降解多環(huán)芳烴和異丙威的耐鎘菌種篩選及其特性研究

摘 要：為獲得既耐受重金屬鎘又能高效降解多環(huán)芳烴（菲、芘）、異丙威的菌種，利用選擇培養(yǎng)基從染土壤中分離高效降解微生物，并進(jìn)行菌種分類(lèi)和降解特性分析。共篩選獲得2個(gè)耐鎘并降解多環(huán)芳烴、異丙威的菌種，其中WLX8D對(duì)芘降解效率最高；S-200培養(yǎng)15 d內(nèi)對(duì)菲和異丙威的最高降解效率分別為53.6%和 66.7%，結(jié)合形態(tài)學(xué)特征和16S rDNA序列分析，初步鑒定結(jié)果，WLX8D為意大利農(nóng)霉菌（Agromyces italicus），S-200為硫酸鹽還原菌（Salfate reducing bacteria）。WLX8D、S-200對(duì)芘、菲的作用濃度和耐鎘濃度范圍廣，WLX8D可降解25～100 mg/L濃度范圍的芘，S-200可以高效降解菲和異丙威（降解率50%～60%），2菌株在鎘濃度25～200 mg/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。因此，WLX8D、S-200在修復(fù)鎘與多環(huán)芳烴復(fù)合污染土壤方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

關(guān)鍵詞：耐鎘；多環(huán)芳烴；異丙威；生物降解；意大利農(nóng)霉菌；硫酸鹽還原菌

中圖分類(lèi)號(hào)：Q935; X53 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-060X（2023）07-0011-19

Abstract：To screen out Cd-resistant microorganisms that can also efficiently degrade polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs： phenanthrene and pyrene） or isoprocarb， selective media were used with PAHs or isoprocarb as the sole carbon source. The phylogenetic position of the obtained strains and their degradation characteristics of PAHs and isoprocarb were analyzed. Finally， two Cd-resistant strains which were capable of degrading PAHs or isoprocarb were isolated from contaminated soil. Among them， strain WLX8D was of the highest degradation efficiency for pyrene; as for strain S-200， within 15 days of culture， its maximum degradation efficiency for phenanthrene and isoprocarb was 53.6% and 66.7%， respectively. Based on morphologic characteristics and a 16S rDNA sequence analysis， strain WLX8D was identified as Agromyces italicus， and strain S-200 was a salfate reducing bacterium. WLX8D and S-200 could efficiently degrade diverse concentrations of PAHs （phenanthrene， pyrene） and isoprocarb over a wide range of Cd concentrations （25-200 mg/L）. WLX8D was efficient for 25-100 mg/L of pyrene. S-200 reached a 50% degradation rate for phenanthrene and 60% for isoprocarb. These two strains grew well on the culture medium containing 25-200 mg/L of Cd. These results indicate that WLX8D and S-200 are efficient strains for PAHs and isoprocarb biodegradation and have potential in the bioremediation of Cd and PAHs contaminated soil.

Key words：cadmium resistance; polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）; isoprocarb; biodegradation; Agromyces italicus; salfate reducing bacteria

由于農(nóng)田施用的農(nóng)藥通過(guò)地表徑流、污水排放擴(kuò)散，以及石油、燃料油、煤不完全燃燒產(chǎn)生的廢氣隨大氣顆粒的沉降擴(kuò)散，導(dǎo)致過(guò)量有機(jī)農(nóng)藥和多環(huán)芳烴（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）擴(kuò)散到環(huán)境中形成有機(jī)污染。異丙威（Isoprocarb） 是一種具有觸殺、胃毒和熏蒸作用，對(duì)刺吸式害蟲(chóng)稻飛虱和葉蟬有很好的防效的氨基甲酸酯類(lèi)的殺蟲(chóng)劑[1]。人們?yōu)榱吮Ｕ纤井a(chǎn)量需要大量噴施異丙威殺蟲(chóng)。大量長(zhǎng)期使用異丙威導(dǎo)致環(huán)境中的農(nóng)藥殘留日益增加，對(duì)人們的身體健康造成嚴(yán)重威脅，可能導(dǎo)致人體出現(xiàn)癌癥、畸形和內(nèi)分泌紊亂等嚴(yán)重疾病[2]。

PAHs是一類(lèi)具有高毒性、熱穩(wěn)定性、生物富集性、疏水性、不易降解等特性的持久性有機(jī)污染物[3]，可通過(guò)食物鏈傳遞而在生物體內(nèi)累積，危害人類(lèi)健康和生態(tài)環(huán)境[4]，早在1976年16種PAHs就被美國(guó)環(huán)保局列為優(yōu)先控制污染物名單[5]。PAHs在一定范圍內(nèi)，PAHs的隨著苯環(huán)數(shù)目的增加，其遺傳毒性和致癌性也隨之增加，尤其在4、5個(gè)環(huán)時(shí)毒性最高[6]，芘（Pyrene）是具有4個(gè)苯環(huán)的稠環(huán)芳烯，是檢測(cè)PAHs污染的指示物，芘已經(jīng)被列入具有致癌性的PAHs之列[7]，其代謝物醌（ Quinone）比芘毒性更大，具有致突變性[8]。

