基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究穩(wěn)心湯對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷修復(fù)的作用機制

摘要 目的：觀察穩(wěn)心湯對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷的影響，并基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）調(diào)控通路明確其作用機制。方法：使用5%CO2、1%O2、94%N2培養(yǎng)箱構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型，并通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染技術(shù)達到miR-126-5p的過表達與抑制。待干預(yù)結(jié)束后觀察心肌細(xì)胞上清液乳酸脫氫酶（LDH）釋放水平、心肌細(xì)胞活性氧（ROS）含量；原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測心肌細(xì)胞凋亡；流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞線粒體mPTP開放水平；蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測細(xì)胞色素C（Cyt-C）釋放水平與Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9蛋白表達水平；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測miR-126-5p及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的RNA表達水平。結(jié)果：與miR-126-5p低表達組比較，miR-126-5p過表達可顯著降低LDH釋放水平；減少心肌細(xì)胞ROS含量；改善心肌細(xì)胞凋亡率；提高心肌細(xì)胞CalceinAM水平，減少mPTP開放。miR-126-5p過表達可以減少H9c2心肌細(xì)胞Cyt-C釋放水平，miR-126-5p低表達可部分減少H9c2心肌細(xì)胞Cyt-C釋放水平。miR-126-5p過表達可上調(diào)Bcl-2蛋白與基因表達，下調(diào)Caspase-3與Caspase-9蛋白與基因表達。miR-126-5p低表達可部分上調(diào)miR-126-5p表達水平與Bcl-2蛋白與基因表達；部分下調(diào)Caspase-3與Caspase-9蛋白與基因表達。結(jié)論：穩(wěn)心湯改善缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞損傷可能與調(diào)控miR-126-5p/Bcl-2/mPTP信號通路有關(guān)，從而減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低線粒體膜通透性，抑制心肌細(xì)胞凋亡，延緩心肌損傷。

關(guān)鍵詞 穩(wěn)心湯；H9c2心肌細(xì)胞；miR-126-5p/Bcl-2/心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）；缺氧/復(fù)氧；心肌損傷

doi：10.12102/j.issn.1672-1349.2023.15.009

The Effect of Wenxin Formula on the Damage and Repair of H9c2 Myocardial Cells Induced by Hypoxia/Reoxygenation Based on miR-126-5p/Bcl-2/mPTP Regulatory Pathway

XIE Zicong， LIU Yongmei， CHEN Hengwen， TAN Yuqing， LI Jun

Guang ′anmen Hospital， China Academy of Chinese Medicine Science， Beijing 10005 China

Corresponding Author LI Jun， E-mail： gamyylj@163.com

Abstract Objective：To observe the effect of Wenxin Formula on H9c2 myocardial cell injury induced by hypoxia/reoxygenation，and to clarify its mechanism based on the regulatory pathway of miR-126-5p/Bcl-2/mitochondrial permeability conversion pore（mPTP）.Methods：The hypoxia and reoxygenation model of H9c2 myocardial cells were constructed in a three-gas incubator，and the overexpression and inhibition of miR-126-5p were achieved by cell transfection.After the intervention，the release level of lactate dehydrogenase（LDH）and the content of reactive oxygen species（ROS）in cardiomyocytes were observed.Myocardial cell apoptosis was detected by TUNEL.The open level of mPTP was detected by flow cytometry.The release level of cytochrome-C（Cyt-C）and the expression levels of Bcl- Caspase- and Caspase-9 were detected by Western Blot.Real-time quantitative fluorescence polymerase reaction（qRT-PCR）was used to detect the expression levels of miR-126-5p，Bcl- Caspase-3 and，Caspase-9 RNA.Results：Compared with miR-126-5p low expression group，miR-126-5p overexpression significantly reduced the LDH release level;reduced ROS content in cardiomyocytes;improved myocardial cell apoptosis rate;calceinam level increased and mPTP opening decreased.Overexpression of miR-126-5p could reduce the Cyt-C release level of H9c2 cardiomyocytes，and low expression of miR-126-5p could partially reduce the Cyt-C release level of H9c2 cardiomyocytes.Overexpression of miR-126-5p could up-regulate the expression of Bcl-2 protein and gene，and down-regulate the expression of Caspase-3 and Caspase-9 protein and gene.When miR-126-5p expression was low，the expression level of miR-126-5p and Bcl-2 could be partially up-regulated.Partially down-regulated the expression levels of Caspase-3 and Caspase-9.Conclusion：The Wenxin Formula could improve H9c2 myocardial cells injury induced by hypoxia/reoxygenation which may be related to the regulation of miR-126-5p/Bcl-2/mPTP signaling pathway，so as to reduce oxidative stress response，reduce mitochondrial membrane permeability，inhibit cardiomyocyte apoptosis，and delay myocardial injury.

