脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞泡沫化機(jī)制的研究

摘要 目的：探究脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2（LP-PLA2）在氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）作用下的血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）泡沫化中的作用及其相關(guān)分子途徑。方法：采用組織塊貼壁法分離小鼠原代主動(dòng)脈VSMC，α-肌動(dòng)蛋白（α-SAM）標(biāo)記的免疫熒光染色進(jìn)行鑒定；采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將過(guò)表達(dá)LP-PLA2質(zhì)粒（oe-LP-PLA2）與陰性對(duì)照質(zhì)粒（oe-NC）轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）與蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達(dá)水平；采用ox-LDL和大胞飲抑制劑LY294002處理VSMC，并將細(xì)胞分為4組，正常培養(yǎng)的control組，ox-LDL處理的轉(zhuǎn)染oe-LP-PLA2細(xì)胞的ox-LDL＋oe-LP-PLA2組、ox-LDL＋oe-NC組、聯(lián)合使用ox-LDL和LY294002處理的轉(zhuǎn)染oe-LP-PLA2細(xì)胞的ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組。油紅O染色檢測(cè)各組VSMC中脂質(zhì)聚積水平，試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）和單核細(xì)胞趨化因子-1（MCP-1）的表達(dá)水平，DCFH-DA法檢測(cè)各組VSMC細(xì)胞中活性氧（ROS）含量，Western Blot檢測(cè)各組細(xì)胞中LP-PLA2和泡沫化信號(hào)通路中固醇?；D(zhuǎn)移酶1（ACATl）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（ERK1/2）和c-Jun氨基末端激酶（JNK）/應(yīng)激活化蛋白激酶（SAPK）蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果：成功分離了原代VSMC，且α-SAM標(biāo)記的陽(yáng)性細(xì)胞比率達(dá)95%以上；與control組比較，轉(zhuǎn)染oe-LP-PLA2質(zhì)粒后細(xì)胞中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.01）；與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細(xì)胞的油紅O染色陽(yáng)性面積、細(xì)胞中總膽固醇含量、細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、MCP-1的表達(dá)水平和細(xì)胞中活性氧含量均增加（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組油紅O染色陽(yáng)性面積、細(xì)胞中總膽固醇含量、細(xì)胞上清液中TNF-α、IL-6、MCP-1的表達(dá)水平和細(xì)胞中活性氧含量均增加（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中上述檢測(cè)指標(biāo)均降低（P＜0.05）；Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中LP-PLA2、ACATl、ERK1/2和JNK/SAPK蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組LP-PLA2、ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05），ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中除LP-PLA2升高外（P＜0.05），其他蛋白表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細(xì)胞中ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05）。結(jié)論：上調(diào)LP-PLA2表達(dá)可通過(guò)大胞飲機(jī)制促進(jìn)ox-LDL作用下的VSMC的泡沫化進(jìn)程，而這可能與ERK和JNK/SAPK通路的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。

關(guān)鍵詞 脂蛋白相關(guān)性磷脂酶；血管平滑肌細(xì)胞；泡沫細(xì)胞；氧化型低密度脂蛋白；大胞飲；小鼠；實(shí)驗(yàn)研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.15.012

動(dòng)脈粥樣硬化是導(dǎo)致包括冠狀動(dòng)脈阻塞在內(nèi)的多種心血管疾病的主要病因［1］。在動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程中，泡沫細(xì)胞在內(nèi)皮下的不斷形成與累積及其壞死所引發(fā)的炎癥反應(yīng)，加劇了斑塊的不穩(wěn)定性，從而誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈阻塞，導(dǎo)致急性心肌梗死等心血管疾病的發(fā)生［2］。既往研究表明，巨噬細(xì)胞是泡沫細(xì)胞的主要來(lái)源，但越來(lái)越多的數(shù)據(jù)表明，特定環(huán)境下發(fā)生表型改變的血管平滑細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）不僅具有巨噬細(xì)胞的特征，同時(shí)也能在細(xì)胞內(nèi)積聚膽固醇，且在中晚期的動(dòng)脈硬化中，VSMC是斑塊

