針刺調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號通路對創(chuàng)傷性腦出血大鼠血腦屏障的影響

摘要 目的：探究針刺調(diào)節(jié)Ras同源基因家族成員A（RhoA）/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）信號通路對創(chuàng)傷性腦出血（TICH）大鼠血腦屏障的影響。方法：隨機(jī)將SD大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、TICH組、針刺組、RhoA抑制劑組，除Sham組外，其余各組均采用自由落體擊打法制備TICH模型，于TICH模型大鼠蘇醒后，針刺組給予百會穴透刺患側(cè)曲鬢穴針刺干預(yù)，RhoA抑制劑組給予Rhosin（40 mg/kg）腹腔注射干預(yù)，連續(xù)干預(yù)3 d。3 d后采用Loeffler評分法評估神經(jīng)缺損程度（Loeffler評分與神經(jīng)缺損程度呈負(fù)相關(guān)）；烘干法測定腦組織含水量；原位末端標(biāo)記測定法（TUNEL）染色檢測腦組織神經(jīng)元凋亡情況；伊文思藍(lán)染色（Evans blue）檢測血腦屏障損傷情況（伊文思藍(lán)滲透量與血腦屏障損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)）；蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測腦組織RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果：與Sham組比較，TICH組Loeffler評分減少（P＜0.05），腦組織含水量、神經(jīng)元凋亡率、伊文思藍(lán)滲透量增加（P＜0.05）；與TICH組比較，針刺組、RhoA抑制劑組Loeffler評分增加（P＜0.05），腦組織含水量、神經(jīng)元凋亡率、伊文思藍(lán)滲透量減少（P＜0.05）；針刺組與RhoA抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。與Sham組比較，TICH組腦組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與TICH組比較，針刺組、RhoA抑制劑組RhoA、ROCK蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；針刺組與RhoA抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論：針刺可保護(hù)TICH大鼠血腦屏障，可能通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活而改善腦水腫以及神經(jīng)損傷。

關(guān)鍵詞 創(chuàng)傷性腦出血；針刺；Ras同源基因家族成員A/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶信號通路；血腦屏障；大鼠；實驗研究

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.15.011

創(chuàng)傷性腦出血（traumatic intracerebral hemorrhage，TICH）為腦出血的一種常見類型，系指因交通事故、高處墜落等因素而致頭部外傷，進(jìn)而引發(fā)的腦實質(zhì)出血，可導(dǎo)致血腦屏障受損，繼而引發(fā)腦水腫、神經(jīng)損傷，具有較高的致殘率、致死率［1］。針刺為我國傳統(tǒng)醫(yī)術(shù)的一種，是運用針具刺入一定的穴位而達(dá)到防治疾病目的的一種療法，具有適應(yīng)證廣、操作簡便、療效顯著、經(jīng)濟(jì)安全等優(yōu)點［2］。已有臨床研究報道，針刺對腦出血疾病的治療取得了較大進(jìn)展，但其具體作用機(jī)制仍待探究、闡明［3-5］。Ras同源基因家族成員A（Ras homologous gene family member A，RhoA）/Rho相關(guān)卷曲螺旋蛋白激酶（Rho-associated coiled-coil forming protein kinase，ROCK）信號通路是機(jī)體內(nèi)緊要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，在腦出血疾病的進(jìn)展中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，已成為治療腦出血疾病的熱門研究靶點之一［6-7］。此外，有研究報道，針刺可通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活而改善阿爾茨海默病小鼠學(xué)習(xí)記憶功能，減輕高脂血癥大鼠血管內(nèi)皮損傷［8-9］?；诖?，推測針刺亦可能通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活而保護(hù)TICH大鼠血腦屏障。本研究采用自由落體擊打法制備TICH模型，觀察針刺對TICH大鼠血腦屏障的影響，并探究RhoA/ROCK信號通路激活作為其作用機(jī)制的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

120只無特定病原體（SPF）級SD大鼠，由北京華阜康生物公司提供，7～8周齡，雄性，體質(zhì)量（240±20）g。于武漢市中醫(yī)醫(yī)院實驗室飼養(yǎng)3 d使其穩(wěn)定后開始造模，飼養(yǎng)環(huán)境：12 h光/暗交替模式，溫度23～28 ℃，濕度45%～55%，自由攝食、飲水。

