?姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識(shí)別研究

摘 要：為了建立姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜，以來(lái)自四川、云南和廣西的15個(gè)批次姜黃飲片為原料制備姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉，通過(guò)優(yōu)化樣品提取工藝和色譜條件，對(duì)姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要成分進(jìn)行HPLC分析和化學(xué)模式識(shí)別分析。結(jié)果表明：15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC指紋圖譜共標(biāo)定了13個(gè)共有峰，確認(rèn)了11、12和13號(hào)峰分別為雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素和姜黃素；通過(guò)主成分分析篩選出了2個(gè)差異性成分（3號(hào)峰和4號(hào)峰），但目前還不能確定其所代表的物質(zhì)；15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相似度評(píng)價(jià)結(jié)果均大于0.9，整體可以聚為2大類，其中S5、S11和S14聚為一類，其余批次聚為一類。該HPLC指紋圖譜方法呈現(xiàn)良好的精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性，可為姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑及中藥配方顆粒產(chǎn)品質(zhì)量控制提供參考和幫助。

關(guān)鍵詞：姜黃；標(biāo)準(zhǔn)湯劑；HPLC；指紋圖譜；化學(xué)模式識(shí)別分析

中圖分類號(hào)：R282.5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）00-0081-06

Abstract： To establish the HPLC fingerprint of turmeric （Curcuma longa L.） standard decoction for its quality control， turmeric decoction pieces processed with 15 batches of Curcuma longa L. raw meterial from Sichuan， Yunnan and Guangxi were prepared as freeze-dried powder in laboratory for later extraction. Subsequently， the extraction process and chromatographic conditions were optimized. The obtained standard turmeric decoction samples were performed the principle component analysis by HPLC and chemical pattern recognition. The results showed that a total of common 13 peaks in the HPLC fingerprints of the 15 batches of turmeric standard decoction samples were marked; peaks 11， 12 and 13 were identified as bisdemethoxycurcumin， demethoxycurcumin and curcumin; two different components （peak 3 and peak 4） were screened out by the principal component analysis， but the substances they represented were still uncertain. The similarities of the 15 batches of turmeric standard decoction were evaluated greater than 0.9， and they could be divided into two categories， among which S5， S11 and S14 clustered into one category， and the remaining batches clustered into the other category. This HPLC fingerprinting method presents good precision， reproducibility and stability， which can provide reference and help for the quality control of turmeric standard decoction and traditional Chinese medicine formula granule products.

Key words：turmeric （Curcuma longa L.）; standard decoction; HPLC; fingerprint; chemical pattern recognition analysis

姜黃（Curcuma longa L.）是姜科姜黃屬多年生草本植物，具有破血行氣，通經(jīng)止痛功效[1]，臨床上用于治療經(jīng)行不暢、頸椎病和肩周炎的肩臂酸痛、慢性膽囊炎和膽石癥等疾病。姜黃主要含揮發(fā)油類和姜黃素類成分[2]，其中姜黃素具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、抗糖尿病等藥理作用[3]。標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為中藥飲片與中藥配方顆粒的連接橋梁，用于衡量中藥配方顆粒與其對(duì)應(yīng)的單味中藥飲片臨床湯劑藥效物質(zhì)是否基本一致[4]。中藥湯劑和顆粒劑都不能通過(guò)其形態(tài)學(xué)特征對(duì)其質(zhì)量進(jìn)行控制，因而利用HPLC指紋圖譜技術(shù)對(duì)中藥湯劑進(jìn)行質(zhì)量控制已成趨勢(shì)[5]。研究以姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑為材料，擬通過(guò)HPLC指紋圖譜的構(gòu)建和化學(xué)模式識(shí)別分析，為姜黃湯劑與配方顆粒等相關(guān)產(chǎn)品的檢測(cè)提供參考和幫助。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 供試姜黃樣品 姜黃原藥材分別來(lái)自四川、云南和廣西3地，產(chǎn)地信息見(jiàn)表1。參考《中華人民共和國(guó)藥典》2020年版姜黃項(xiàng)下炮制方法將原材料制成飲片，產(chǎn)品批號(hào)為T210801～T210815，生產(chǎn)日期均為2021年8月7日，由長(zhǎng)沙新林制藥有限公司于2021年8月8日收錄入庫(kù)。

1.1.2 主要試劑 雙去甲氧基姜黃素（批號(hào)112004-201501，純度95.0%），去甲氧基姜黃素（批號(hào)112003-201501，純度98.5%），姜黃素對(duì)照品（批號(hào)110823-201706，純度98.7%），姜黃對(duì)照藥材（批號(hào)：121188-201605），均采購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究所。乙腈、甲醇為色譜純，磷酸為分析純。試驗(yàn)用水為怡寶礦泉水。