Keywords Wenxin Formula; H9c2 myocardial cells; miR-126-5p/Bcl-2/mPTP; hypoxia/reoxygenation; myocardial injury

冠狀動脈粥樣硬化性心臟?。╟oronary heart disease，CHD）已成為重大公共衛(wèi)生問題。據(jù)《中國心血管健康與疾病報告2021》［1］推算，中國心血管病現(xiàn)患人數(shù)約3.3億人，其中冠心病病人1 139萬人，急性心肌梗死（acute myocardial infarction，AMI）患病率與死亡率均呈上升趨勢，心血管病死亡率已高于腫瘤及其他疾病，居于首位。目前，冠心病可通過經(jīng)皮冠狀動脈支架植入術(shù)（percutaneous coronary intervention，PCI）、冠狀動脈旁路移植術(shù)（coronary artery bypass grafting，CABG）及口服常規(guī)二級預(yù)防藥物等治療，多數(shù)病人可從中獲益［2］。仍有部分病人病情復(fù)雜，如存在手術(shù)風(fēng)險、冠狀動脈病變程度嚴(yán)重、PCI術(shù)后再狹窄、支架內(nèi)血栓等，均可不同程度影響冠心病病人的療效。中醫(yī)藥運用益氣溫陽、活血通絡(luò)、解毒等方法治療冠心病，療效確切，可改善病人臨床癥狀，減輕炎癥反應(yīng)，提高病人生活質(zhì)量，但作用機制仍待闡明［3-4］。

穩(wěn)心湯是本課題組結(jié)合多年臨床實踐與名老中醫(yī)經(jīng)驗總結(jié)出的有效方劑，藥物組成有姜黃、黃芪、黨參、赤芍、川芎、莪術(shù)、肉桂、瓜蔞、大黃、細(xì)辛、甘草，可益氣活血、散寒止痛、通陽降濁，善治冠心病氣虛血瘀證［5］。方中以姜黃、黃芪為君藥，可補氣活血，其中黃芪有效成分黃芪甲苷、姜黃有效成分姜黃素均已證實在治療冠心病中具有較好效果，可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，改善血管內(nèi)皮功能，緩解心肌缺血［6-7］。本課題組通過穩(wěn)心湯干預(yù)急性心肌梗死大鼠，觀察其作用機制，發(fā)現(xiàn)穩(wěn)心湯可改善大鼠心功能、抑制心肌纖維化、調(diào)節(jié)心室重構(gòu)，其機制可能與上調(diào)miR-126-5p，并調(diào)控其下游Bcl-2、Caspase-9等基因表達相關(guān)［8-9］。因此，本研究在前期實驗基礎(chǔ)上，通過缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷模型，模擬冠心病心肌受損，基于miR-126-5p/Bcl-2/心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔（mPTP）調(diào)控通路觀察穩(wěn)心湯改善心肌損傷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗細(xì)胞