1.2 主要試劑與儀器

RhoA抑制劑（Rhosin）（貨號HY-12646A，MCE公司）；原位末端標(biāo)記測定法（TUNEL）染色試劑盒、二喹啉甲酸法（BCA）試劑盒（貨號分別為C1091、P001 Beyotime公司）；伊文思藍(lán)（Evans blue）示蹤染色試劑盒（貨號GOY-C375 上海谷研實業(yè)公司）；RIPA裂解液（貨號AR010 武漢博士德生物工程公司）；兔抗大鼠一抗anti-GAPDH、anti-RhoA、anti-ROCK及山羊抗兔二抗（貨號分別為ab181602、ab187027、ab45171、ab9705 Abcam公司）。顱骨鉆（型號DB014，北京智鼠多寶生物科技公司）；一次性無菌針灸針（蘇械注準(zhǔn)20172271874，江蘇華文醫(yī)療器械有限公司）；石蠟包埋機(jī)、切片機(jī)（型號分別為HS-B7126-B、HS-S7220-B，沈陽恒松科技公司）；烘箱（型號Thermo OGS100，上海賽瑩科學(xué)儀器公司）；凝膠成像儀（型號Invitrogen iBright，賽默飛世爾科技公司）；酶標(biāo)儀（型號iMark，Bio-Rad公司）；光學(xué)顯微鏡（NiKON E100，上海普赫生物科技公司）。

1.3 實驗分組

隨機(jī)將120只SD大鼠分為假手術(shù)（Sham）組、TICH組、針刺組與RhoA抑制劑組（Rhosin，40 mg/kg），每組30只。

1.4 TICH模型制備及干預(yù)

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，使其俯臥、固定于手術(shù)臺，將額頂剃毛、消毒，于人字縫、矢狀縫右側(cè)約3 mm作一2 cm切口，而后使用顱骨鉆鉆孔（直徑約5 mm），操作過程中保持硬膜完整，而后將致傷墊片置于孔上，以20 g砝碼行自由落體（于距頭頂30 cm處釋放）擊打致傷墊片制備TICH模型，而后用牙科水泥封閉鉆孔，消毒、縫合切口。Sham組僅作鉆孔處理。針刺組于大鼠蘇醒后進(jìn)行針刺干預(yù)，采用一次性無菌針灸針（0.35 mm×40 mm）自百會穴透刺患側(cè)曲鬢穴，進(jìn)針約1.5 cm，留針30 min，留針期間以180～200 r/min的速度攆轉(zhuǎn)，每次5 min，共攆轉(zhuǎn)3次，每次間隔5 min。12 h針刺1次，每日2次，連續(xù)3 d。RhoA抑制劑組于大鼠蘇醒后腹腔注射Rhosin（40 mg/kg），每日1次，連續(xù)3 d。

1.5 Loeffler評分法評估神經(jīng)缺損程度

于干預(yù)后第4 天采用Loeffler評分法［10］評估神經(jīng)缺損程度。評分標(biāo)準(zhǔn)：正常運動，5 s內(nèi)翻身計為5分；自主運動減少，5 s內(nèi)翻身計為4分；＞5 s翻身計為3分；不能翻身計為2分；不能運動計為1分；死亡計為0分。Loeffler評分與神經(jīng)缺損程度呈負(fù)相關(guān)，各組大鼠均無死亡情況。

1.6 烘干法測定腦組織含水量

評估大鼠神經(jīng)行為學(xué)后每組取10只斷頭取腦，輕輕拭去表面液體，稱量得到濕重，而后置于烘箱中烘干水分，稱量得到干重。腦組織含水量（%）＝（濕重—干重）/濕重×100%。