1.1.3 主要儀器設(shè)備 Thermo Scientific Vanquish Core 高效液相色譜儀、循環(huán)水式多用真空泵（天津市心雨儀器有限公司），電子萬(wàn)用爐（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲波儀器有限公司），電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司），ME204E102型電子天平（梅特勒–托利多儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉的制備 參照《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求》（征求意見(jiàn)稿）制備15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑，具體步驟如下：稱取姜黃飲片100 g，加水煎煮2次，第1次加入10倍水量，浸泡30 min，武火煮沸后改文火煎煮30 min，過(guò)濾；第2次加入8倍水量，武火煮沸后改文火煎煮20 min，過(guò)濾，合并2次濾液，減壓真空濃縮至約200 mL，真空冷凍干燥，即得姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉[6]。

1.2.2 色譜條件優(yōu)化 采用島津Shim-pack GIST C18色譜柱 （250 mm×4.6 mm，5 μm），考察了不同流動(dòng)相（0.1%甲酸–乙腈、0.1%磷酸–乙腈、水–乙腈、0.1%磷酸–甲醇等為流動(dòng)相系統(tǒng)，0.1%磷酸–乙腈）、不同洗脫梯度、不同流速（0.8、1.0、1.2 mL/min）、不同檢測(cè)波長(zhǎng)（254、290、310 nm）、不同柱溫（25、30、35℃）和不同進(jìn)樣量（5、10、20 μL）對(duì)圖譜分離效果的影響，進(jìn)而確定最佳的色譜條件。

1.2.3 供試品溶液制備方法優(yōu)化 考察了樣品提取方法（超聲提取、回流提?。⒉煌崛∪軇状?、乙醇、70%甲醇、70%乙醇）、不同提取時(shí)間（20、30、40 min）、不同樣品量（0.2、0.4、0.6 g）和不同溶劑量（10、20、50 mL）對(duì)提取效果的影響，根據(jù)最終的色譜峰形確定最佳的供試品溶液制備方法。

1.2.4 對(duì)照品溶液制備 精密稱取雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素對(duì)照品適量，加入甲醇溶解，分別制成58.35、37.75、36.99 μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.5 對(duì)照藥材溶液制備 取姜黃對(duì)照藥材0.5 g，加水25 mL煎煮30 min，蒸干水分，精密加入70%乙醇溶液20 mL，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇溶液補(bǔ)充損失重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得對(duì)照藥材溶液。

1.2.6 方法學(xué)驗(yàn)證試驗(yàn) （1）專屬性試驗(yàn)：取供試品溶液、姜黃對(duì)照藥材溶液及雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素對(duì)照品溶液與空白對(duì)照，按最佳色譜條件分別進(jìn)樣分析，對(duì)比圖譜結(jié)果以驗(yàn)證該方法的專屬性。（2）精密度試驗(yàn)：取供試品溶液1份，按最佳色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，對(duì)比圖譜結(jié)果以驗(yàn)證儀器的精密度。（3）重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次的姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑，按最佳制備方法平行制備6份供試品溶液按最佳色譜條件進(jìn)樣，對(duì)比圖譜結(jié)果以驗(yàn)證該方法的重復(fù)性。（4）穩(wěn)定性試驗(yàn)：取姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品1份，分別在配制后0、2、4、8、12、24 h按最佳色譜條件進(jìn)樣，對(duì)比圖譜結(jié)果以驗(yàn)證所提取樣品的穩(wěn)定性。

1.2.7 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià) 按最佳制備方法制備15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑供試品溶液，按最佳色譜條件進(jìn)行分析，得到15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC圖譜，將圖譜導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)”（2012版）生成共有峰對(duì)照?qǐng)D譜（R），并計(jì)算15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照指紋圖譜的相似度結(jié)果。

1.2.8 數(shù)據(jù)分析 （1）聚類分析：將15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的13個(gè)共有峰的原始峰面積導(dǎo)入Origin 2019b軟件，通過(guò)平均聯(lián)接（組間）方法，以平方歐式距離為測(cè)量度進(jìn)行聚類分析。（2）主成分分析（PCA）：通過(guò)SPSS 25.0軟件對(duì)15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑進(jìn)行主成分分析，計(jì)算主成分特征值與方差貢獻(xiàn)值。（3）正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA）：將共有峰的峰面積導(dǎo)入SIMCA 13.0軟件生成OPLS-DA得分圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 最佳色譜條件