生物修復(fù)技術(shù)具有經(jīng)濟(jì)、高效且無(wú)二次污染等特點(diǎn)，對(duì)PAHs污染土壤進(jìn)行生物修復(fù)被認(rèn)為是具應(yīng)用前景的修復(fù)技術(shù)之一，而選育PAHs高效降解菌種，是該技術(shù)的核心和重要前提[9-10]。目前，篩選出主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、伯克氏菌屬（Burkholderia）、紅球菌屬（Rhodococcus）、鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、分支桿菌屬（Mycobacterium） 和氣單胞菌屬（Aeromonas）等[11-14]能夠降解異丙威或PAHs的微生物菌種，這類(lèi)大多為好氧微生物。2000年以來(lái)，一類(lèi)廣泛存在于海水、湖水、下水道、土壤、污泥等厭氧環(huán)境的硫酸鹽還原菌（Salfate reducing bacteria，SRB）為主要菌種的厭氧微生物降解研究，正逐漸變?yōu)闊狳c(diǎn)，并將其應(yīng)用于含PAHs的有機(jī)廢水處理中。但上述篩選的菌株主要是降解單一的PAHs或異丙威，但實(shí)際應(yīng)用環(huán)境大多是復(fù)合污染，因此，篩選出具有耐重金屬并可以降解PAHs或異丙威的微生物具有重要的研究意義和實(shí)用價(jià)值。

課題組從湖南省株洲市原清水塘工業(yè)區(qū)和湘潭市某農(nóng)藥廠污染場(chǎng)地土壤及水體樣品中篩選出耐鎘高效降解多環(huán)芳烴（菲、芘）或異丙威的菌種WLX8D和S-200，初步鑒定分別為意大利農(nóng)霉菌（Agromyces italicus）和硫酸鹽還原菌（Salfate reducing bacteria），并探究了這些菌種的降解特性和對(duì)鎘的耐受性，以期為土壤生態(tài)系統(tǒng)中重金屬有機(jī)污染的微生物修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌種來(lái)源 從湖南省湘潭市某農(nóng)藥廠和株洲原清水塘工業(yè)區(qū)污染場(chǎng)地收集土壤樣品（表層0～10 cm）及附近水體樣品，放入自封袋或無(wú)菌采樣瓶中，冰袋保溫，于4℃冰箱保存。

1.1.2 主要試劑及培養(yǎng)基 PAHs（菲、芘）、二氯甲烷、丙酮、環(huán)己烷等化學(xué)試劑，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司； 98%異丙威原藥（ 江蘇常隆化工有限公司）；高效液相試劑中，乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純 ；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）擴(kuò)增所用試劑（TAKARA公司）；柱式細(xì)菌DNA提取試劑盒（上海生工生物有限公司）。

1號(hào)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（No1.MSM）：（NH4）2SO4 1g/L，K2HPO4 0.8 g/L，KH2PO4 0.2 g/L，NaCl 20 g/L，MgSO4·7H2O 0.2 g/L，CaCl2·2H2O 0.1 g/L，微量元素FeSO4·7H2O 0.012 g/L，MnSO4·7H2O 0.003 g/L，ZnSO4·7H2O 0.003 g/L， （NH4）6Mo7O24·4H2O 0.001 g/L，CoSO4·7H2O 0.001 g/L，加蒸餾水溶解，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.2，121℃滅菌30 min，備用。

2號(hào)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基（No2.MSM）：K2HPO4 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，Na2SO4 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，加蒸餾水溶解，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 值為7.2～7.5，121℃高壓滅菌20 min。冷卻后，再加入經(jīng)過(guò)濾除菌的1 mL 1.2 %硫酸亞鐵銨，1mL 0.4%抗壞血酸。

有機(jī)污染物儲(chǔ)備液：稱(chēng)取適量菲、芘、異丙威等試劑溶解于100 mL 丙酮中，分別配制含菲、芘濃度為100 mg/L溶液，含異丙威濃度為10 mg/L溶液。

篩選培養(yǎng)基：適量以丙酮溶解的有機(jī)污染物儲(chǔ)備液及一定量的CdSO4溶液，加入已滅菌的MSM 培養(yǎng)基中，重復(fù)混勻后備用（固體培養(yǎng)基加入瓊脂濃度為18～20 g/L）。

篩選培養(yǎng)基：在已滅菌的MSM培養(yǎng)基中加入一定量的用丙酮溶解的有機(jī)污染物儲(chǔ)備液及一定量的CdSO4溶液，待丙酮揮發(fā)后備用。固體培養(yǎng)基為在每升液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加瓊脂18～20 g。

溶菌肉湯（Lysogeny broth，LB）培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，NaCl 10 g/L，瓊脂20 g/L，加蒸餾水溶解，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 值為7.0～7.2。

