Klebsiella aerogenes的胞外聚合物產(chǎn)量優(yōu)化及其對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控作用

胡南，姚順超，李艾書, ，朱家華，段重達(dá)，李廣悅，楊志輝，丁德馨

(1. 南華大學(xué) 鈾礦冶生物技術(shù)國防重點(diǎn)學(xué)科實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽，421001；2. 中南大學(xué) 冶金與環(huán)境學(xué)院，湖南 長沙，410083)

微生物誘導(dǎo)碳酸鈣沉淀技術(shù)(microbial induced calcium carbonate precipitation, MICP)能快速生成具有膠凝性的碳酸鈣晶體，改善土體力學(xué)性質(zhì)，對(duì)原位環(huán)境擾動(dòng)小、成本低、效率高，在土體加固、有害物質(zhì)固定等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和較高的研究價(jià)值[1-3]。目前，提高微生物誘導(dǎo)形成的固化體的力學(xué)強(qiáng)度仍是亟需解決的重要問題。

國內(nèi)外的研究主要集中在通過調(diào)控溫度、pH、鈣離子濃度、菌液濃度和土體性質(zhì)等以提高固化體的力學(xué)強(qiáng)度[4-8]。然而，微生物的代謝活動(dòng)在MICP過程中起到至關(guān)重要的作用，其代謝產(chǎn)物會(huì)影響碳酸鈣晶體的晶型和形貌[9]。胞外聚合物(extracellular polymeric substances, EPS)是微生物新陳代謝過程中分泌的高分子聚合物[10]，主要成分為蛋白質(zhì)和多糖，以及少量的核酸、脂類和其他物質(zhì)[11]，具有良好的吸附性能、生物降解性和親疏水性[12-13]，在MICP過程中起著重要作用[14]。由于微生物種類和EPS 組分的差異性，誘導(dǎo)形成的碳酸鈣晶體具有不同形貌和晶型。TOURNEY等[15]研究了地衣芽抱桿菌(Bacilluslichehiformis)的EPS對(duì)碳酸鈣晶型和形貌的調(diào)控作用，發(fā)現(xiàn)對(duì)照組和去EPS 組均誘導(dǎo)了球霰石型碳酸鈣，而未去EPS組及添加EPS 組均僅誘導(dǎo)了方解石型碳酸鈣。LIAN 等[16]通過研究發(fā)現(xiàn)，巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的EPS 可誘導(dǎo)合成多孔狀的方解石型碳酸鈣。GU等[17]的研究表明，方解石型碳酸鈣熱力學(xué)穩(wěn)定，可提高M(jìn)ICP固化體的力學(xué)強(qiáng)度，而球霰石型碳酸鈣熱力學(xué)穩(wěn)定性差，在顆粒間無法形成穩(wěn)定狀態(tài)，形成的固化體力學(xué)強(qiáng)度低[18]。目前，利用微生物的尿素水解反應(yīng)進(jìn)行的MICP存在氯化銨的二次污染物和堿化土壤等問題，因此，篩選通過氧化反應(yīng)原理進(jìn)行MICP的菌種，優(yōu)化其EPS的產(chǎn)量，并系統(tǒng)地研究EPS 在碳酸鈣礦化過程中的作用機(jī)制以及對(duì)碳酸鈣晶型的調(diào)控機(jī)理，使碳酸鈣晶體向熱力學(xué)穩(wěn)定的方解石型碳酸鈣晶體轉(zhuǎn)化，從而提高微生物誘導(dǎo)形成的固化體的力學(xué)強(qiáng)度，對(duì)采用MICP技術(shù)原位綠色處理固體廢物具有重要意義。

本文作者以能通過氧化反應(yīng)進(jìn)行碳酸鹽礦化的Klebsiellaaerogene為研究對(duì)象，擬通過響應(yīng)面法確定Klebsiellaaerogene的EPS的最優(yōu)培養(yǎng)條件，并開展EPS 對(duì)Klebsiellaaerogene誘導(dǎo)形成碳酸鈣晶型的影響試驗(yàn)研究，揭示EPS 在碳酸鈣晶體形成過程中的作用機(jī)理，以便為提高微生物誘導(dǎo)形成的固化體的力學(xué)強(qiáng)度提供新的思路。

1 材料和方法

1.1 菌株培養(yǎng)

試驗(yàn)菌株采用碳酸鹽礦化菌株，從湖南省某實(shí)驗(yàn)室附近土壤篩選而來，鑒定為產(chǎn)氣克雷伯氏桿菌(Klebsiellaaerogenes)，由微生物保藏中心(武漢)保存。該菌誘導(dǎo)生成碳酸鈣晶體的反應(yīng)機(jī)制為：

EPS產(chǎn)量優(yōu)化培養(yǎng)基為：20 g/L乙酸鈉，4 g/L酵母浸粉，pH=7，于121 ℃滅菌20 min。MICP培養(yǎng)基為：17.5 g/L乙酸鈣，4 g/L酵母浸粉，pH=7，于121 ℃滅菌20 min。