1.7 TUNEL染色檢測腦組織神經(jīng)元凋亡情況

評估大鼠神經(jīng)行為學(xué)后每組取10只斷頭取腦，部分腦組織凍存?zhèn)溆?，余者置于多聚甲醛?%）中固定36 h，經(jīng)脫水、透明后進(jìn)行浸蠟包埋，制作4 μm厚的冠狀位切片，將切片脫蠟至水，依次浸于蛋白酶K中孵育20 min（37 ℃）、含3% H2O2的甲醇中封閉15 min（室溫）、TUNEL反應(yīng)液中孵育1 h（37 ℃），滴加二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液孵育5 min，洗滌后于光學(xué)顯微鏡下計數(shù)TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)及細(xì)胞總數(shù)，計算神經(jīng)元凋亡率。神經(jīng)元凋亡率（%）＝TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.8 伊文思藍(lán)示蹤染色檢測血腦屏障損傷情況

評估大鼠神經(jīng)行為學(xué)后，每組剩余10只大鼠于處死1 h前尾靜脈注入2%伊文思藍(lán)染液（4 mL/kg），1 h后麻醉并行心臟灌流，斷頭取腦，拍照保存腦組織肉眼直觀圖，稱量獲得其濕重，加入磷酸鹽緩沖液（PBS）進(jìn)行勻漿，離心取上清，加入等體積的三氯乙酸，于室溫孵育24 h后離心取上清，借助酶標(biāo)儀測定620 nm波長下吸光值。同時根據(jù)測定的已知濃度（不同梯度）的標(biāo)準(zhǔn)伊文思藍(lán)的吸光值獲得標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算腦組織中伊文思藍(lán)含量。結(jié)果以每克腦組織中所滲透的伊文思藍(lán)量表示，伊文思藍(lán)滲透量與血腦屏障損傷嚴(yán)重程度呈正相關(guān)。

1.9 蛋白質(zhì)免疫印跡法（Western Blot）檢測腦組織RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

凍存的腦組織經(jīng)PBS清洗后加入RIPA裂解液勻漿，離心取上清，BCA法測定總蛋白濃度，利用上樣緩沖液定量，通過凝膠電泳使蛋白分離，而后將其轉(zhuǎn)印至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）上，封閉后孵育一抗anti-RhoA、anti-ROCK、anti-GAPDH（過夜），后孵育二抗（1 h），最后加入顯色劑，利用凝膠成像儀拍照，通過Image J軟件進(jìn)行灰度分析。

1.10 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，定量資料符合正態(tài)分布的以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較行單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組Loeffler評分比較

與Sham組比較，TICH組Loeffler評分減少（P＜0.05）；與TICH組比較，針刺組與RhoA抑制劑組Loeffler評分增加（P＜0.05）；針刺組與RhoA抑制劑組評分比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

2.2 各組腦組織含水量與神經(jīng)元凋亡率

與Sham組比較，TICH組腦組織含水量、神經(jīng)元凋亡率增加（P＜0.05）；與TICH組比較，針刺組、RhoA抑制劑組腦組織含水量、神經(jīng)元凋亡率減少（P＜0.05）；針刺組與RhoA抑制劑組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖1、表2。

2.3 各組血腦屏障損傷情況

與Sham組比較，TICH組腦組織伊文思藍(lán)滲透量增加（P＜0.05）；與TICH組比較，針刺組、RhoA抑制劑組伊文思藍(lán)滲透量減少（P＜0.05）；針刺組與RhoA抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖2、表3。

2.4 各組腦組織RhoA/ROCK信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)情況

與Sham組比較，TICH組腦組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)增加（P＜0.05）；與TICH組比較，針刺組、RhoA抑制劑組RhoA、ROCK蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）；針刺組與RhoA抑制劑組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見圖3、表4。

3 討 論

血腦屏障是保護(hù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的重要結(jié)構(gòu)，當(dāng)TICH發(fā)生后其完整性被破壞，導(dǎo)致體液、胞漿蛋白滲出，繼而引發(fā)腦水腫、神經(jīng)功能異常等腦損傷，使TICH病情加重、惡化［11］。西醫(yī)多采用降低顱內(nèi)壓、血壓等常規(guī)藥物及外科手術(shù)治療腦出血，其中常規(guī)藥物治療對癥狀改善及預(yù)后不理想，而外科手術(shù)治療創(chuàng)傷大，且手術(shù)指征、時機(jī)尚存爭議［12］。