厭氧降解菌培養(yǎng)基：K2HPO4 0.5 g，NH4Cl 1.0 g，Na2SO4 0.5 g，CaCl2·2H2O 0.1 g，MgSO4·7H2O 2.0 g，乳酸鈉5 mL，酵母粉 1.0 g，加蒸餾水溶解，定容至1 L，調(diào)節(jié)pH 值為7.2～7.5，121℃高壓滅菌20 min。冷卻后，再加入經(jīng)過(guò)濾除菌的1 mL 1.2 %硫酸亞鐵銨、1mL 0.4%抗壞血酸。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 多環(huán)芳烴、異丙威降解菌的篩選 （1）好氧降解菌的篩選。供試土樣10 g加入裝有90 mL 液體No 1. MSM的500 mL三角瓶中，以PAHs或異丙威（菲、芘終濃度均為10 mg/L，異丙威終濃度為0.5 mg/L）為唯一碳源，30℃恒溫?fù)u床180 r/min富集培養(yǎng)5 d。移取富集培養(yǎng)液按10 mL接入裝有90 mL No 1. MSM的500 mL三角瓶中，以PAHs或異丙威（菲、芘終濃度均為25 mg/L，異丙威終濃度為1 mg/L）為唯一碳源再次富集培養(yǎng)5 d。將通過(guò)液體No 1. MSM富集的菌液依次稀釋至10-3～10-7，取0.1 mL 分別涂布在噴有PAHs和異丙威（菲、芘終濃度均為25 mg/L，異丙威濃度為1 mg/L）的LB 固體培養(yǎng)基上，30℃條件下培養(yǎng)24～72 h。每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行，挑取生長(zhǎng)好的菌落接入噴有PAHs（菲、芘終濃度均為25 mg/L，異丙威終濃度為1 mg/L）的LB固體培養(yǎng)基上，進(jìn)行多次劃線純化，最后將單菌落轉(zhuǎn)接到含有PAHs的LB固體試管斜面上，30℃恒溫箱培養(yǎng)48 h，于4℃冰箱保存。

（2）厭氧降解菌的篩選。供試土樣1g加入裝有90 mL 液體No 2. MSM的100 mL帶丁基橡膠塞的點(diǎn)滴瓶中， 以PAHs或異丙威（菲、芘終濃度均為10 mg/L，異丙威濃度為0.5mg/L）為唯一碳源，30℃恒溫?fù)u床50 r/min富集培養(yǎng)5 d。移取富集培養(yǎng)液按10 mL接入裝有90 mL No 2. MSM的100 mL帶T型丁基橡膠塞的點(diǎn)滴瓶中，以PAHs或異丙威（菲、芘終濃度均為25 mg/L，異丙威濃度為1 mg/L）為唯一碳源，再次靜置富集培養(yǎng)5 d。將通過(guò)液體No 2. MSM富集的菌液依次稀釋至10-3～10-7，取0.1 mL分別涂布在噴有PAHs和異丙威（菲、芘終濃度均為25 mg/L，異丙威濃度為1 mg/L）的雙層厭氧降解菌培養(yǎng)基上，35 ℃條件下靜置培養(yǎng)24～72 h，每個(gè)稀釋梯度做3個(gè)平行，挑取生長(zhǎng)好的菌落接入噴有PAHs或異丙威（菲、芘終濃度均為25 mg/L，異丙威終濃度為1 mg/L）的雙層厭氧降解菌培養(yǎng)基上，進(jìn)行劃線或涂布純化，最終將單菌落轉(zhuǎn)接到裝有厭氧降解菌液體培養(yǎng)基的帶T型丁基橡膠塞點(diǎn)滴瓶中，30℃恒溫箱靜置培養(yǎng)48 h后，于4 ℃冰箱保存。選取其中生長(zhǎng)最快的菌株作為高效降解PAHs或異丙威菌株，進(jìn)行下一步的研究，對(duì)其進(jìn)行生理生化和分子鑒定。

1.2.2 PAHs和異丙威的測(cè)定 PAHs的提取參照中華人民共和國(guó)國(guó)家環(huán)境保護(hù)標(biāo)準(zhǔn)（HJ 478.2009）。分析采用的高效液相色譜儀為Waters（1525），色譜柱為Waters 公司的PAHs Symmetry C18 分離柱，檢測(cè)采用Waters2475 熒光檢測(cè)器波長(zhǎng)切換功能測(cè)定。

異丙威的提取用丙酮溶解，以鄰苯二甲酯為內(nèi)標(biāo)物，使用火焰熱離子檢測(cè)器，對(duì)試樣中的異丙威進(jìn)行氣相色譜分離和測(cè)定，參照中華人民共和國(guó)化工行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（HG 2854—1997）。