中泡沫細(xì)胞和炎癥反應(yīng)的主要來(lái)源［3］。這提示在動(dòng)脈粥樣硬化中，VSMC同樣具有泡沫樣變的能力。盡管一些清道夫受體參與了泡沫細(xì)胞形成過(guò)程中的脂質(zhì)攝取，但導(dǎo)致VSMC發(fā)生泡沫化的具體機(jī)制尚未明確。脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2（lipoprotein-associated phospholipase A LP-PLA2）又稱(chēng)血小板活化因子乙酰水解酶，其主要來(lái)源于巨噬細(xì)胞、單核細(xì)胞、泡沫細(xì)胞等炎性細(xì)胞的分泌［4］。LP-PLA2可與低密度脂蛋白（LDL）結(jié)合，促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)與氧化應(yīng)激，并導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能破壞，加速斑塊的形成與發(fā)展［5］。然而，關(guān)于LP-PLA2是否參與VSMC泡沫樣變及其具體作用尚未明確。因此，本研究通過(guò)探討LP-PLA2在VSMC泡沫化中的作用，旨在進(jìn)一步揭示動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性4周齡C57BL/6小鼠6只，體質(zhì)量（16.0±1.5）g，購(gòu)自海南藥物研究所有限責(zé)任公司。大鼠抗小鼠α-SAM抗體（美國(guó)Abacm公司）；FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗（美國(guó)BD公司）；過(guò)表達(dá)LP-PLA2質(zhì)粒（oe-LP-PLA2）與陰性對(duì)照質(zhì)粒（oe-NC）（廣州銳博生物公司）；大胞飲抑制劑LY294002、氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）、DCFH-DA試劑盒、膽固醇檢測(cè)量試劑盒（美國(guó)Sigma公司）；Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（美國(guó)Applied Biosystems公司）；TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)Invitrogen公司）；Lipofectamine 2000試劑（美國(guó)Thermo公司）；二喹啉甲酸法（BCA）蛋白定量試劑盒、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和單核細(xì)胞趨化因子-1（monocyte chemoattractant protrin- MCP-1）表達(dá)的酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）試劑盒（江蘇碧云天生物技術(shù)公司）；大鼠抗LP-PLA2、固醇?；D(zhuǎn)移酶1（cholesterol acyltransferases ACATl）、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular-signal regulated kinase1/ ERK1/2）、c-Jun氨基末端激酶（c-Jun NH2-terminal kinase，JNK）/應(yīng)激活化蛋白激酶（stress activated protein kinase，SAPK）和β-actin抗體（美國(guó)Cell Signaling Technology公司）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的兔抗大鼠二抗（美國(guó)Jackson ImmunoResearch公司）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）引物設(shè)計(jì)與合成（上海生工生物工程有限公司）。細(xì)胞培養(yǎng)箱（MCO-175型，日本三洋公司）；紫外分光光度計(jì)（Du-640型，美國(guó)Beckman公司）；熒光顯微鏡（DM IL LED型，德國(guó)Lecia公司）。