針刺作為我國一種傳統(tǒng)醫(yī)術(shù)，治療腦出血效果明確，且相較于西醫(yī)，具有起效快、操作簡便、價格低廉且副作用小的優(yōu)勢［13-14］。百會穴、曲鬢穴為針刺治療腦出血疾病常用穴，其中百會穴位于兩耳尖與頭頂正中線連線的交點處，為百脈之會，百病所主［15］；曲鬢穴位于耳尖水平線與耳前鬢角發(fā)際后緣垂線的交點處，為足少陽膽經(jīng)穴，主治頭面五官病、神志?。?6］。多項研究報道，經(jīng)百會穴透刺曲鬢穴針刺可改善腦出血大鼠腦水腫，減少神經(jīng)元凋亡，保護(hù)其神經(jīng)功能［17-18］。本研究選取百會穴透刺曲鬢穴對TICH大鼠進(jìn)行針刺干預(yù)，結(jié)果顯示，與Sham組比較，TICH組Loeffler評分減少，腦組織含水量、神經(jīng)元凋亡率、伊文思藍(lán)滲透量增加，而經(jīng)針刺干預(yù)后，上述情況均明顯改善，表明針刺可保護(hù)TICH大鼠血腦屏障，改善腦水腫，減輕神經(jīng)元損傷。

雖然針刺治療腦出血疾病一直被臨床所推崇，但其作用機(jī)制仍不清楚。研究顯示，RhoA/ROCK信號通路是與腦出血疾病進(jìn)展密切相關(guān)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，其中RhoA是一種三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結(jié)合蛋白，分子量為20～25 kDa，有GTP酶活性；ROCK為一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，分子量約為160 kDa，為RhoA的下游靶點，當(dāng)RhoA與ROCK相互結(jié)合、作用后可使ROCK激活，破壞血腦屏障［19-20］。有研究發(fā)現(xiàn)，在阿爾茨海默病小鼠模型中，針刺可通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活而改善其學(xué)習(xí)記憶功能［8］；在高脂血癥大鼠模型中，針刺可通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活而減輕其血管內(nèi)皮損傷［9］。而針刺是否通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活而保護(hù)TICH大鼠血腦屏障尚未可知。本研究結(jié)果顯示，與Sham組比較，TICH組腦組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)增加，表明RhoA/ROCK信號通路激活參與大鼠TICH的發(fā)生過程。經(jīng)針刺干預(yù)后，TICH大鼠腦組織RhoA、ROCK蛋白表達(dá)減少，表明針刺可抑制RhoA/ROCK信號通路；同時設(shè)置RhoA抑制劑處理為平行對照，結(jié)果顯示，抑制RhoA/ROCK信號通路激活后大鼠血腦屏障及腦水腫、神經(jīng)元損傷均得到了明顯改善，綜合本研究結(jié)果，推測通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活可能為針刺保護(hù)TICH大鼠血腦屏障的作用機(jī)制。

綜上所述，針刺可保護(hù)TICH大鼠血腦屏障，可能通過抑制RhoA/ROCK信號通路激活而改善腦水腫以及減輕神經(jīng)損傷。

參考文獻(xiàn)：

［1］SULHAN S，LYON K A，SHAPIRO L A，et al.Neuroinflammation and blood-brain barrier disruption following traumatic brain injury：pathophysiology and potential therapeutic targets［J］.Journal of Neuroscience Research，2020，98（1）：19-28.

［2］CHEN F I，ANTOCHI A D，BARBILIAN A G.Acupuncture and the retrospect of its modern research［J］.Romanian Journal of Morphology and Embryology，2019，60（2）：411-418.

［3］郭子泉，黃泳，姜華，等.早期針刺治療外傷性腦內(nèi)血腫：隨機(jī)對照研究［J］.中國針灸，2018，38（5）：493-498.

［4］LIU H，ZHANG B，LI X W，et al.Acupuncture inhibits mammalian target of rapamycin，promotes autophagy and attenuates neurological deficits in a rat model of hemorrhagic stroke［J］.Acupunct Med，202 40（1）：59-67.

［5］LIU P，YU X Y，DAI X H，et al.Scalp acupuncture attenuates brain damage after intracerebral hemorrhage through enhanced mitophagy and reduced apoptosis in rats［J］.Frontiers in Aging Neuroscience，202 13：718631.