1.2.3 菌種鑒定 利用平板劃線法和雙層平板法，在含芘、菲、異丙威的MSM平板上分離和純化篩選的降解菌，觀察培養(yǎng)2 d后的菌落形態(tài)特征和顯微形態(tài)特征。用Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（上海生物工程有限公司），提取降解菌的基因組DNA，利用通用引物27F、1492R對(duì)細(xì)菌16SrDNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。獲得的PCR 產(chǎn)物，送往擎科生物科技有限公司完成測(cè)序工作。通過(guò)BLAST程序?qū)⒔到饩?6S rDNA 基因序列，與GenBank 中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)分析，并參考《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)》對(duì)篩選出的菌株進(jìn)行形態(tài)觀察和生理生化分析，將降解菌鑒定到屬。

1.2.4 菌株降解目標(biāo)有機(jī)物試驗(yàn) 菌株降解芘試驗(yàn)：以各添加濃度為25mg/L芘為唯一碳源的液體NO1.MSM（pH=7.0～7.2）為基礎(chǔ)，分別將菌液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）接入培養(yǎng)基中（接種量4%），30℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，以不加任何菌株作為對(duì)照， 恒溫振蕩培養(yǎng)5、10、15 d。取樣分析芘殘留量， 每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。降解率公式（1）如下：

δ=100% × （K0－Kt）/ K0" " " " " " " " " " " " " " （1）

δ為降解率，K0為降解前有機(jī)污染物初始濃度，Kt為降解后有機(jī)污染物濃度。

菌株降解菲、異丙威試驗(yàn)：以各添加濃度為25 mg/L菲或 1 mg/L異丙威為唯一碳源的液體NO2.MSM培養(yǎng)基（pH=7.0～7.2）為基礎(chǔ)，分別將菌液（對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期）接入培養(yǎng)基中（接種量4%），30℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)，以不加任何菌株作為對(duì)照，恒溫振蕩培養(yǎng)5、10、15 d。取樣分析菲、異丙威殘留量，每個(gè)處理設(shè)3次重復(fù)。降解率公式如公式（1）所示。

1.2.5 降解菌株生長(zhǎng)曲線的測(cè)定 好氧降解菌生長(zhǎng)曲線：將篩選菌株接種于LB液體培養(yǎng)基中，搖床振蕩（30 ℃、180 r/min）培養(yǎng)活化24 h，取2 mL 菌液轉(zhuǎn)入盛有200 mL LB 液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30 ℃、180 r/min 振蕩培養(yǎng)。每隔4 h取出8 mL菌液，以LB液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌液的OD600值。

厭氧降解菌生長(zhǎng)曲線：將篩選出的降解菌株，接種于100 mL厭氧菌液體培養(yǎng)基帶丁基橡膠塞的點(diǎn)滴瓶中，30℃靜置培養(yǎng)活化24 h，取出20 mL 菌液轉(zhuǎn)入盛有500 mL厭氧菌液體培養(yǎng)基帶丁基橡膠塞的點(diǎn)滴瓶中，充分搖勻后30℃靜置培養(yǎng)，每隔4 h取出8 mL菌液，以未接種微生物的厭氧菌液體培養(yǎng)基作空白對(duì)照，測(cè)定不同培養(yǎng)時(shí)間菌液的OD600 值。

1.2.6 不同培養(yǎng)條件對(duì)降解菌株生長(zhǎng)的影響 （1）配制不同菲、芘濃度（ 5、15、25、50、100 mg/L） 或不同異丙威濃度（0.1、0.5、1、5、10 mg/L）的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，pH值7.0，然后分別按4%的接種量接入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，于30 ℃，180 r/min條件下振蕩或靜置培養(yǎng)，每2 d取一次樣，用分光光度計(jì)于600 nm 處測(cè)定光吸收值（OD600），試驗(yàn)做3個(gè)平行。

（2）配制菲、芘質(zhì)量濃度為25 mg/L或異丙威濃度為1mg/L的不同pH值（5、6、7、8、9）無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，同（1）所述條件培養(yǎng)、取樣、測(cè)OD600，并做3個(gè)平行。

（3）配制菲、芘質(zhì)量濃度為25 mg/L或異丙威濃度為1 mg/L，pH= 7.0的的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，然后分別按4%的接種量接入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，分別于不同培養(yǎng)溫度（20、25、30、35、40℃），180 r/min條件下，同（1）所述方式培養(yǎng)、取樣、測(cè)OD600，并做3個(gè)平行。

（4）配制菲、芘質(zhì)量濃度為25 mg/L或異丙威濃度1mg/L，pH時(shí)= 7.0的的無(wú)機(jī)鹽液體培養(yǎng)基，然后分別按不同接種量（2%、4%、6%、8%、10%）接入培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌液，同（1）所述條件培養(yǎng)、取樣、測(cè)OD600，并做3個(gè)平行。

