬；2株固氮菌：m-鹽居固氮菌、n-褐球固氮菌。具體培養(yǎng)條件見表1。

1.2 菌株活化與培養(yǎng)

吸取約0.5 mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基于凍干管中，將凍干菌粉充分溶解。取0.2 mL菌懸液轉(zhuǎn)移至裝有5～8 mL相應(yīng)的液體培養(yǎng)基的試管中混勻，并取0.1 mL菌懸液轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行劃線分離?；罨蟮木N配置OD600=1的菌懸液按10%接種量接種于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中。隨后置于各菌株相應(yīng)的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，并進(jìn)行傳代培養(yǎng)至第3代[20]。

1.3 菌株產(chǎn)酶能力測定

分別將第3代菌株接種至相應(yīng)的培養(yǎng)基中，按照表1中的條件進(jìn)行培養(yǎng)。取發(fā)酵液10 mL在4℃，8 000 r/min離心10 min，取上清液作為粗酶液，采用ZCI BIO試劑盒測定淀粉酶，蛋白酶，纖維素酶和脂肪酶的活性[21]，通過比較這10株菌的酶活大小，挑選出產(chǎn)酶能力強(qiáng)的菌株。

1.4 復(fù)合菌劑的構(gòu)建

1.4.1 拮抗性試驗 取上述10株菌兩兩混合接種于PDA固體培養(yǎng)基，呈十字劃線，倒置在恒溫培養(yǎng)箱30℃培養(yǎng)48 h，觀察菌種的生長情況，確認(rèn)是否出現(xiàn)拮抗現(xiàn)象[22]。

1.4.2 構(gòu)建高效堆肥復(fù)合菌劑 根據(jù)廚余垃圾中有機(jī)質(zhì)的比例，選擇5種產(chǎn)酶能力不同的菌株構(gòu)建4組復(fù)合微生物菌劑[23]，培養(yǎng)48 h后測定復(fù)合菌劑產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力[24-28]。

1.5 復(fù)合菌劑堆肥應(yīng)用研究

1.5.1 復(fù)合菌劑制備 分別制備鹽居固氮菌、米曲霉、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、綠色木霉的菌懸液（OD600=1），并按照1∶1∶2∶1∶1的體積配比制成100 mL復(fù)合菌懸液，并將其接種于1 L培養(yǎng)基內(nèi)在35℃恒溫?fù)u床內(nèi)擴(kuò)大培養(yǎng)96 h制成F2復(fù)合菌劑。

1.5.2 堆肥試驗方法 采用堆肥桶進(jìn)行廚余垃圾好氧堆肥試驗，設(shè)置2個試驗組：空白組（CK），添加復(fù)合菌劑組（F2）。以廚余垃圾為原料，秸稈作為調(diào)理劑，二者按照鮮重4∶1的比例進(jìn)行充分混合，調(diào)節(jié)堆體的含水率為68%，C/N為22.9。CK組和F2組分別在堆肥初期添加等量的超純水和1%復(fù)合菌劑發(fā)酵液，混合均勻后在堆肥桶中進(jìn)行堆置38 d。每天上午10：00使用3個溫度計分別插入堆體的上、中、下層，待溫度計穩(wěn)定后記錄溫度值；樣品采集方式為5點(diǎn)采樣法，采用分層的形式，在堆體中心取一點(diǎn)，堆體上層和下層各隨機(jī)取兩點(diǎn)，樣品混合均勻[29]。

1.5.3 測定方法 在堆肥0、1、3、5、8、11、15、19、25、31、38 d測定相關(guān)理化參數(shù)。理化參數(shù)的測定參考黃紅麗與戴美玲的測定方法[30-31]。含水率采用重量法測定；使用pH計測定堆肥濾液的pH值；總有機(jī)碳采用灼燒法測定；總氮采用凱氏定氮法測定；通過使用恒溫生化培養(yǎng)箱測定堆肥樣品濾液中種子發(fā)芽指數(shù)GI。GI（%）=（樣品種子發(fā)芽數(shù)×發(fā)芽根長）/（空白種子發(fā)芽數(shù)×發(fā)芽根長）×100。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，繪圖采用Origin 2018完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同菌株的產(chǎn)酶能力研究