試驗(yàn)結(jié)果顯示，以0.1%磷酸（B）–乙腈（A）為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，圖譜的分離度最佳，峰形良好。通過(guò)洗脫梯度的不斷調(diào)整，最終確定的洗脫梯度為：0～25 min，90%～55% B；25～30 min，55% B；30～50 min，55%～35% B；50～55 min，35%～55% B；55～60 min，55%～90% B。當(dāng)流速大于0.8 mL/min，組分峰過(guò)于緊湊，分離度不佳。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)為310 nm時(shí)，圖譜信息最為豐富。當(dāng)柱溫為30℃時(shí)，出現(xiàn)了2峰融合的情況；當(dāng)柱溫為35℃時(shí)，出現(xiàn)了組分峰分叉的情況；因而最終將柱溫確定為25℃，該溫度下峰形良好。當(dāng)進(jìn)樣量為5 μL時(shí)，因樣品較少，易出現(xiàn)誤差；當(dāng)進(jìn)樣量為20 μL時(shí)，出現(xiàn)了峰形分叉的現(xiàn)象，故還是選取常規(guī)進(jìn)樣量10 μL進(jìn)行分析檢測(cè)。

綜上所述，最終確定的色譜條件如下：采用島津Shim-pack GIST C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈為流動(dòng)相A、0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B進(jìn)行梯度洗脫（0～25 min，90%～55% B；25～30 min，55% B；30～50 min，55%～35% B；50～55 min，35%～55% B；55～60 min，55%～90% B），流速0.8 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)310 nm，柱溫25℃，進(jìn)樣量10 μL。

2.2 最佳供試品制備方法

試驗(yàn)結(jié)果顯示，超聲提取方法的安全系數(shù)較高，以70%乙醇為提取溶劑效果最好且毒性最低，最佳提取時(shí)間為30 min；以不同的溶劑量（10、20、50 mL）和樣品量（0.2、0.4、0.6 g）分別進(jìn)行提取，各組合的峰形基本一致，成分含量增減有規(guī)律。最終確定供試品溶液制備方法如下：精密稱取0.2 g姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑凍干粉置具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇溶液20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用70%乙醇溶液補(bǔ)充損失重量，搖勻，過(guò)濾，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

2.3.1 專屬性試驗(yàn) 如圖1所示，姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與姜黃對(duì)照藥材的出峰時(shí)間基本一致，通過(guò)外標(biāo)法得到雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素在標(biāo)準(zhǔn)湯劑中的出峰時(shí)間。

2.3.2 精密度試驗(yàn) 以姜黃素（L4）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.08%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.29%，表明該儀器有良好的精密度。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 以姜黃素（L4）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.07%，相對(duì)峰面積的RSD均小于3.08%，表明該方法有良好的重復(fù)性。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以姜黃素（L4）為參照峰，計(jì)算各共有峰相對(duì)保留時(shí)間的RSD均小于0.08%，相對(duì)峰面積的RSD均小于5.22%，表明樣品溶液在24 h內(nèi)有良好的穩(wěn)定性。

2.4 指紋圖譜的建立及相似度評(píng)價(jià)

供試的15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的HPLC圖譜如圖2所示，各批次樣品的各種物質(zhì)出峰時(shí)間基本相同，呈現(xiàn)出良好的一致性。根據(jù)共有峰對(duì)照?qǐng)D譜（圖3），一共標(biāo)定了13個(gè)共有峰，指認(rèn)了3個(gè)成分，11號(hào)峰為雙去甲氧基姜黃素、12號(hào)峰為去甲氧基姜黃素、13號(hào)峰為姜黃素。以姜黃素（13號(hào)峰）為參照峰，得到其余各峰的相對(duì)保留時(shí)間如下：峰1為0.301，峰2為0.377，峰3為0.403，峰4為0.420，峰5為0.494，峰6為0.511，峰7為0.596，峰8為0.605，峰9為0.634，峰10為0.931，峰11為0.958，峰12為0.979，峰13為1.000。計(jì)算得到15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對(duì)照藥劑的指紋圖譜相似度均大于0.9，表現(xiàn)出標(biāo)準(zhǔn)湯劑的均一性，具體見(jiàn)表2。

2.5 供試15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的聚類分析

如圖4A所示，在分類距離為15時(shí)，供試15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚為2大類，其中S1～S4、S6～S10、S12、S13、S15歸為一類，S5、S11、S14歸為另一類。