1.2.7 降解菌鎘耐受能力測(cè)定 配制含鎘濃度分別為25、50、100、200 mg/L LB液體培養(yǎng)基或厭氧降解菌液體培養(yǎng)基，按5% 接種量接種降解菌液，30℃、180 r/min 遮光振蕩或厭氧靜置培養(yǎng)，5 d之內(nèi)間隔24 h測(cè)定菌液的OD600，每個(gè)處理重復(fù)3次，探究菌株對(duì)鎘的耐受能力。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010軟件對(duì)3次平行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和繪圖，利用SPSS 18.0軟件統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株形態(tài)與鑒定

利用1號(hào)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基通過(guò)篩選，從污染土壤樣品中分離得到1株能以芘為唯一碳源生長(zhǎng)的菌株，命名為 WLX8D， 該菌株在LB培養(yǎng)基中菌落呈深黃色，表面平滑，邊緣齊整，易挑起，顯微鏡下菌體呈短小桿狀，革蘭氏染色陽(yáng)性，老培養(yǎng)物革蘭氏染色呈陰性（菌落、鏡檢照片分別見(jiàn)圖1a和b）；通過(guò)菌株的形態(tài)、生理生化特性和16SrDNA分析，初步確定菌株WLX8D系統(tǒng)發(fā)育地位屬于細(xì)菌，在生物學(xué)上的分類(lèi)屬于意大利農(nóng)霉菌（Agromyces italicus）。

利用2號(hào)無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基通過(guò)篩選從污染土壤樣品中分離得到一株分別能以菲或異丙威，作為唯一碳源生長(zhǎng)的厭氧菌種，命名為S-200，厭氧降解菌培養(yǎng)基雙層平板中菌落所在處呈黑色，表面平滑，邊緣齊整，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)菌落在培養(yǎng)基中的顏色越來(lái)越深，顯微鏡下菌體呈桿狀，革蘭氏染色陰性（菌落、鏡檢照片分別見(jiàn)圖1c和d）；通過(guò)菌株的形態(tài)、生理生化特性和16S rDNA分析，初步確定菌株S-200為硫酸鹽還原菌（Sulfate-reducing bacteria， SRB）。

2.2 菌株的降解特性

2.2.1 菌株WLX8D對(duì)芘的降解 由圖2可見(jiàn)，在不同培養(yǎng)時(shí)間條件下，菌株WLX8D對(duì)25 mg/L芘的降解程度不同：培養(yǎng)到5、10、15 d時(shí)，芘的降解率分別達(dá)5.8%、22.5%、32.8%，說(shuō)明菌株WLX8D具備降解PAHs芘的能力。

2.2.2 菌株S-200對(duì)菲的降解 由圖2可見(jiàn)，在不同培養(yǎng)時(shí)間條件下，菌株S-200對(duì)初始濃度為25 mg/L菲的降解程度不同，培養(yǎng)到5、10、15 d時(shí)，菲降解率分別達(dá)16.6%、53.6%、47.9%，這是由于PAHs芘對(duì)細(xì)菌體有一定的毒性，隨著細(xì)菌體內(nèi)毒素的積累，新陳代謝變慢，降解效率有所下降，同時(shí)，說(shuō)明菌株S-200具有降解PAHs菲的能力。

2.2.3 菌株S-200對(duì)異丙威的降解 降解異丙威的菌種S-200，在以異丙威為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基進(jìn)行代謝活動(dòng)。厭氧條件下，不斷消耗溶液內(nèi)的碳源，即對(duì)溶液中初始濃度為1 mg/L的異丙威進(jìn)行降解，培養(yǎng)到5、10、15 d時(shí)，異丙威降解率分別達(dá)11.5%、63.5%、66.7%（圖2），可見(jiàn)隨著細(xì)菌數(shù)目增加，溶液中碳源的減少，有毒副產(chǎn)物增加，導(dǎo)致降解效率增長(zhǎng)緩慢，同時(shí)，說(shuō)明菌株S-200對(duì)異丙威具備一定的降解能力。

2.3 降解菌的生長(zhǎng)曲線

2.3.1 菌株WLX8D生長(zhǎng)曲線 測(cè)定了芘降解菌株WLX8D在LB培養(yǎng)基中62 h內(nèi)的生長(zhǎng)量，結(jié)果表明，該菌株生長(zhǎng)較快，接種4 h后就度過(guò)生長(zhǎng)延緩期，并于4～20 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，在20～58 h之間進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，于58 h后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期（圖3a）。

2.3.2 菌株S-200生長(zhǎng)曲線 測(cè)定了菲、異丙威降解菌S-200在厭氧降解菌培養(yǎng)基中，30 h內(nèi)的生長(zhǎng)量，結(jié)果表明，0～4 h為菌株的延緩期，在培養(yǎng)的4～10 h，為菌株的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，10～22 h之間進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期，從22 h開(kāi)始進(jìn)入衰亡期（圖3b）。該菌種生長(zhǎng)迅速，反應(yīng)速率快，但對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗也較大，而且產(chǎn)生抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的毒物濃度愈來(lái)愈大，細(xì)胞死亡速率大于生長(zhǎng)速率，細(xì)菌總數(shù)減少。