H9c2心肌細(xì)胞系購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。

1.2 實驗藥物

實驗用穩(wěn)心湯購自中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院。實驗用黃芪甲苷標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：110781）與姜黃素標(biāo)準(zhǔn)品（貨號：110823）均購自中國食品藥品鑒定研究院。實驗用鹽酸曲美他嗪片（每片20 mg）購自中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院。藥物用不含胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基充分溶解（使用DMSO助溶），配制成2 mg/mL的母液，分裝于凍存管中，－20 ℃保存。每次實驗時需用不含F(xiàn)BS的DMEM培養(yǎng)基根據(jù)所需濃度進行稀釋。

1.3 實驗試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基（Gibco，C11995500BT）；FBS（四季青，11011-8611）；青鏈霉素混合液（P1400）、磷酸緩沖液（PBS，P1020）、通用細(xì)胞凍存液（24800）、RIPA裂解液（R0010）、二喹啉甲酸法（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（PC0020）、5×蛋白上樣緩沖液（含DTT，P1040）、10×電泳轉(zhuǎn)移緩沖液（D1060）、5×Tris-甘氨酸電泳緩沖液（T1070）、20×TBST（T1080）、彩虹245plus廣譜蛋白Marker（5-245KD）（PR1930-50T）均購自Solarbio公司；Trypsin0.25%胰蛋白酶溶液（HyClone，SH30042.01）；細(xì)胞增殖毒性檢測（CCK-8）試劑盒（日本同仁，CK04）；乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測試劑盒（碧云天生物，C0017）；純化線粒體氧化應(yīng)激活性氧（ROS）魯米諾化學(xué)發(fā)光法定量檢測試劑盒（GENMED SCIENTIFICS，GMS10112.2）；二甲基亞砜（DMSO，D2650）、Tunel（11684795910）、DAPi（D9542）購自Sigma公司。氯仿、異丙醇、無水乙醇購自北京化學(xué)試劑公司；Trizol試劑（Invitrogen公司，14105）；FastQuant RT Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒［天根生化科技（北京）有限公司，N2625］；SYBR Green PCR Master Mix 試劑盒（美國應(yīng)用生物公司，1403448）；miR-126-5p、Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9引物購自賽百盛生物科技有限公司；LipofectamineTMRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑（Thermo，13778150）；Bcl-2 Rabbit pAb（A0208）、Caspase-9 Rabbit pAb（A11451）、Caspase-3（A2156）、Cytochrome C Rabbit pAb（A0225）購自Abclonal公司；Omni-EasyTM一步法PAGE凝膠快速制備試劑盒（10%，PG212）、Omni-ECLTM增強型化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（皮克級，SQ101）購自雅酶公司；脫脂奶粉（普利萊，P1622）；eBlot L1 PVDF膜轉(zhuǎn)膜試劑A（L00791C）、eBlot L1 PVDF膜轉(zhuǎn)膜試劑B（L00793C）、eBlot L1 PVDF膜平衡濃縮液（L00734C）購自GenScript；甲醇（天津賽孚瑞）；山羊抗兔IgG（H＋L），HRP（111035003）、山羊抗鼠IgG（H＋L），HRP（115035003）購自Jackson公司；β-actin鼠單抗（銳爾康生物，REK0001）。

1.4 實驗儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo，3111）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（ESCO，CCL-050T-8-IVF）；超凈臺（上海蘇凈實業(yè)有限公司，SW-CJ-2D）；低速離心機（上海安亭科學(xué)儀器廠，KA-1000）；多功能酶標(biāo)儀（TECAN，Spark）；電熱恒溫水浴鍋［林茂科技（北京）有限公司，DZKW-4］；倒置熒光顯微鏡（OLYMPUS，CKX53）；流式細(xì)胞儀［碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司，Calibur II型］；化學(xué)發(fā)光儀（Molecμlar Devices，SpectraMax L）；低溫高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司，TGL-16）；qTower3（Analytikjena，3107A-1368），聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）擴增儀（AGS，AGT9601）；生物安全柜（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，BSC-1360II A2）；渦旋震蕩儀（寧波市鄞州群安實驗儀器有限公司，MIX-28）；電泳儀（Thermo scientific，Mini Ge Tank）；轉(zhuǎn)膜儀（GenScript eBlotTM L1）；搖床（泰州諾米醫(yī)療科技有限公司，NYC-80）；曝光儀（上海易孛特，eBlot）。