1.2 小鼠原代主動(dòng)脈VSMC的培養(yǎng)和鑒定

參考文獻(xiàn)［6］方法分離培養(yǎng)小鼠原代主動(dòng)脈VSMC。解剖小鼠主動(dòng)脈，并除去外膜和內(nèi)皮組織，將血管中膜剪成1 mm×1 mm×1 mm大小，并置入培養(yǎng)瓶中使用含20%FBS和1%青鏈霉素-抗真菌劑的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)至5～7 d時(shí)組織塊邊緣可見(jiàn)有VSMC爬出，10 d時(shí)VSMC可融合生長(zhǎng)。使用含EDTA的0.25%胰蛋白酶進(jìn)行常規(guī)消化并傳代進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，取傳至3代以后的VSMC進(jìn)行后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。采用針對(duì)平滑肌的特異性抗體α-SAM進(jìn)行鑒定VSMC。取生長(zhǎng)良好的VSMC，常規(guī)消化后接種于載玻片上，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄原培養(yǎng)液，4%多聚甲醛溶液固定細(xì)胞，Triton X-100破膜，加入α-SAM抗體（1∶200），4 ℃下孵育過(guò)夜，次日加入FITC標(biāo)記的熒光二抗（1∶500），室溫下避光孵育1 h，加入DAPI試劑進(jìn)行染核，最后加入防熒光猝滅劑封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的VSMC，常規(guī)消化后，調(diào)整細(xì)胞密度，按2×105個(gè)/孔接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合至70%時(shí)，按轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000操作說(shuō)明書(shū)方法將oe-LP-PLA2質(zhì)粒及陰性對(duì)照質(zhì)粒oe-NC轉(zhuǎn)染入VSMC中。取轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，按處理方式的不同將VSMC分為4組：正常培養(yǎng)的control組，采用100 μg/mL ox-LDL處理的轉(zhuǎn)染oe-LP-PLA2的ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-NC組，聯(lián)合使用100 μg/mL ox-LDL與33μmol/L LY294002處理的轉(zhuǎn)染oe-LP-PLA2的x-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組。ox-LDL與LY294002的使用濃度參考文獻(xiàn)［7-8］。上述各組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)。

1.4 油紅O染色

取各組VSMC，棄原培養(yǎng)液，磷酸緩沖鹽溶液（PBS）充分洗滌細(xì)胞后采用4%多聚甲醛于室溫下固定30 min，PBS再次洗滌，加入油紅O工作液在室溫下進(jìn)行染色30 min，蒸餾水洗滌細(xì)胞，隨后在倒置顯微鏡下觀察，每組至少隨機(jī)選取5個(gè)低倍率視野進(jìn)行拍照。Image J軟件對(duì)細(xì)胞中的紅色脂滴面積進(jìn)行計(jì)算分析。

1.5 細(xì)胞內(nèi)總膽固醇的測(cè)定

取各組VSMC，按試劑盒操作說(shuō)明書(shū)方法采用異丙醇提取細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)成分，并使用耦合酶測(cè)定法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)總膽固醇（total cholesterol，TC）含量。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.6 ELISA檢測(cè)炎性因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量

取各組VSMC上清液，4 ℃下1 000 r/min離心10 min后，按照ELISA試劑盒使用說(shuō)明書(shū)方法檢測(cè)上清液中TNF-α、IL-6和MCP-1含量。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.7 DCFH-DA法檢測(cè)活性氧（ROS）水平

取各組VSMC，使用DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞中ROS含量。根據(jù)DCFH-DA試劑盒說(shuō)明書(shū)方法，加入含10 mmol/L的DCFH-DA工作液在37 ℃下避光孵育30 min后，PBS溶液充分洗滌細(xì)胞后，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光強(qiáng)度。

1.8 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中LP-PLA2 mRNA表達(dá)水平

用TRIzol試劑提取待測(cè)細(xì)胞中的總RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)方法進(jìn)行合成cDNA。使用Power SYBR Green PCR Master Mix試劑盒在StepOne系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR。LP-PLA2引物序列，正向引物：5′-CGGATTGATGAGATGCCTGA-3′，反向引物：5′-CTTGTTGGGCTTGCCAAACT-3′；β-actin-引物序列，正向引物：5′-TCCTGTGGCATCCACGAAACT- 反向引物：5′-GAAGCATTTGCGGTGGACGAT-3′。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2－△△Ct方法分析LP-PLA2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，并將其與對(duì)照組進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)細(xì)胞中泡沫化信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)