2.4 不同培養(yǎng)條件對(duì)降解菌生長(zhǎng)的影響

2.4.1 不同芘初始濃度對(duì)菌株WLX8D生長(zhǎng)的影響 由圖4a可知，溶液中芘的濃度低于25 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)受到芘的毒害較輕，菌株生長(zhǎng)較好，而芘濃度高于50 mg/L時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到芘的毒害影響較大，培養(yǎng)10 d后生長(zhǎng)量下降較快。而菌株在100 mg/L芘濃度條件下，0～8 d菌株緩慢生長(zhǎng)，8～12 d內(nèi)生物量幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)，12 d后生物量逐步降低，說(shuō)明該菌株生長(zhǎng)受到高濃度芘嚴(yán)重抑制。

2.4.2 pH值對(duì)菌株WLX8D生長(zhǎng)的影響 圖4b結(jié)果表明，菌株WLX8D在pH值為5、6和9時(shí)生長(zhǎng)量較低，pH值為7和8時(shí)生長(zhǎng)量較高，表明WLX8D適合在中性至弱堿性環(huán)境中生長(zhǎng)。

2.4.3 培養(yǎng)溫度對(duì)菌株WLX8D生長(zhǎng)的影響 圖4c結(jié)果表明，菌株在30、35℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)明顯高于其他溫度條件下的生物量，其中菌株在30℃培養(yǎng)條件下的生長(zhǎng)比35℃時(shí)的生長(zhǎng)更加穩(wěn)定。

2.4.4 接種量對(duì)菌株WLX8D生長(zhǎng)量的影響 由圖4d可知，接種量8%、10%的生物量在培養(yǎng)2～8 d內(nèi)生物量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其他接種量，說(shuō)明接種量越大，菌株適應(yīng)環(huán)境的能力越強(qiáng)，而接種量6%的溶液中菌株在培養(yǎng)2～14 d中生物量較為穩(wěn)定，甚至在培養(yǎng)14～16 d時(shí)，生物量一度高于接種量8%、10%的生物量。營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)常是環(huán)境中PAHs降解的限制因子，由于菌株數(shù)量大，生長(zhǎng)快速，大量消耗溶液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)2 d后，接種量8%和10%的生物量迅速下降。接種量6%的菌株在培養(yǎng)2～14 d時(shí)的生物量平穩(wěn)提升，直到14 d后快速下降，而接種量4%的菌株在培養(yǎng)10 d后生物量的增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。

2.4.5 不同菲初始濃度對(duì)菌株S-200生長(zhǎng)的影響 由圖5a可知，溶液中菲的濃度低于50 mg/L時(shí)，生長(zhǎng)受到菲的毒害較輕，菌株能夠較好的適應(yīng)環(huán)境，且濃度越低，生物量越大。培養(yǎng)20 d后，菲濃度高于50 mg/L培養(yǎng)基中的菌株生物量只有低于50 mg/L濃度培養(yǎng)基中生物量的一半。菌株在高濃度菲（100 mg/L）條件下，0～8 d內(nèi)生物量一直在減少，10 d后生物量很低，幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)。

2.4.6 不同異丙威初始濃度對(duì)菌株S-200生長(zhǎng)的影響 由圖6a可知，異丙威初始濃度在高濃度的5、10 mg/L范圍內(nèi)對(duì)菌株S-200生長(zhǎng)的影響明顯，在開(kāi)始培養(yǎng)4 d中，菌株生物量增長(zhǎng)較快，由于異丙威作為菌株唯一的碳源，在氨基甲酸酯類(lèi)農(nóng)藥中屬于中等毒性，一般濃度越高可被菌株利用的物質(zhì)就越多，這說(shuō)明所篩選的S-200能較好的適應(yīng)異丙威，直到6 d后，在這2個(gè)異丙威初始濃度的菌株生物量持續(xù)下降，可能是菌株在可利用物質(zhì)充足的情況下，產(chǎn)生的大量代謝副產(chǎn)物，對(duì)菌株產(chǎn)生一定的毒害所導(dǎo)致。而在異丙威初始濃度0.1 mg/L濃度生長(zhǎng)菌株的生物量是經(jīng)歷了培養(yǎng)4 d后快速增長(zhǎng)后，持續(xù)下降，可能是培養(yǎng)液中碳源不足，造成菌株死亡，菌種降解異丙威最適初始濃度為1 mg/L。

2.4.7 pH值對(duì)菌株S-200生長(zhǎng)的影響 在SRB代謝活動(dòng)中，pH值主要影響硫酸鹽還原酶系的構(gòu)象、性質(zhì)、生物學(xué)活性與穩(wěn)定性，引起細(xì)胞膜電荷的改變[15]。 pH值對(duì)菌株S-200生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)結(jié)果表明，S-200對(duì)pH值的適應(yīng)范圍較小，僅在pH值為6 ～ 8之間生長(zhǎng)較好，菌株S-200的最適pH值為7（圖5b）。而以異丙威（1 mg/L）為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，S-200在不同pH條件下生長(zhǎng)情況，如圖6b所示，S-200對(duì)pH值的適應(yīng)范圍偏弱堿性，pH值為7～8之間生長(zhǎng)較好，其他pH值條件下，菌株生長(zhǎng)遲緩，菌株在異丙威脅迫條件下，生長(zhǎng)最適pH值為7。