1.5 實驗方法

1.5.1 細(xì)胞培養(yǎng)

H9c2心肌細(xì)胞所用完全培養(yǎng)基由DMEM高糖培養(yǎng)基、10%FBS、1%青鏈霉素混合液組成。培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱。培養(yǎng)過程中需定期觀察細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量，待細(xì)胞融合度達到80%～90%時，使用胰蛋白酶消化，進行細(xì)胞傳代、凍存及相關(guān)檢測。

1.5.2 缺氧/復(fù)氧模型構(gòu)建

取對數(shù)生長期的H9c2心肌細(xì)胞鋪于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，待細(xì)胞貼壁過夜后，將細(xì)胞置于含5%CO2、1%O2、94%N2的培養(yǎng)箱缺氧24 h，再將細(xì)胞放于正常培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)12 h，構(gòu)建H9c2心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型。

1.5.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

細(xì)胞經(jīng)常規(guī)消化終止后調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 500 μL，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞融合度達到70%以上時，無菌狀態(tài)下無血清培養(yǎng)基稀釋miRNA至200 nmol/L，同時加入4 μL的lipo2000轉(zhuǎn)染試劑，室溫反應(yīng)15 min進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后，根據(jù)細(xì)胞分組進行實驗。

1.5.4 細(xì)胞分組及處理

將轉(zhuǎn)染后的miR-126-5p過表達細(xì)胞和低表達細(xì)胞分別進行分組。1）

miR-126-5p過表達H9c2心肌細(xì)胞分組：mim-Control組正常培養(yǎng)；mim-Model組缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)；mim-WXT-H組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予穩(wěn)心湯20 μg/mL干預(yù)；mim-WXT-M組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予穩(wěn)心湯10 μg/mL干預(yù)；mim-WXT-L組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予穩(wěn)心湯5 μg/mL干預(yù)；mim-Cur組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予姜黃素50 μg/mL干預(yù)；mim-AS-IV組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予黃芪甲苷50 μg/mL干預(yù)；mim-QMTQ組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予鹽酸曲美他嗪片10 μg/mL干預(yù)。2）miR-126-5p低表達H9c2心肌細(xì)胞分組：in-Control組正常培養(yǎng)；in-Model組缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)；in-WXT-H組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予穩(wěn)心湯20 μg/mL干預(yù)；in-WXT-M組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予穩(wěn)心湯10 μg/mL干預(yù)；in-WXT-L組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予穩(wěn)心湯5 μg/mL干預(yù)；in-Cur組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予姜黃素50 μg/mL干預(yù)；in-AS-IV組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予黃芪甲苷50 μg/mL干預(yù)；in-QMTQ組在缺氧/復(fù)氧培養(yǎng)基礎(chǔ)上，同時予鹽酸曲美他嗪片10 μg/mL干預(yù)。

1.5.5 檢測心肌細(xì)胞上清LDH釋放水平

調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔100 μL，予不同處理后，按照說明書操作步驟，每孔分別加入60 μL的LDH檢測工作液，混勻，室溫避光孵育30 min，然后在490 nm處測定吸光度。

1.5.6 檢測心肌細(xì)胞ROS含量

調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 500 μL，予不同處理后，棄上清，按照說明書加入試劑，打開化學(xué)發(fā)光儀，整合測讀10 s，獲得相對發(fā)光單位（relative light unit，RLU）。

1.5.7 原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）檢測心肌細(xì)胞凋亡

調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，鋪于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔500 μL，予不同處理后，棄培養(yǎng)基，使用TUNEL進行檢測，熒光顯微鏡拍照，其中TUNEL為綠熒光，DAPi為藍色熒光。