采用細(xì)胞裂解液在冰上裂解待測(cè)細(xì)胞，離心后收集總蛋白。用BCA蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度。將等量的蛋白樣品置于15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠中電泳分離，并轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上。膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉1 h，然后加入一抗：LP-PLA2（1∶500）、ACATl（1∶800）、ERK1/2（1∶800）、JNK/SAPK（1∶800）和β-actin（1∶1 000），4 ℃下孵育過(guò)夜，在三乙醇胺緩沖鹽溶液（TBS）中洗滌后，在室溫下與辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)的二抗（1∶5 000）孵育2 h。最后，在Tanon-5500化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)中進(jìn)行蛋白條帶灰度成像并拍照，應(yīng)用Image J軟件進(jìn)行定量。以β-actin為內(nèi)參，分析目的蛋白表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)單獨(dú)重復(fù)3次。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 21.0和GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 原代VSMC的鑒定

光鏡觀察結(jié)果顯示，采用組織塊貼壁法培養(yǎng)至5～7 d時(shí)可見(jiàn)有VSMC從組織塊邊緣爬出，10 d左右時(shí)VSMC可融合生長(zhǎng)，呈多角形、梭形或不規(guī)則形（見(jiàn)圖1）。免疫熒光染色結(jié)果表明，VSMC顯示出α-SAM標(biāo)記的綠色熒光，且陽(yáng)性細(xì)胞比例達(dá)95%以上（見(jiàn)圖2）。上述結(jié)果提示，本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)的細(xì)胞為VSMC，且純度可滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 轉(zhuǎn)染后VSMC中LP-PLA2的表達(dá)

RT-PCR與Western Blot法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后VSMC中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達(dá)的結(jié)果顯示，與control組比較，轉(zhuǎn)染oe-LP-PLA2質(zhì)粒后細(xì)胞中LP-PLA2 mRNA和蛋白表達(dá)水平均明顯升高（P＜0.01），而轉(zhuǎn)染oe-NC的細(xì)胞中無(wú)明顯變化（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖3～圖5。

2.3 過(guò)表達(dá)LP-PLA2對(duì)VSMC源性泡沫細(xì)胞形成的影響

油紅O染色結(jié)果顯示，細(xì)胞形態(tài)增大變圓，胞核突出，胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)大量紅色脂滴，并呈“戒環(huán)”狀聚集在細(xì)胞周邊，符合VSMC泡沫樣變。與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細(xì)胞的油紅O陽(yáng)性面積明顯增加（P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組油紅O陽(yáng)性面積明顯增加（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組油紅O陽(yáng)性面積明顯減少（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖6、圖7。

細(xì)胞內(nèi)總膽固醇含量測(cè)定結(jié)果表明，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組VSMC中總膽固醇含量升高（P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組總膽固醇含量升高（P＜0.05），但ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組無(wú)改變（P＞0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組VSMC中總膽固醇含量降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖8。

2.4 過(guò)表達(dá)LP-PLA2對(duì)VSMC源性泡沫細(xì)胞炎癥與氧化應(yīng)激的影響

ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組上清液中TNF-α、IL-6、MCP-1含量升高（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組TNF-α、IL-6、MCP-1含量升高（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中TNF-α、IL-6、MCP-1含量降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)表1。

DCFH-DA法檢測(cè)各組VSMC源性泡沫細(xì)胞中ROS水平的結(jié)果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細(xì)胞中ROS表達(dá)水平升高（P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組ROS表達(dá)升高（P＜0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細(xì)胞中ROS表達(dá)降低（P＜0.05）。詳見(jiàn)圖9、圖10。

2.5 過(guò)表達(dá)LP-PLA2對(duì)VSMC源性泡沫化信號(hào)通路的影響

Western Blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與control組比較，ox-LDL＋oe-NC組、ox-LDL＋oe-LP-PLA2組和ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組VSMC源性泡沫細(xì)胞中LP-PLA2和泡沫化信號(hào)通路中ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05或P＜0.01）；與ox-LDL＋oe-NC組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2組LP-PLA2、ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05或P＜0.01），ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組中除LP-PLA2升高外（P＜0.05），其他蛋白表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與ox-LDL＋oe-LP-PLA2組比較，ox-LDL＋oe-LP-PLA2＋LY294002組細(xì)胞中ACATl、ERK1/2、JNK/SAPK蛋白表達(dá)水平均降低（P＜0.05），而LP-PLA2蛋白表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)圖11、圖12。