2.4.8 不同溫度對(duì)菌株S-200生長(zhǎng)的影響 溫度直接影響SRB的生長(zhǎng)速度及代謝活動(dòng)。溫度太低抑制了細(xì)胞內(nèi)酶的活性，SRB不生長(zhǎng)或生長(zhǎng)緩慢，溫度過(guò)高則會(huì)使得細(xì)胞中的大分子物質(zhì)如蛋白質(zhì)、核酸及其他生物活性物質(zhì)發(fā)生不可逆改變，參與生化反應(yīng)的功能喪失，甚至導(dǎo)致SRB死亡[16]。試驗(yàn)結(jié)果表明，菌株在30、35℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)明顯高于其他溫度條件下的生物量，其中菌株在30℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)最佳（圖5c）。另外，如圖6c所示，以異丙威（1 mg/L）為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，S-200在不同溫度條件下生長(zhǎng)情況：過(guò)高或過(guò)低的培養(yǎng)溫度對(duì)菌株的生長(zhǎng)影響較大，20、40℃培養(yǎng)條件下，菌株生長(zhǎng)緩慢，但菌株在30、35℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)量明顯高于其他溫度條件下的生物量，其中菌株在30℃培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)最佳。

目前人們分離的SRB多為中溫性菌，可生長(zhǎng)溫度為20～45℃，最適宜生長(zhǎng)溫度為28～38℃[17]。根據(jù)試驗(yàn)分離的S-200在不同溫度下的生長(zhǎng)情況，該菌種的生長(zhǎng)溫度范圍較寬，在20～40℃均能生長(zhǎng)，其中在30～40℃生長(zhǎng)速度較快，這與前人的研究結(jié)果基本一致。

2.4.9 不同接種量對(duì)菌株S-200生長(zhǎng)的影響 由圖5d可知，接種量8%、10%的生物量在4 d內(nèi)增長(zhǎng)速度較快，而接種量2%的菌株，培養(yǎng)14 d后生物量有所增加，說(shuō)明接種量越大，菌株適應(yīng)環(huán)境的能力越強(qiáng)。微生物降解PAHs反應(yīng)的第一步氧化即苯環(huán)的加氧，如果營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，此后降解進(jìn)程加快，沒(méi)有或很少有中間代謝物的積累。但營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)常是環(huán)境中PAHs降解的限制因子，由于菌株數(shù)量大，生長(zhǎng)快速，大量消耗溶液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，導(dǎo)致培養(yǎng)4 d后，接種量8%的生物量迅速下降，接種量10%的生物量幾乎沒(méi)有增長(zhǎng)。接種量6%的菌株在培養(yǎng)10 d后的生物量快速升高，而接種量4%的菌株在培養(yǎng)10 d后生物量的增長(zhǎng)趨于平穩(wěn)。

由圖6d可知，以異丙威（1 mg/L）為唯一碳源的無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，S-200在不同接種量條件下生長(zhǎng)情況。S-200在培養(yǎng)2 d后迅速生長(zhǎng)，在10 d后生長(zhǎng)趨于平穩(wěn)，接種量大小與菌株生長(zhǎng)OD600呈正比例關(guān)系，其中10%接種量的溶液中菌種的生物量是2%接種量溶液中生物量的5倍左右，而2%接種量的溶液中菌株培養(yǎng)4 d后，生長(zhǎng)持續(xù)遲緩，說(shuō)明接種量過(guò)低，菌株難以適應(yīng)異丙威脅迫環(huán)境。

2.5 降解菌的耐鎘特性

如圖7a所示，在鎘濃度為25～100 mg/L時(shí)，菌株WLX8D的生長(zhǎng)均較好，菌株具有相對(duì)較強(qiáng)的鎘耐受性，但隨著培養(yǎng)基中鎘濃度的增加，鎘濃度為200 mg/L時(shí)，WLX8D生長(zhǎng)緩慢，說(shuō)明高濃度的鎘對(duì)菌株WLX8D生長(zhǎng)有一定抑制作用。菌種S-200在培養(yǎng)62 h后，隨著培養(yǎng)基中鎘濃度的增加，在鎘濃度為25～200 mg/L時(shí)，生物量增加，特別是25～50mg/L鎘濃度菌液中的生物量顯著增加，說(shuō)明S-200在62 h后，逐步適應(yīng)含鎘環(huán)境，S-200能耐受的鎘濃度范圍為25～200 mg/L（圖7b）。