1.2 EPS的提取、測定與表征

試驗(yàn)采用改進(jìn)的加熱法提取菌株EPS 溶液[19]，經(jīng)冷凍干燥得到EPS固體粉末，均置于-20 ℃冰箱中低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

以EPS 中多糖和蛋白的含量表示EPS 的產(chǎn)量。以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)，采用改進(jìn)的苯酚硫酸比色測定多糖含量[20]。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，采用Bicinchoninic Acid 試劑盒(Thermo)測定蛋白含量。測試結(jié)果均取3次平行試驗(yàn)的平均值。

采用傅里葉變換紅外光譜儀(Nicoletis10,Thermo)進(jìn)行EPS 的紅外光譜分析，取冷凍干燥后的EPS 固體樣品與KBr 以質(zhì)量比1∶100 混合并研磨，然后對(duì)研磨后的粉末進(jìn)行壓片，在波數(shù)為400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描20次。

1.3 EPS產(chǎn)量的單因素優(yōu)化

以培養(yǎng)時(shí)間(A)、培養(yǎng)溫度(B)、接種量(C)和pH(D)為單因素，研究它們對(duì)EPS產(chǎn)量的影響。在100 mL 的EPS 產(chǎn)量優(yōu)化培養(yǎng)基中添加波長600 nm處的吸光值為1的已活化菌液，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱(100 r/min)培養(yǎng)一定時(shí)間后，提取EPS并測定蛋白和多糖的含量。在培養(yǎng)周期內(nèi)不再補(bǔ)加碳源，設(shè)置各因素優(yōu)化條件的參數(shù)范圍，具體試驗(yàn)分組見表1。

表1 單因素優(yōu)化試驗(yàn)分組Table 1 One-factor optimized experimental grouping

1.4 EPS產(chǎn)量的響應(yīng)面優(yōu)化

基于前期單因素試驗(yàn)，采用Box-Be-hnken 法進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)的設(shè)計(jì)，以胞外蛋白和胞外多糖含量為響應(yīng)值，響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及其水平如表2所示。利用Design Expert 軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，通過建立二次響應(yīng)面回歸模型，得到影響EPS 產(chǎn)量的因素和水平最優(yōu)組合，進(jìn)而得到EPS 產(chǎn)量的最優(yōu)培養(yǎng)條件。在最優(yōu)條件下，培養(yǎng)Klebsiella aerogenes，提取EPS，測定蛋白和多糖的含量，并與預(yù)測值進(jìn)行比較。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素及其水平Table 2 Response face design factors, levels and codes

1.5 EPS對(duì)Klebsiella aerogenes誘導(dǎo)形成碳酸鈣晶體的影響

在100 mL 的MICP 培養(yǎng)基中添加1%(體積分?jǐn)?shù))已活化菌液，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱在溫度為30 ℃、轉(zhuǎn)速為100 r/min條件下培養(yǎng)3 d，然后，在無菌操作臺(tái)中向錐形瓶里添加質(zhì)量濃度分別為0.1、0.5 和1.0 g/L的EPS 固體粉末，置于恒溫振蕩培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)5 d。每組試驗(yàn)均設(shè)3 個(gè)平行樣。試驗(yàn)結(jié)束后，使用超聲波震蕩將錐形瓶內(nèi)壁上吸附的碳酸鈣晶體顆粒剝離下來，然后將溶液以加速度4 000g離心5 min，棄上清液，將下層沉淀置于70 ℃烘箱中烘干。

1.6 碳酸鈣晶體的表征

采用X 射線衍射儀(D8 ADVANCE, Bruker Technology)進(jìn)行碳酸鈣晶型分析，步長為2θ，范圍為10°～80°。稱取10 mg 沉淀溶于10 mL 去離子水中，用超聲波分散10 min，調(diào)整溶液pH=6，吸取2 mL 溶液，在20 ℃下，采用Zeta 電位分析儀(90Plus PALS, Bruker Technology)測量碳酸鈣晶體懸濁液的Zeta 電位，每個(gè)樣品測量3 次取平均值。采用掃描電鏡(QUATAN250, Thermo)在加速電壓為25 kV下進(jìn)行碳酸鈣晶體的形貌分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 EPS產(chǎn)量的單因素優(yōu)化

2.1.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)時(shí)間對(duì)EPS 產(chǎn)量的影響如圖1(a)所示。從圖1(a)可見：在培養(yǎng)0～5 d 時(shí)，EPS 產(chǎn)量隨著時(shí)間的延長而增加，其中培養(yǎng)1～2 d 時(shí)產(chǎn)量增加最快，最大達(dá)到2.78 mg/(L·h)，這可能是因?yàn)镵lebsiellaaerogenes通過1 d 的增殖作用后，隨著菌體數(shù)量的不斷增加，大量高活力的菌體能夠在充裕的碳源下進(jìn)行生長代謝，同時(shí)快速地合成了大量的EPS；當(dāng)培養(yǎng)5 d時(shí)，EPS的產(chǎn)量達(dá)到峰值，為175.02 mg/L，其中，蛋白質(zhì)量濃度為109.78 mg/L，多糖質(zhì)量濃度為65.24 mg/L；進(jìn)一步延長培養(yǎng)時(shí)間，蛋白和多糖產(chǎn)量均逐漸降低，其原因可能是培養(yǎng)后期營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，EPS 產(chǎn)量降低。因此，Klebsiellaaerogenes的EPS的優(yōu)選培養(yǎng)時(shí)間為5 d。