3 討 論

研究表明，靶向VSMC的泡沫化進(jìn)程可能是緩解動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)鍵策略［9］。本研究結(jié)果表明，上調(diào)VSMC中LP-PLA2表達(dá)可通過(guò)大胞飲機(jī)制和ERK1/2、JNK/SAPK途徑促進(jìn)ox-LDL作用下的細(xì)胞中脂質(zhì)累積與炎性因子和ROS的產(chǎn)生，從而加速誘導(dǎo)VSMC的泡沫化轉(zhuǎn)變。

在動(dòng)脈粥樣硬化形成過(guò)程中，多種炎性細(xì)胞可分泌LP-PLA 如單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、泡沫細(xì)胞等［5，10］。同時(shí)，單核細(xì)胞成熟為巨噬細(xì)胞也伴隨著LP-PLA2 mRNA和蛋白水平的明顯增加，且在用ox-LDL處理巨噬細(xì)胞以誘導(dǎo)其泡沫化過(guò)程中，LP-PLA2表達(dá)水平也呈現(xiàn)出明顯的升高趨勢(shì)［11］，這與在臨床中動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中觀察到的結(jié)果一致［12］，均表明LP-PLA2是巨噬細(xì)胞發(fā)生泡沫化的關(guān)鍵因子。而在VSMC來(lái)源的泡沫化細(xì)胞中，LP-PLA2的具體作用尚不明確。細(xì)胞中脂質(zhì)積累和炎癥反應(yīng)及氧化應(yīng)激是VSMC發(fā)生泡沫化最為明顯的、相互關(guān)聯(lián)的病理變化［13］。而ox-LDL作為內(nèi)源性脂質(zhì)配體的主要成分，其可導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞損傷，并積聚在巨噬細(xì)胞和VSMC中，可進(jìn)一步誘導(dǎo)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的發(fā)生［14］。研究顯示，LP-PLA2參與ox-LDL誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和ROS生成［15］。本課題組通過(guò)ox-LDL處理原代分離的小鼠VSMC發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞中脂質(zhì)累積和促炎因子TNF-α、IL-6、MCP-1和ROS的表達(dá)水平均明顯升高，而上調(diào)VSMC中LP-PLA2表達(dá)則明顯促進(jìn)了上述現(xiàn)象的發(fā)生。表明VSMC泡沫化進(jìn)程中LP-PLA2同樣具有重要作用。TNF-α和IL-6作為炎癥性標(biāo)志物，其在動(dòng)脈粥樣硬化中能夠介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞損傷，參與凝血功能障礙與炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)的放大，并影響粥樣斑塊的穩(wěn)定性［16］。而MCP-1是一種在動(dòng)脈粥樣斑塊中發(fā)現(xiàn)的，可被單核細(xì)胞、VSMC和內(nèi)皮細(xì)胞等多種細(xì)胞表達(dá)的一種C-C型促炎趨化因子［17］。研究發(fā)現(xiàn)，MCP-1不僅能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與單核細(xì)胞之間的黏附，還能促進(jìn)VSMC的增殖，使其由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，而后者可大量攝取ox-LDL并發(fā)生泡沫化［18］。同時(shí)，發(fā)生泡沫樣變的VSMC對(duì)MCP的分泌能力也明顯增強(qiáng)，這與在人類(lèi)動(dòng)脈粥樣硬化中發(fā)現(xiàn)的VSMC高表達(dá)MCP-1的現(xiàn)象一致［17-18］。此外，促炎因子TNF-α、IL-6等還能直接激活與內(nèi)皮細(xì)胞膜結(jié)合的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADPH）氧化酶，進(jìn)而催化產(chǎn)生ROS，作為信號(hào)分子調(diào)節(jié)血管與細(xì)胞內(nèi)黏附分子基因的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)，從而加速動(dòng)脈粥樣硬化的形成與發(fā)展［19］。