2.6 姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主成分分析（PCA）

如表3所示，3個(gè)主成分累計(jì)方差貢獻(xiàn)值達(dá)0.905，可以代表樣品大部分信息。由表4可知，2、3、5、9、11號(hào)峰對(duì)主成分1的貢獻(xiàn)值最大，去甲氧基姜黃素（12號(hào)峰）、姜黃素（13號(hào)峰）對(duì)主成分2貢獻(xiàn)值最大，1和8號(hào)峰對(duì)主成分3的貢獻(xiàn)值最大。采用SIMCA 13.0軟件繪制主成分分析得分圖，如圖4B所示，結(jié)果與聚類分析一致。

2.7 姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）

由圖4C得到R2X（cum）=0.876，R2Y（cum）= 0.762，Q2（cum）=0.653。如圖4D顯示，3和4號(hào)峰這2個(gè)成分的VIP值大于1，說(shuō)明這2個(gè)組分為主要標(biāo)志性成分。

3 討 論

15批姜黃中，S1～S7來(lái)自云南省瀘水市，S8～S12來(lái)自廣西省玉州區(qū)，S13～S15來(lái)自四川省什邡市，試驗(yàn)從這15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC圖譜中共標(biāo)定了13個(gè)共有峰，并確認(rèn)了其中的3個(gè)成分為雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素。鄧哲等[7]從13批姜黃飲片標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC圖譜中確定了16個(gè)共有峰，也確認(rèn)了其中的雙去甲氧基姜黃素、去甲氧基姜黃素、姜黃素這3個(gè)成分。由15批姜黃標(biāo)

準(zhǔn)湯劑HPLC圖譜的出峰情況以及相似度評(píng)價(jià)結(jié)果可知，各批次姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑的圖譜出峰情況一致性很高，S4樣品的圖譜與S14樣品的圖譜相似度最低，但也達(dá)到了0.936，總體相似度在0.936～1.000之間。相似度評(píng)價(jià)結(jié)果越接近1，表示批次之間一致性評(píng)價(jià)效果越好。但是化學(xué)模式識(shí)別分析結(jié)果顯示，15批姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑聚為2大類，其中S5、S11和S14聚為一類，其余批次聚為一類，聚類結(jié)果與產(chǎn)地信息有較大差別，這可能與姜黃的其他特性有關(guān)。例如，黃玉潔[8]在研究川渝麥冬資源時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同產(chǎn)地麥冬間的聚類與其地理來(lái)源無(wú)關(guān)，但與其形態(tài)特征相關(guān)聯(lián)。HPLC圖譜中，3號(hào)峰和4號(hào)峰為姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑間的差異性成分。查閱大量文獻(xiàn)后發(fā)現(xiàn)，姜黃的研究大多數(shù)集中在姜黃素類化合物，其藥理活性被大量挖掘，由于對(duì)于其他成分的研究較少，目前還不能確定3號(hào)峰和4號(hào)峰所代表的物質(zhì)。同時(shí)，由于姜黃素難溶于水的特性，制備標(biāo)準(zhǔn)湯劑大大降低了姜黃有效成分的含量。因此，使用姜黃湯劑制備的姜黃配方顆粒姜黃素含量也相對(duì)較少，其效果也難免讓人產(chǎn)生質(zhì)疑。后續(xù)考慮使用液質(zhì)聯(lián)用對(duì)3號(hào)峰和4號(hào)峰進(jìn)行成分分析，確認(rèn)其分子量，查詢這2種成分是否為藥用成分，如若結(jié)果可觀，或許能夠?qū)S標(biāo)準(zhǔn)湯劑的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供幫助。

如今中藥材市場(chǎng)仍然存在摻假、以次充好、種質(zhì)資源混亂的現(xiàn)象，為了更好地維護(hù)中藥材市場(chǎng)秩序，建立規(guī)范的中藥材品質(zhì)檢測(cè)方法乃大勢(shì)所趨。通過(guò)查閱國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，目前針對(duì)姜黃化學(xué)成分、藥理作用[9-10]的文獻(xiàn)報(bào)道居多，質(zhì)量評(píng)價(jià)也主要集中在姜黃原藥材和飲片方面，以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為研究對(duì)象的相對(duì)較少。該研究建立的姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC指紋圖譜方法呈現(xiàn)良好的精密度、重復(fù)性與穩(wěn)定性，可為姜黃標(biāo)準(zhǔn)湯劑與配方顆粒等相關(guān)產(chǎn)品檢測(cè)提供參考和幫助。

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（責(zé)任編輯：成 平）