對購買的這10株微生物菌株進(jìn)行活化傳代培養(yǎng)，并測定微生物產(chǎn)淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶和脂肪酶的能力，其結(jié)果見表2。廚余垃圾中含有淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素和油脂等有機(jī)質(zhì)，而微生物菌株是否產(chǎn)生淀粉酶、蛋白酶、纖維素酶、脂肪酶可以體現(xiàn)其是否具有降解這些有機(jī)質(zhì)的能力，酶活大小則體現(xiàn)其降解相應(yīng)有機(jī)質(zhì)的能力差異。從表2可以看出，10株菌株都具有產(chǎn)淀粉酶的能力，其中釀酒酵母產(chǎn)淀粉酶的能力最高，酶活性為37.2 U/mL；除了短芽孢桿菌屬都具有產(chǎn)蛋白酶的能力，其中地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力最高，酶活性為0.151 U/mL；只有綠色木霉、米曲霉和枯草芽孢桿菌能產(chǎn)纖維素酶，其中米曲霉的酶活數(shù)值最高，酶活性為1353.1 U/mL；10株單菌中只有鏈霉菌屬、米曲霉、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌和褐球固氮菌能產(chǎn)脂肪酶，其中枯草芽孢桿菌產(chǎn)脂肪酶能力最高，酶活性達(dá)到10.2 U/mL。

2.2 高效堆肥復(fù)合菌劑構(gòu)建

拮抗試驗是為了探明2株菌共存時二者是否存在拮抗作用，是否影響微生物的生長及活性，從而影響復(fù)合菌劑對廚余垃圾堆肥腐熟的效果。拮抗性試驗結(jié)果如表3所示，短芽孢桿菌屬和地衣芽孢桿菌有拮抗性，此外其他各菌彼此不存在拮抗作用。

每株單菌培養(yǎng)相應(yīng)時間后制備菌懸液（OD600= 1），根據(jù)廚余垃圾中淀粉、蛋白質(zhì)、纖維素及油脂等有機(jī)質(zhì)比例，分別調(diào)整添加具有相應(yīng)產(chǎn)酶能力的微生物菌株液體體積的比例，以10%的接種量構(gòu)建4組高效復(fù)合菌劑[32-33]，具體組配比例如表4所示。在35 ℃下在恒溫振蕩培養(yǎng)箱以150 r/min下振蕩培養(yǎng)48 h后分別測定這四組復(fù)合菌劑的產(chǎn)酶活性，其結(jié)果如表5所示。

從表5中酶活數(shù)值可以看出，F(xiàn)1組沒有產(chǎn)纖維素酶的能力；F2組的淀粉酶和纖維素酶活最高，酶活性分別為25 U/mL和1 244 U/mL，混合培養(yǎng)相比較單菌培養(yǎng)提高了產(chǎn)淀粉酶和蛋白酶的能力；F3組產(chǎn)脂肪酶的能力最好，酶活性為5.31 U/mL，混合培養(yǎng)提高了產(chǎn)蛋白酶的能力；F4組的蛋白酶酶活最高，酶活性為0.2 U/mL，比單菌培養(yǎng)時地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶高0.05 U/mL，說明微生物菌株相互協(xié)同，共同作用，提高了產(chǎn)酶能力?；趯嶒灲Y(jié)果，挑選F2組復(fù)合菌劑進(jìn)行以廚余垃圾原料，秸稈為調(diào)理劑的堆肥試驗。