1.5.8 心肌細(xì)胞線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔開放檢測

調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 500 μL，予不同處理后，消化細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為1×106/mL，每個樣品體積為1 mL；使用流式細(xì)胞儀檢測Calcein AM水平，Calcein AM染色后經(jīng)CoCl2處理會導(dǎo)致僅線粒體內(nèi)呈現(xiàn)Calcein的綠色熒光，當(dāng)線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，通透性增加時，Calcein AM熒光強度降低。

1.5.9 蛋白質(zhì)免疫印記法（Western Blot）檢測細(xì)胞色素C（Cyt-C）釋放水平及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9的表達水平

調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，鋪于100 mm直徑的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)，每培養(yǎng)皿8 mL。予不同處理后，消化細(xì)胞，取細(xì)胞上清保存?zhèn)溆?。使用RIPA蛋白抽提試劑進行蛋白提取，用BCA法檢測蛋白濃度，加入4×LDS和超純水使各樣品濃度值相同，沸水浴變性5 min。然后制備PAGE凝膠、電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、一抗孵育、二抗孵育，然后將ECL加到PVDF膜上后避光反應(yīng)3～5 min，eBlot曝光儀進行曝光，選擇合適曝光時間的圖片，通過Image J軟件進行灰度值分析。一抗具體信息見表1。

1.5.10 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR法（qRT-PCR）檢測miR-126-5p及Bcl-2、Caspase-3、Caspase-9表達水平調(diào)整細(xì)胞密度為5×104個/mL，鋪于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，每孔1 500 μL，予不同處理后，消化細(xì)胞，收集混懸液至離心管中，1 000 r/min離心5 min，棄上清，加入Trizol 1 mL重懸細(xì)胞。提取細(xì)胞RNA，根據(jù)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，在95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，40個循環(huán)；72 ℃ 8 min條件下進行PCR擴增。引物序列見表 以2－△△Ct計算。

1.6 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 28.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。符合正態(tài)分布的定量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用ANOVA單因素分析；不符合正態(tài)分布的定量資料以中位數(shù)或四分位間距［M（Q Q3）］表示，采用Kruskal-Wallis檢驗。定性資料以例數(shù)或百分比（%）表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 心肌細(xì)胞上清LDH釋放水平

miR-126-5p過表達各組結(jié)果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞上清中LDH含量明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組LDH含量明顯降低（P＜0.05）。miR-126-5p低表達各組結(jié)果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞上清中LDH含量明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組LDH含量均明顯降低（P＜0.05）。詳見表3。

miR-126-5p過表達心肌細(xì)胞與低表達心肌細(xì)胞不同處理條件下比較，發(fā)現(xiàn)兩Control組、兩WXT-H組、兩QMTQ組LDH釋放水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），兩Model組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩Cur組、兩AS-IV組LDH釋放水平比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。整體說明miR-126-5p高表達可以減少LDH釋放水平。詳見圖1。

2.2 心肌細(xì)胞ROS水平

miR-126-5p過表達各組結(jié)果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞ROS含量明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的ROS含量均明顯降低（P＜0.05）。miR-126-5p低表達各組結(jié)果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞ROS含量明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的ROS含量均明顯降低（P＜0.05）。詳見表4。

miR-126-5p過表達心肌細(xì)胞與低表達心肌細(xì)胞不同處理條件下比較，發(fā)現(xiàn)兩Control組、兩Model組、兩WXT-H組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩Cur組、兩AS-IV組、兩QMTQ組ROS含量比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。miR-126-5p高表達可以減輕心肌受損后氧化應(yīng)激反應(yīng)。詳見圖2。