3 討論與結(jié)論

（1）從農(nóng)藥廠和工業(yè)污染區(qū)土壤和水體中篩選出降解芘的意大利農(nóng)霉菌WLX8D，在初始濃度為25 mg/L 芘作為唯一碳源的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中，培養(yǎng)15 d后，對(duì)芘的降解率可達(dá)32.8%。該研究首次將獲得的意大利農(nóng)霉菌用于降解PAHs芘；篩選出高效降解異丙威、菲的硫酸鹽還原菌S-200，在以25 mg/L菲或1 mg/L異丙威為唯一碳源的液體無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基中培養(yǎng)15 d后，對(duì)菲、異丙威的降解率分別可達(dá)53.6%和66.7%。

（2）菌株WLX8D、S-200對(duì)液體培養(yǎng)基中芘、菲、異丙威的降解依賴(lài)于其生物量的增加，2菌株對(duì)芘、菲、異丙威的作用濃度和耐鎘濃度范圍廣，分別可降解25～100 mg/L范圍的芘、菲和0.1～10 mg/L范圍的異丙威，S-200對(duì)異丙威降解作用顯著。同時(shí)，2菌株在含鎘濃度25～100 mg/L的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好。因此，降解菌WLX8D、S-200在鎘和PAHs復(fù)合污染環(huán)境的修復(fù)方面具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 趙文晉，李 明，顧桂飛，等. 異丙威和啶蟲(chóng)脒在稻田土壤及水稻中的殘留檢測(cè)與消解動(dòng)態(tài)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2019，47（8）：220-224.

[2] MWILA K， BURTON M H， VAN DYK J S， et al. The effect of mixtures of organophosphate and carbamate pesticides on acetylcholinesterase and application of chemometrics to identify pesticides in mixtures[J]. Environmental Monitoring and Assessment， 2013， 185（3）： 2315-2327.

[3] 黃興如，張彩文，張瑞杰，等. 多環(huán)芳烴降解菌的篩選、鑒定及降解特性[J]. 微生物學(xué)通報(bào)，2016，43（5）：965-973.

[4] HARITASH A K，KAUSHIK C P. Biodegradation aspects of polycyclic aromatic hydrocarbons （PAHs）：a review [J]. Journal of Hazardous Materials，2009，169（13）：1-15.

[5] Larry K，William T. ES amp; T special report： priority pollutants： I-aperspective view[J]. Environmental Science amp; Technology， 1979，13（4）： 416-423.

[6] 郭楚玲，鄭天凌，洪華生，等. 多環(huán)芳烴的微生物降解與生物修復(fù)[J]. 海洋環(huán)境科學(xué)，2000，19（3）：24- 29.

[7] 鞏宗強(qiáng)， 李培軍， 王 新，等. 芘在土壤中的代謝降解研究[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)， 2001， 12（ 3）： 447- 450.

[8] RAVELET C，KRIVOBOK S，SAGE L，et al. Biodegradation of pyrene by sediment fungi[J]. Chemosphere，2000，40：557-563.

[9] KARL J. ROCKNE and STUART E. STRAND Anaerobic biodegradation of naphthalene， phenanthrene， and biphenyl by a denitrifying enrichment culture[J]. Water Research，2001，35（1）： 291-299.

[10] 張 杰，劉永生，孟 玲，等. 多環(huán)芳烴降解菌的分離與鑒定[J]. 應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2003，14（10）：1783-1786.

[11] LIN M，HU X K，CHEN W W，et al. Biodegradation of phenanthrene by Pseudomonas sp. BZ-3，isolated from crude oil contaminated soil[J]. International Biodeterioration amp; Biodegradation，2014，94： 176-181.

[12] FINKELSTEIN Z I，BASKUNOV B P，GOLOVLEV E L，et al. Fluorene transformation by bacteria of the genus Rhodococcus[J]. Microbiology，2003，72（6）：660-665.

[13] 李全霞，范丙全，龔明波，等. 降解芘的分枝桿菌M11 的分離鑒定和降解特性[J]. 環(huán)境科學(xué)，2008，29（3）：763-768.

[14] ROY M，KHARA P，DUTTA T K. meta-Cleavage of hydroxynaphthoic acids in the degradation of phenanthrene by Sphingobium sp.strain PNB[J]. Microbiology， 2012， 158（3）： 685-695.

[15] 王玉雙，李一路，郭照輝，等． 高耐鎘硫酸鹽還原菌群的特性研究[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2018，46（ 3） ： 238 -240，245．

[16] 齊瑞鵬，張 磊，顏永毫，等．定容重條件下生物炭對(duì)半干旱區(qū)土壤水分入滲特征的影響[J]．應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào)，2014，25：（ 8）：2281 - 2288．

[17] BARNES R T，GALLAGHE M E，MASIELLO C A，et al． Biochar-induced changes in soil hydraulic conductivity and dissolved nutrient fluxes constrained by laborary experiments [J]．PLoS One，2014，9（ 9）：e108340．

（責(zé)任編輯：高國(guó)賦）