凝結(jié)芽孢桿菌液體分批發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)方程構(gòu)建?

摘 要：采用20 L發(fā)酵罐平臺(tái)對(duì)飼用凝結(jié)芽孢桿菌W-02菌株進(jìn)行分批發(fā)酵，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)發(fā)酵液的溶氧含量、吸光度、pH值、活菌數(shù)和可溶性總糖含量，在此基礎(chǔ)上采用Logistic方程和Luedeking-Piret方程分別擬合了菌體生長(zhǎng)和可溶性總糖消耗的動(dòng)力學(xué)方程，獲得了該菌株分批發(fā)酵的動(dòng)力學(xué)方程模型和參數(shù)。結(jié)果表明：菌體生長(zhǎng)模型為；可溶性總糖消耗模型為；2個(gè)模型計(jì)算的模擬值與驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)值擬合度均較好，平均相對(duì)誤差均小于10%。該結(jié)果為凝結(jié)芽孢桿菌實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)化監(jiān)測(cè)和實(shí)時(shí)控制提供了依據(jù)。

關(guān)鍵詞：凝結(jié)芽孢桿菌；液體分批發(fā)酵；菌體數(shù)；可溶性總糖；動(dòng)力學(xué)方程

中圖分類號(hào)：TQ920.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）03-0001-05

Abstract： Bacillus coagulans strain W-02 was fermented in batches in 20 L fermentor. During the fermentation process， the dissolved oxygen， absorbance， pH value， viable bacterium count， and soluble total sugar content were measured in real time. Thereafter， the Logistic equation and Luedeking-Piret equation were employed to respectively fit the dynamics of bacterium growth and soluble total sugar consumption. The kinetic models and parameters describing the batch fermentation process were obtained. The results showed that the bacterial growth model was ， and the model of soluble total sugar consumption was .The analogue values calculated from the obtained two kinetic equations were highly in fit with the experimental values， with average relative errors of less than 10%. The results provide a basis for automatic monitoring and real-time control of fermentation process in actual production of Bacillus coagulans.

Key words：Bacillus coagulans; liquid fermentation in batches; viable bacterium count; soluble total sugar; kinetic equations

微生態(tài)制劑具有維持動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡、刺激免疫應(yīng)答、提高動(dòng)物消化吸收能力等功效，是當(dāng)前延緩致病菌耐藥性、降低化學(xué)農(nóng)藥殘留的一種抗生素理想替代品[1-3]。凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）是乳酸菌的一種，具有降低腸道pH值和黏膜通透性、調(diào)節(jié)腸道菌群平衡、提高腸道黏膜屏障保護(hù)作用和免疫力等特性[4-5]；同時(shí)，它也是芽孢桿菌的一種，具有抗逆性強(qiáng)、耐高溫、易貯存等獨(dú)特耐受特性[6]。經(jīng)過(guò)多年的研究，學(xué)者們對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌的益生特性和安全性已有較全面的認(rèn)識(shí)，而且該菌也被農(nóng)業(yè)農(nóng)村部列入可直接飼用的畜禽飼料添加劑品種名錄[7]。當(dāng)前，對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵的研究主要集中在菌株篩選[7]、芽孢形成條件[8-9]、培養(yǎng)基優(yōu)化[10-11]、發(fā)酵產(chǎn)物優(yōu)化[12]、高密度發(fā)酵[13-14]、補(bǔ)料工藝[15]等方面，但對(duì)其發(fā)酵動(dòng)力學(xué)的研究還未見(jiàn)報(bào)道。課題組前期篩選到一株凝結(jié)芽孢桿菌W-02菌株，在優(yōu)化培養(yǎng)基和發(fā)酵條件的基礎(chǔ)上，對(duì)該菌株液體分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和可溶性總糖消耗的動(dòng)力學(xué)變化過(guò)程進(jìn)行了研究，進(jìn)一步擬合和構(gòu)建了菌體生長(zhǎng)、可溶性總糖消耗的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)方程，為凝結(jié)芽孢桿菌實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)酵過(guò)程自動(dòng)化監(jiān)測(cè)和實(shí)時(shí)控制提供了依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試凝結(jié)芽孢桿菌（Bacillus coagulans）為課題組前期篩選到的W-02菌株，由筆者實(shí)驗(yàn)室分離保存。

主要設(shè)備有WJ-250B生化培養(yǎng)箱、ZHWY-200B恒溫培養(yǎng)振蕩器、PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)、S22型分光光度計(jì)、30JS-2002發(fā)酵罐等。