2.3 心肌細(xì)胞凋亡情況

miR-126-5p過表達各組結(jié)果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-QMTQ組凋亡率均明顯降低（P＜0.05），mim-AS-IV組凋亡率有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。miR-126-5p低表達各組結(jié)果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的凋亡率雖有降低趨勢，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明miR-126-5p低表達心肌細(xì)胞凋亡率較高，且用藥后改善效果不佳。詳見圖3、圖4、表5。

miR-126-5p過表達心肌細(xì)胞與低表達心肌細(xì)胞不同處理條件下比較，發(fā)現(xiàn)兩Control組心肌細(xì)胞凋亡率比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），兩Model組、兩WXT-H組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩Cur組、兩AS-IV組、兩QMTQ組心肌細(xì)胞凋亡率比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），說明miR-126-5p表達較低時，容易發(fā)生心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖5。

2.4 mPTP開放結(jié)果

miR-126-5p過表達各組結(jié)果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞CalceinAM水平明顯降低（P＜0.05），mPTP開放程度升高；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的CalceinAM水平升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），mPTP開放程度降低。miR-126-5p低表達各組結(jié)果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞CalceinAM水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的CalceinAM水平明顯升高（P＜0.05）。詳見表6。

miR-126-5p過表達心肌細(xì)胞與低表達心肌細(xì)胞不同處理條件下比較發(fā)現(xiàn)，兩Control組、兩Model組、兩WXT-H組、兩WXT-M組、兩WXT-L組、兩AS-IV組、兩QMTQ組

CalceinAM水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），說明miR-126-5p過表達與低表達，可以降低線粒體膜通透性，從而抑制心肌細(xì)胞凋亡。詳見圖6。

2.5 心肌細(xì)胞Cyt-C含量

miR-126-5p過表達各組結(jié)果顯示，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞Cyt-C釋放水平明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Cyt-C釋放水平明顯降低（P＜0.05）。說明miR-126-5p過表達心肌細(xì)胞缺氧后Cyt-C釋放增加，經(jīng)穩(wěn)心湯及其有效成分干預(yù)后可以減少Cyt-C的釋放。詳見圖7、圖8。

miR-126-5p低表達組結(jié)果顯示，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞Cyt-C釋放水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的Cyt-C釋放水平明顯降低（P＜0.05），in-WXT-L組未見降低趨勢。說明miR-126-5p低表達心肌細(xì)胞缺氧后Cyt-C釋放增加，經(jīng)穩(wěn)心湯及其有效成分干預(yù)后可以減少Cyt-C的釋放。詳見圖9、圖10。

2.6 Western Blot檢測Caspase-9、Caspase-3、Bcl-2蛋白表達

miR-126-5p過表達組結(jié)果顯示：1）就Caspase-9、Caspase-3蛋白相對表達而言，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3表達明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組Caspase-9、Caspase-3表達水平明顯降低（P＜0.05）；mim-WXT-H組未見明顯降低。2）就Bcl-2蛋白相對表達而言，與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞Bcl-2表達明顯降低（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Bcl-2表達水平明顯升高（P＜0.05）；mim-Cur組Bcl-2表達有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。說明miR-126-5p過表達心肌細(xì)胞缺氧后Caspase-9、Caspase-3蛋白表達水平均呈上升趨勢，Bcl-2蛋白表達水平呈下降趨勢；經(jīng)穩(wěn)心湯及其有效成分干預(yù)后可以減少Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，提高Bcl-2表達水平。詳見圖11、圖12。

miR-126-5p低表達各組結(jié)果顯示：1）就Caspase-9、Caspase-3蛋白相對表達而言，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞Caspase-9、Caspase-3蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的Caspase-9、Caspase-3表達水平明顯降低（P＜0.05）；in-WXT-H組Caspase-9有降低趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；in-WXT-H組的Caspase-3表達水平明顯降低（P＜0.05）。2）就Bcl-2蛋白相對表達而言，與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞Bcl-2蛋白表達明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-AS-IV組、in-QMTQ組的Bcl-2表達水平明顯升高（P＜0.05）；in-WXT-H組Bcl-2表達無明顯變化，in-Cur組Bcl-2表達明顯降低（P＜0.05）。說明miR-126-5p過表達心肌細(xì)胞缺氧后Caspase-9、Caspase-3蛋白表達水平均呈上升趨勢，Bcl-2蛋白表達水平呈下降趨勢；經(jīng)穩(wěn)心湯及其有效成分干預(yù)后可以減少Caspase-9、Caspase-3蛋白表達，提高Bcl-2表達水平。詳見圖13、圖14。