［6］MULHERKAR S，TOLIAS K F.RhoA-ROCK signaling as a therapeutic target in traumatic brain injury［J］.Cells，2020，9（1）：245-257.

［7］付正浩，陳祎招，楊碩，等.RhoA/Rho激酶信號通路在腦出血后血紅蛋白影響血腦屏障通透性中的作用［J］.中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，201 12（12）：244-1248.

［8］王煜，趙嵐，史慧妍，等.基于RhoA/ROCK通路探討三焦針法對老年癡呆小鼠學(xué)習(xí)記憶及突觸可塑性的影響［J］.針刺研究，202 46（8）：635-641.

［9］陶歡，劉盛菲，凌敏.基于Rho/ROCK信號通路的針刺對高脂血癥模型大鼠血管內(nèi)皮保護(hù)機(jī)制研究［J］.中國中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，2019，25（8）：1134-1136.

［10］何娟，吳瓊，李娜，等.電針對蛛網(wǎng)膜下腔出血大鼠腦血流灌注影響與神經(jīng)功能障礙的關(guān)聯(lián)研究［J］.中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2019，34（7）：778-782.

［11］BENNETT M，CHIN A，LEE H J，et al.Proteoglycan 4 reduces neuroinflammation and protects the blood-brain barrier after traumatic brain injury［J］.J Neurotrauma，202 38（4）：385-398.

［12］GALGANO M，TOSHKEZI G，QIU X C，et al.Traumatic brain injury：current treatment strategies and future endeavors［J］.Cell Transplantation，2017，26（7）：1118-1130.

［13］LIU H，SUN X W，ZOU W，et al.Scalp acupuncture attenuates neurological deficits in a rat model of hemorrhagic stroke［J］.Complementary Therapies in Medicine，2017，32：85-90.

［14］LEE D H，CHO S Y，YANG S B，et al.Efficacy of acupuncture treatment to prevent cerebral vasospasm after subarachnoid hemorrhage：a double-blind，randomized placebo-controlled trial［J］.Journal of Alternative and Complementary Medicine，2020，26（12）：1182-1189.

［15］馮曉東，黃金，李瑞青，等.電針神庭、百會穴對腦缺血再灌注大鼠學(xué)習(xí)記憶能力及大鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)LC3蛋白表達(dá)的影響［J］.時珍國醫(yī)國藥，2018，29（8）：2020-2024.

［16］陳秋欣，鄒偉，孫曉偉，等.針刺“百會”透“曲鬢”穴拮抗急性腦出血大鼠炎性損傷的機(jī)制研究［J］.針刺研究，2016，41（5）：410-416.

［17］LIU X Y，DAI X H，ZOU W，et al.Acupuncture through Baihui（DU20） to Qubin（GB7） mitigates neurological impairment after intracerebral hemorrhage［J］.Neural Regeneration Research，2018，13（8）：1425-1432.

［18］KONG Y，LI S L，ZHANG M，et al.Acupuncture ameliorates neuronal cell death，inflammation，and ferroptosis and downregulated miR-23a-3p after intracerebral hemorrhage in rats［J］.Journal of Molecular Neuroscience，202 71（9）：1863-1875.

［19］王蔚，杜淵，王洪連，等.蛭龍活血通瘀膠囊通過Rho/ROCK通路改善腦出血后腦水腫的實驗研究［J］.中藥藥理與臨床，202 37（1）：142-147.

［20］ZHOU Z Y，HUANG B，LI S，et al.Sodium tanshinone ⅡA sulfonate promotes endothelial integrity via regulating VE-cadherin dynamics and RhoA/ROCK-mediated cellular contractility and prevents atorvastatin-induced intracerebral hemorrhage in zebrafish［J］.Toxicology and Applied Pharmacology，2018，350：32-42.

（收稿日期：2022-03-28）

（本文編輯王雅潔）

基金項目 武漢市衛(wèi)生健康委員會資助項目（No.WZ21C58）

通訊作者 劉江華，E-mail：vl322c@163.com

引用信息 王翠，楊暢，金玉，等.針刺調(diào)節(jié)RhoA/ROCK信號通路對創(chuàng)傷性腦出血大鼠血腦屏障的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，202 21（15）：2773-2776.