大胞飲是一種可無(wú)需肌動(dòng)蛋白參與的細(xì)胞外物質(zhì)進(jìn)入胞內(nèi)的途徑之一，其與細(xì)胞的免疫反應(yīng)，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的攝取和粥樣硬化中細(xì)胞的泡沫樣變等多種生理及病理學(xué)改變均密切相關(guān)［20-21］。在巨噬細(xì)胞來(lái)源的泡沫細(xì)胞中，Anzinger等［22］研究表明，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子誘導(dǎo)的小鼠巨噬細(xì)胞可通過(guò)大胞飲機(jī)制攝取LDL，使其發(fā)生泡沫化，并促進(jìn)主動(dòng)脈的脂質(zhì)積聚。而對(duì)于VSMC的泡沫化進(jìn)程，陳雪等［23］研究表明，炎癥可誘導(dǎo)VSMC通過(guò)大胞飲機(jī)制來(lái)攝取天然低密度脂蛋白，從而增加細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)的聚集，促進(jìn)細(xì)胞的泡沫化形成。本研究在上述研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)應(yīng)用胞飲抑制劑LY294002測(cè)試，結(jié)果表明阻滯VSMC的胞飲途徑可降低過(guò)表達(dá)LP-PLA2所促進(jìn)的VSMC的泡沫化進(jìn)程。提示大胞飲機(jī)制可能是LP-PLA2促進(jìn)VSMC發(fā)生泡沫化的重要途徑。ACATl是細(xì)胞內(nèi)催化游離膽固醇和脂肪酸合成膽固醇酯的關(guān)鍵酶，其在細(xì)胞發(fā)生泡沫化進(jìn)程中具有重要作用［24］。而抑制ACATl在一定程度上可改善動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)展［25］。ERK和JNK/SAPK作為絲裂素活化蛋白激酶（mitogen activated protein kinase，MAPK）通路的兩條重要途徑，均參與了動(dòng)脈粥樣硬化的病理過(guò)程［26］。研究表明，ox-LDL所致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂、VSMC的增殖與遷移及其與巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)的失衡等都與ERK和JNK/SAPK途徑有關(guān)［26-27］。本研究結(jié)果表明，上調(diào)VSMC中LP-PLA2表達(dá)水平可促進(jìn)ox-LDL刺激作用下的細(xì)胞中ERK和JNK/SAPK通路，而大胞飲抑制劑則能削弱LP-PLA2對(duì)ERK和JNK/SAPK蛋白表達(dá)水平的促進(jìn)作用。

4 小 結(jié)

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，上調(diào)LP-PLA2表達(dá)可通過(guò)大胞飲機(jī)制促進(jìn)ox-LDL作用下的VSMC的泡沫化進(jìn)程，而這可能與ERK和JNK/SAPK通路的表達(dá)上調(diào)有關(guān)。本研究進(jìn)一步補(bǔ)充了VSMC發(fā)生泡沫化的相關(guān)機(jī)制，有望LP-PLA2成為今后預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化思路與策略的研究靶點(diǎn)提供新的思路與策略。

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（收稿日期：2022-07-28）

（本文編輯鄒麗）

基金項(xiàng)目 海南省衛(wèi)生健康行業(yè)科研項(xiàng)目（No.20A200521）

通訊作者 林莉，E-mail：linli66718458@126.com

引用信息 梁榮珍，王太成，林德文，等.脂蛋白相關(guān)性磷脂酶A2促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞泡沫化機(jī)制的研究［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，202 21（15）：2777-2784.