2.7 miR-126-5p、Bcl-2、Caspase-9、Caspase-3基因表達水平

miR-126-5p過表達各組結(jié)果顯示：與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞miR-126-5p、Bcl-2水平明顯降低（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的miR-126-5p、Bcl-2基因表達水平明顯升高（P＜0.05）。與mim-Control組比較，mim-Model組H9c2心肌細(xì)胞Caspase-3、Caspase-9水平明顯升高（P＜0.05）；與mim-Model組比較，mim-WXT-H組、mim-WXT-M組、mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Caspase-3表達水平明顯減少（P＜0.05），mim-WXT-L組、mim-Cur組、mim-AS-IV組、mim-QMTQ組的Caspase-9表達水平明顯減少（P＜0.05），mim-WXT-H組、mim-WXT-M組Caspase-9表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表7。

miR-126-5p低表達各組結(jié)果顯示：與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞miR-126-5p水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組miR-126-5p水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞Bcl-2水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-AS-IV組、in-QMTQ組Bcl-2水平明顯升高（P＜0.05）；in-WXT-H組、in-Cur組Bcl-2水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞Caspase-3水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-H組、in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組Caspase-3水平明顯降低（P＜0.05）；與in-Control組比較，in-Model組H9c2心肌細(xì)胞Caspase-9水平明顯升高（P＜0.05）；與in-Model組比較，in-WXT-M組、in-WXT-L組、in-Cur組、in-AS-IV組、in-QMTQ組Caspase-9水平明顯降低（P＜0.05），in-WXT-H組Caspase-9水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表8。

3 討 論

冠心病在中醫(yī)理論中可歸屬于“胸痹”“心痛”范疇?！督饏T要略》曰：“夫脈當(dāng)取太過不及，陽微陰弦，即胸痹而痛，所以然者，責(zé)其極虛也”。說明胸痹心痛的基本病機為“陽微陰弦”，胸痹病人常虛實夾雜，以虛為主。目前，多數(shù)學(xué)者認(rèn)為冠心病的發(fā)生發(fā)展多與“氣”“血”相關(guān)。史大卓教授認(rèn)為冠心病的基本病機為“虛在氣，留在瘀”，常用治法為“益氣活血法”［10］。有學(xué)者通過觀察冠心病的中醫(yī)證候分布特點，發(fā)現(xiàn)氣虛血瘀證居于首位，且男性與女性一致［11］。因此，可認(rèn)為氣虛血瘀是冠心病的主要病機。益氣活血法則是冠心病的主要治法。通過觀察益氣活血法在冠心病方面的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)常用的益氣活血劑有補氣劑、活血化瘀劑、穩(wěn)心湯、養(yǎng)心顆粒、補陽還五湯、益氣活血通脈湯等，主要藥物包含黃芪、黨參、丹參、三七，且作用機制主要集中在炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等方面［12］。

微小核糖核酸（microRNA，miRNA）是一種小型非編碼RNA，其長度為18～22 nt，可以通過識別同源序列干擾、轉(zhuǎn)錄、翻譯表觀遺傳學(xué)過程來調(diào)節(jié)基因的表達［13］。已有研究證明，miRNA可以參與諸多生物學(xué)過程如細(xì)胞生長、組織分化、細(xì)胞增殖、胚胎發(fā)育與細(xì)胞凋亡，與心血管疾病、腫瘤和衰老等診斷、治療及預(yù)測密切相關(guān)［14］。冠心病及急性心肌梗死等常伴有心肌損傷［15］。近年來，隨著科技的進步，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可以參與諸多冠心病及心肌梗死的病理改變及治療，在改善心功能、抑制細(xì)胞凋亡、促進血管新生從而改善心肌損傷等方面具有獨特的臨床價值［16-18］。李婭琳［19］通過觀察冠心病病人外周血中miR-126的表達與炎性因子的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)miR-126與冠心病嚴(yán)重程度呈正相關(guān)，當(dāng)miR-126下調(diào)時，可促進機體內(nèi)血管細(xì)胞黏附因子-1（sVCAM-1）及IL-1、IL-6、TNF-α的釋放，從而參與冠心病發(fā)生發(fā)展。已有研究者分析發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡可通過Beclin-Bcl-2/Bcl-xl復(fù)合物、mTOR及TNF-α、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等途徑激活［20-21］。