2.3 高效堆肥復(fù)合菌劑應(yīng)用研究

2.3.1 堆肥過程中堆體溫度的動態(tài)變化 溫度是反映堆肥是否正常進(jìn)行的直接指標(biāo)。堆肥過程中對照組和實驗組的溫度變化如圖1所示，堆肥在7—8月進(jìn)行，環(huán)境溫度為32～38℃。堆肥過程中，主要經(jīng)歷3個階段，即升溫階段、高溫階段和降溫腐熟階段。CK組于第5 天進(jìn)入高溫期，高溫期持續(xù)10 d，最高溫度達(dá)到65℃；F2組于第4 天進(jìn)入高溫期，高溫期持續(xù)14 d，最高溫度達(dá)到67℃。相較于CK組，F(xiàn)2組提前1 d進(jìn)入高溫期，高溫期溫度更高，持續(xù)時間更長，說明廚余垃圾中原有的土著微生物活性不高，而添加自制復(fù)合菌劑F2能夠通過增加微生物活性分解有機(jī)物產(chǎn)生熱量使溫度上升，有利于殺滅蟲卵等有害物質(zhì)，有效促進(jìn)堆體腐熟。隨著堆肥反應(yīng)的持續(xù)，底物中的易降解物質(zhì)基本都被微生物分解，體系內(nèi)的各種有機(jī)質(zhì)的分解反應(yīng)也越來越徹底，因此溫度會降低。

2.3.2 堆肥過程中堆體pH的動態(tài)變化 pH值是影響微生物生長活動的重要指標(biāo)之一。堆肥期間pH值變化如圖2所示。CK、F2組pH值總體呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在堆肥初期，由于堆體中存在大量易分解的有機(jī)質(zhì)，微生物活性較高，這些有機(jī)物被微生物迅速分解，產(chǎn)生了一些有機(jī)酸，但由于廚

余垃圾中氮元素含量較高，微生物將堆料中含氮有機(jī)物分解產(chǎn)生NH3，從而使堆體的pH值逐漸上升，25 d后pH值下降可能是由于堆料中含氮量較高的有機(jī)物基本被降解完，而后期主要是對調(diào)理劑秸稈的降解，秸稈以木質(zhì)纖維素為主，氮素含量較低，因此pH值略有下降。在堆肥過程中，微生物不斷交互作用調(diào)節(jié) pH 值，2組 pH 均處于堆肥微生物適宜生長范圍中，CK組與F2組的pH值變化相似，說明添加復(fù)合菌劑對堆體pH值的影響不大。

2.3.3 堆肥過程中堆體C/N的動態(tài)變化C/N 是高效堆肥的關(guān)鍵因素之一，影響著堆肥的效率和有機(jī)肥的品質(zhì)。在堆肥過程中，原料中的碳含量和氮含量對堆肥微生物至關(guān)重要。堆肥過程中C/N的變化如圖3所示，堆肥初始物料C/N為22.90，總體均呈下降趨勢，易分解的含碳有機(jī)物被微生物分解吸收利用，并通過呼吸作用以CO2的形式排出，因而碳含量逐漸變低，氮素會被微生物利用以NH3的形式揮發(fā)，但是總氮的下降幅度低于總碳的下降幅度，導(dǎo)致總氮的相對含量增加，使碳氮質(zhì)量比下降，直至堆肥結(jié)束，CK、F2組的C/N從22.90下降到18.90、18.31，均達(dá)到了腐熟標(biāo)準(zhǔn)，接種F2復(fù)合菌劑堆肥的C/N低于CK組，說明接種菌劑更有利于降解有機(jī)質(zhì)。

2.3.4 堆肥過程中堆體GI的動態(tài)變化 種子發(fā)芽指數(shù)（GI）是堆肥腐熟度的重要指標(biāo)，通常當(dāng)GI達(dá)到80%以上標(biāo)志著堆肥完全腐熟。堆肥期間不同處理組的種子發(fā)芽指數(shù)的變化如圖4所示，隨著堆肥反應(yīng)的進(jìn)行，種子發(fā)芽指數(shù)均呈逐漸升高的趨勢。堆肥初始2個試驗組的種子發(fā)芽指數(shù)均低于40%，表明堆體中含有許多不利于植物生長的毒性物質(zhì)，如有機(jī)酸、多酚等，后期隨著堆肥反應(yīng)的進(jìn)行，溫度持續(xù)升高，有毒有害物質(zhì)逐漸被分解，逐漸減弱對植物生長的抑制作用，種子發(fā)芽指數(shù)逐漸提升，隨著堆體溫度下降，堆體中不再有劇烈的生物活動，堆肥達(dá)到穩(wěn)定的腐熟狀態(tài)，添加自制復(fù)合菌劑的F2組在第25 天達(dá)到完全腐熟，而CK組在第31 天才達(dá)到完全腐熟，直至反應(yīng)結(jié)束，CK、F2組GI值分別為89.44%、103.17%。表明添加自制復(fù)合菌劑加快了底物的代謝，促進(jìn)了堆體的腐熟。