供試培養(yǎng)基有斜面培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂20 g/L，pH值7.0～7.2）、種子培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L，pH值7.0～7.2）、發(fā)酵培養(yǎng)基（豆粉13.5 g/L、淀粉10.6 g/L、魚粉6.7 g/L、MnSO4·H2O 0.169 g/L、K2HPO4 2.72 g/L、MgSO4 ·7H2O 0.74 g/L、NaNO3 0.34 g/L，初始pH值7.0）和檢測(cè)培養(yǎng)基[胰蛋白胨20 g/L、葡萄糖20 g/L、酵母膏10 g/L、瓊脂18 g/L、鹽溶液10 mL/L（鹽溶液中含有MnSO4·H2O 1 mg/mL、MgSO4 ·7H2O 5 mg/mL、NaCl 5 mg/mL、CaCO3 2 mg/mL）]。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 種子液培養(yǎng)方法 （1）菌種活化：將凝結(jié)芽孢桿菌保藏菌種活化后轉(zhuǎn)接到斜面培養(yǎng)基，35℃培養(yǎng)24 h，備用。（2）種子液制備：取3環(huán)活化菌種，接入裝有100 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，35℃、200 r/min培養(yǎng)18 h，OD600值介于0.5～0.7。

1.2.2 發(fā)酵罐發(fā)酵參數(shù) 發(fā)酵罐體積20 L 、裝料系數(shù)50%、培養(yǎng)基初始pH值6.5、接種量3%、發(fā)酵溫度35℃、轉(zhuǎn)速300 r/min、通氣比1.33∶1、溶氧33.6%、罐壓（0.04～0.06）MPa。

1.2.3 發(fā)酵液吸光度檢測(cè)方法 取適量發(fā)酵培養(yǎng)基（未進(jìn)行發(fā)酵）到玻璃比色皿中，設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為600 nm，檢測(cè)吸光度同時(shí)進(jìn)行調(diào)零，然后分別于發(fā)酵0、6、12、18、24、30、36、42、48 h時(shí)取樣檢測(cè)發(fā)酵液吸光度，分析發(fā)酵液吸光度在發(fā)酵過(guò)程中的變化及其對(duì)菌體數(shù)和培養(yǎng)基可溶性總糖的影響。1.2.4 發(fā)酵液溶氧、pH實(shí)時(shí)在線檢測(cè) 分別于發(fā)酵0、6、12、18、24、30、36、42、48 h記錄發(fā)酵液溶氧含量及pH值，分析發(fā)酵液溶氧、pH值在發(fā)酵過(guò)程中的變化及其對(duì)菌體數(shù)和培養(yǎng)基可溶性總糖的影響。

1.2.5 菌體數(shù)檢測(cè)方法 取適量發(fā)酵液，用無(wú)菌水進(jìn)行梯度稀釋，分別取1 mL各稀釋梯度的發(fā)酵液置于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，倒入冷卻至45℃的檢測(cè)培養(yǎng)基，搖勻，充分凝固后置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)36 h，計(jì)數(shù)，每種濃度重復(fù)3次。

1.2.6 發(fā)酵液可溶性總糖含量的測(cè)定 按照黃翊鵬等[16]的方法測(cè)定發(fā)酵液中的可溶性總糖含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液吸光度和溶氧含量的變化

由圖1可知，發(fā)酵0～30 h時(shí)，發(fā)酵液吸光度處于不斷上升階段，溶氧處于不斷下降階段，表明凝結(jié)芽孢桿菌在此階段分裂繁殖活躍加劇，菌體數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)，吸光度持續(xù)增加，另一方面，菌體數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)的同時(shí)，需要吸收大量的可溶性糖類等有機(jī)和無(wú)機(jī)成分進(jìn)行新陳代謝，在這個(gè)過(guò)程中通過(guò)有氧呼吸供給自身能量，同時(shí)不斷消耗培養(yǎng)基中的氧氣，導(dǎo)致培養(yǎng)基溶氧含量下降。發(fā)酵30 h后，微生物處于穩(wěn)定期衰亡期，前期吸光度稍降，溶氧下降，36 h后部分菌體發(fā)生自溶，菌體數(shù)有所下降，吸光度有所降低，而培養(yǎng)基溶氧則有所回升。

2.2 凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液pH值的變化

由圖2可知，凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中pH值持續(xù)下降，發(fā)酵結(jié)束時(shí)發(fā)酵液pH值下降到5.3，這是因?yàn)槟Y(jié)芽孢桿菌在分裂增殖過(guò)程中不斷利用培養(yǎng)基中的可溶性糖類，菌體自身合成能量的同時(shí)代謝產(chǎn)生小分子乳酸等有機(jī)酸，致使培養(yǎng)基pH值持續(xù)降低。

2.3 發(fā)酵過(guò)程中活菌數(shù)和發(fā)酵液可溶性總糖含量的變化

由圖3可知，凝結(jié)芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線為S形，明顯表現(xiàn)為4個(gè)時(shí)期；其中，0～6 h為延緩期，菌體數(shù)較少；6～30 h為對(duì)數(shù)期，菌體數(shù)呈指數(shù)增長(zhǎng)；

33～45 h為穩(wěn)定期，菌體數(shù)基本趨于穩(wěn)定，45 h之后為衰亡期。可溶性總糖消耗曲線則呈反S形變化，可溶性總糖消耗程度與菌體生長(zhǎng)相適應(yīng)，發(fā)酵0～6 h菌體耗糖較少，發(fā)酵6 h開(kāi)始進(jìn)入快速耗糖期，發(fā)酵33 h后耗糖減慢，至發(fā)酵結(jié)束，可溶性總糖含量小于0.5 g/L。