Bcl-2相關(guān)蛋白與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)。有遺傳學(xué)表明，Bcl-2對控制細(xì)胞程序性死亡至關(guān)重要，而Bcl-2蛋白家族則是導(dǎo)致半胱氨酸蛋白酶家族激活的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子［22］。Caspase可參與細(xì)胞生長分化與凋亡調(diào)節(jié)，與真核細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)。劉嘉爍等［23］通過觀察藥物對H2O2誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡作用機制，發(fā)現(xiàn)橙皮苷可以顯著促進抗凋亡基因與Bcl-2蛋白的表達，進而抑制促凋亡基因（Bax）和Caspase蛋白表達，從而阻抑細(xì)胞凋亡。研究表明，當(dāng)大鼠腦動脈發(fā)生栓塞時，Bcl-2的表達明顯降低，Bax與p-p38 MAPK的表達明顯升高，用藥干預(yù)后則Bcl-2表達增多，Bax表達減少，說明活化p-p38 MAPK通路可調(diào)節(jié)Bcl-2與Bax的表達進而改善血管缺血再灌注損傷［24］。亦有研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞凋亡率明顯升高時，Bcl-2蛋白表達顯著降低，Caspase-3蛋白表達顯著升高，說明細(xì)胞凋亡可能與激活Bcl-2/Caspase-3信號通路有關(guān)［25］。

本研究結(jié)果顯示，當(dāng)心肌細(xì)胞缺氧損傷后，miR-126-5p表達降低，可以負(fù)向調(diào)節(jié)LDH與ROS的釋放，同時增加心肌細(xì)胞凋亡率，提高線粒體膜通透性，增加心肌細(xì)胞Cyt-C釋放水平，減少Bcl-2表達，進而上調(diào)Caspase-3及Caspase-9表達。用穩(wěn)心湯及黃芪甲苷與姜黃素干預(yù)后，可以上調(diào)miR-126-5p表達。miR-126-5p高表達可以明顯降低心肌細(xì)胞LDH釋放水平，減少ROS釋放，改善心肌細(xì)胞凋亡率，減少mPTP開放，降低線粒體膜通透性，同時減少凋亡因子釋放。其機制可能與上調(diào)Bcl-2表達水平、下調(diào)Caspase-3和Caspase-9表達水平相關(guān)。

綜上所述，本研究通過構(gòu)建心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧模型模擬冠心病心肌損傷過程，證明穩(wěn)心湯可減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)，降低線粒體膜通透性，減少Cyt-C等凋亡因子釋放，進而抑制心肌細(xì)胞凋亡，延緩心肌損傷。其作用機制可能與miR-126-5p/Bcl-2/mPTP調(diào)控通路有關(guān)，為臨床使用益氣活血法治療冠心病提供科學(xué)依據(jù)。

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（收稿日期：2023-05-06）

（本文編輯鄒麗）

基金項目 國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81973836）；中國中醫(yī)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程重大攻關(guān)項目（No.CI2021A00902）；首都衛(wèi)生發(fā)展科研專項（No.2020-1-4151）

通訊作者 李軍，E-mail：gamyylj@163.com

引用信息 解紫從，劉詠梅，陳恒文，等.基于miR-126-5p/Bcl-2/mPTP通路探究穩(wěn)心湯對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞損傷修復(fù)的作用機制［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，202 21（15）：2754-2765.