3 討論與結(jié)論

添加菌劑是廣為使用的加快好氧堆肥腐殖化進(jìn)程的一種方式，國內(nèi)外學(xué)者對復(fù)合菌劑的研發(fā)開展了大量研究工作。大部分學(xué)者采用有機(jī)質(zhì)降解圈或者產(chǎn)酶能力篩選出需要的菌株[15-18]，并測定菌株間的拮抗關(guān)系，最終構(gòu)建復(fù)合菌劑。如張丹等[18]基于環(huán)境微生物資源庫，根據(jù)菌株產(chǎn)酶功能信息定向挑選出高產(chǎn)酶菌株，測定菌株間拮抗關(guān)系，針對易腐垃圾成分構(gòu)建了一組復(fù)合菌劑。

筆者根據(jù)廚余垃圾有機(jī)物組成定向挑選了10株微生物菌株，通過測定菌株的產(chǎn)酶的能力，釀酒酵母產(chǎn)淀粉酶的能力最高，地衣芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶的能力最高，米曲霉產(chǎn)纖維素酶的能力最高，枯草芽孢桿菌產(chǎn)脂肪酶能力最高。并測定菌株間拮抗試驗發(fā)現(xiàn)短芽孢桿菌屬與地衣芽孢桿菌具有拮抗作用，其他無拮抗作用。從中挑選出高酶活微生物5株，根據(jù)廚余垃圾有機(jī)質(zhì)比例調(diào)整添加微生物菌懸液體積比例，混合發(fā)酵組成4組復(fù)合菌劑，測定產(chǎn)酶能力后發(fā)現(xiàn)由鹽居固氮菌、綠色木霉、地衣芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌、米曲霉組合的F2復(fù)合菌劑產(chǎn)酶能力較高。

微生物菌劑可以通過影響好氧堆肥過程中的基本理化參數(shù)及微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，進(jìn)而影響堆肥腐殖化進(jìn)程和堆肥產(chǎn)品品質(zhì)[34-35]。胡亞東等[36]在餐廚垃圾好氧堆肥中對比了不添加菌劑和分別添加商品菌劑（WD）、課題組自制復(fù)合菌劑（TB）、WD+TB復(fù)合微生物菌劑的效果，發(fā)現(xiàn)添加菌劑的處理組升溫快，有機(jī)質(zhì)降解速率加快，堆體提前達(dá)到腐熟，尤其是添加WD+TB復(fù)合微生物菌劑的處理組堆肥腐熟效果最好，表明添加菌劑可以有效提升餐廚垃圾好氧生物處理效果，顯著提高堆肥效率。為了驗證F2復(fù)合菌劑對好氧堆肥腐殖化進(jìn)程的影響，筆者將此復(fù)合菌劑應(yīng)用于廚余垃圾好氧堆肥中，研究結(jié)果表明添加復(fù)合菌劑F2組最高溫達(dá)到67℃，高溫期持續(xù)14 d，C/N為18.31，pH值為9.08，種子發(fā)芽指數(shù)為103.17%，相較于CK組堆肥效果更好，可使堆肥高溫期延長4 d，堆肥提前6 d達(dá)到完全腐熟，這與前者研究結(jié)果一致。

綜上所述，基于微生物產(chǎn)酶功能信息針對降解成分定向精準(zhǔn)挑選功能菌株是一種快速高效的復(fù)合菌劑構(gòu)建方法。此方法可以推廣至其他領(lǐng)域，如改良土壤菌劑的構(gòu)建、污染物降解復(fù)合菌系的構(gòu)建等。

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（責(zé)任編輯：高國賦）