2.4 菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程及曲線擬合

描述微生物菌體生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)的模型很多，其中Monod及Logistic方程最為常用[17]。Monod方程是應(yīng)用最普遍的微生物生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)方程，是一種理論化的簡(jiǎn)單模型，未考慮菌體濃度增加對(duì)菌體生長(zhǎng)的抑制作用，主要用來(lái)描述非抑制性單一底物限制情形下的細(xì)胞生長(zhǎng)，這種理想情況是極少的。

式中：μmax為凝結(jié)芽孢桿菌菌體最大比生長(zhǎng)速率；X為菌體數(shù)；Ks為半飽和常數(shù)；S為限制性底物濃度（g/L）。

Verhulst-Pear提出的Logistic方程是一個(gè)典型的S形曲線[17-18]，能較好地反映分批發(fā)酵過(guò)程中因菌體濃度增加對(duì)自身生長(zhǎng)存在的抑制作用，從而較好地?cái)M合分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)規(guī)律。

式中：X為菌體濃度；μmax為最大比生長(zhǎng)速率；Xmax為菌體生長(zhǎng)上限。

發(fā)酵開(kāi)始菌體濃度很低，即X比Xmax小得多，X/Xmax項(xiàng)可忽略不計(jì)，方程表示菌體呈對(duì)數(shù)生長(zhǎng)；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)菌體生長(zhǎng)處于穩(wěn)定期，此時(shí)X近似于Xmax，方程表示菌體生長(zhǎng)停止。凝結(jié)芽孢桿菌在分批發(fā)酵過(guò)程中，隨著培養(yǎng)的進(jìn)行，菌體濃度增加對(duì)自身生長(zhǎng)也會(huì)產(chǎn)生抑制作用，此時(shí)細(xì)胞生長(zhǎng)情況可用Logistic方程較好地進(jìn)行描述。對(duì)公式（2）進(jìn)行積分得公式（3）。

公式（3）可同時(shí)表達(dá)菌體在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期的生長(zhǎng)狀態(tài)，μmax可從試驗(yàn)數(shù)據(jù)獲得；以對(duì)時(shí)間t進(jìn)行線性擬合得一直線，

其斜率即為μmax，截距y等于。

因此，最初菌體濃度X0可從公式中求出。經(jīng)線性擬合得到μmax=0.252 4，截距=－4.824，X0=0.470 3，線性擬合見(jiàn)圖4。

公式（3）經(jīng)轉(zhuǎn)換可得公式（4），根據(jù)公式（4）將模型的計(jì)算模擬值與分批發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)值進(jìn)行比較（圖5），模擬值所注誤差線的誤差量為5%，表明模型值與試驗(yàn)數(shù)據(jù)擬合很好。

2.5 可溶性總糖消耗動(dòng)力學(xué)方程和曲線擬合

凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中，培養(yǎng)基中可溶性總糖消耗主要用于菌體生長(zhǎng)（X）、菌體維持代謝（m）、乳酸合成（P）3個(gè)方面，乳酸產(chǎn)物主要在厭氧條件下生成，有氧發(fā)酵過(guò)程中，用于乳酸合成的一部分底物可忽略不計(jì)，因此，可溶性總糖消耗速率可用類似于Luedeking-Piret方程的公式（5）來(lái)表示[19-20]。

由此得到凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程可溶性總糖消耗的動(dòng)力學(xué)方程曲線為公式（10）。

根據(jù)公式（10）將模型計(jì)算的模擬值與發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn)的試驗(yàn)值進(jìn)行比較（見(jiàn)圖7），模擬值所注誤差線的誤差量為10%，表明模擬值與試驗(yàn)值擬合較好。

3 結(jié)論與討論

試驗(yàn)對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液溶氧、吸光度、pH值、活菌數(shù)和可溶性總糖等參數(shù)指標(biāo)進(jìn)行了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，在此基礎(chǔ)上對(duì)發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和可溶性總糖消耗的動(dòng)力學(xué)變化進(jìn)行了研究，采用Logistic方程和Luedeking-Piret方程分別建立了凝結(jié)芽孢桿菌（W-02）分批發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)和可溶性總糖消耗隨時(shí)間變化的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型。通過(guò)曲線擬合、模型參數(shù)計(jì)算和試驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)2個(gè)模型的模擬值與試驗(yàn)值的平均相對(duì)誤差均小于10%，表明2個(gè)模型均能較好預(yù)測(cè)實(shí)際發(fā)酵過(guò)程，該動(dòng)力學(xué)方程的擬合構(gòu)建對(duì)凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵過(guò)程監(jiān)測(cè)和自動(dòng)發(fā)酵工藝優(yōu)化具有一定的借鑒和參考意義。

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（責(zé)任編輯：成 平）