圖1 不同因素對(duì)EPS產(chǎn)量的影響Fig. 1 Effect of different factors on EPS production

2.1.2 培養(yǎng)溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

培養(yǎng)溫度對(duì)EPS產(chǎn)量的影響如圖1(b)所示。從圖1(b)可見：EPS 產(chǎn)量隨著培養(yǎng)溫度的升高而增加，30 ℃時(shí)達(dá)到最高值，達(dá)到114.72 mg/L，其中，蛋白質(zhì)量濃度為65.19 mg/L，多糖質(zhì)量濃度為49.53 mg/L；但進(jìn)一步提高培養(yǎng)溫度時(shí)，EPS 產(chǎn)量逐漸降低。這是因?yàn)楫?dāng)溫度為40 ℃時(shí)，細(xì)菌生長慢，合成的蛋白質(zhì)、核酸、細(xì)胞壁和細(xì)胞膜會(huì)因?yàn)槭軣岫冃曰蚬袒?，?xì)胞新陳代謝受阻，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[21]。這表明溫度是影響細(xì)菌生長的重要因素，較低的溫度會(huì)限制細(xì)菌的生長、酶活性和代謝，較高的溫度也會(huì)對(duì)細(xì)菌生長產(chǎn)生負(fù)面作用。因此，Klebsiellaaerogenes的EPS 的優(yōu)選培養(yǎng)溫度為30 ℃。

2.1.3 接種量對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

接種量對(duì)EPS 產(chǎn)量的影響如圖1(c)所示。從圖1(c)可見：當(dāng)接種量在1%～3%時(shí)，EPS 產(chǎn)量隨著接種量的增加而增加，在接種量為3%時(shí)達(dá)到峰值，為130.27 mg/L，其中，蛋白質(zhì)量濃度為79.08 mg/L，多糖質(zhì)量濃度為51.19 mg/L；進(jìn)一步加大接種量，EPS產(chǎn)量緩慢下降，這可能是因?yàn)榻臃N量過少使菌體生長延緩，而接種量過高造成菌體生長過快，營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、溶解氧不足，導(dǎo)致EPS 含量下降[22]。因此，Klebsiellaaerogenes的EPS的優(yōu)選接種量為3%。

2.1.4 pH對(duì)EPS產(chǎn)量的影響

pH對(duì)EPS產(chǎn)量的影響如圖1(d)所示。從圖1(d)可見：當(dāng)pH 為5.5 時(shí)，菌體無法存活，無EPS 產(chǎn)生；提高培養(yǎng)基的pH，EPS 產(chǎn)量增加，當(dāng)pH 為7.5時(shí)達(dá)到最大，為123.10 mg/L，其中，蛋白質(zhì)量濃度74.78 mg/L，多糖質(zhì)量濃度48.30 mg/L；進(jìn)一步提高pH，EPS 產(chǎn)量隨之下降。這可能是因?yàn)榫赀m宜在中性及偏微堿性環(huán)境下生長。因此，Klebsiellaaerogenes的EPS的優(yōu)選pH為7.5。

2.2 EPS產(chǎn)量的響應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

根據(jù)單因素的試驗(yàn)結(jié)果，共設(shè)計(jì)了29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)面試驗(yàn)方案，結(jié)果如表3所示。對(duì)表3中數(shù)據(jù)經(jīng)Design Expert 軟件分析后獲得Klebsiella aerogenes胞外蛋白和胞外多糖產(chǎn)量的多元二次響應(yīng)面回歸模型分別為：

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及其結(jié)果Table 3 Design and results of response surface test

式中：Y1和Y2分別為胞外蛋白和多糖產(chǎn)量，mg/L。

對(duì)上述回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表4所示。從表4 可見：胞外蛋白產(chǎn)量模型的確定系數(shù)R2=0.992 4，調(diào)整確定系數(shù)為0.984 8，表明此模型能夠反映98.48%的胞外蛋白變化；胞外多糖產(chǎn)量模型的確定系數(shù)R2=0.959 7，調(diào)整確定系數(shù)為0.919 5，表明此模型能夠反映91.95%的胞外多糖變化，二者的確定系數(shù)都接近于1，表明模型擬合良好，預(yù)測可靠性高；胞外蛋白和胞外多糖產(chǎn)量的模型整體均高度顯著(P＜0.01)，且無失擬項(xiàng)因素存在(P＞0.05)。由F值可知，單因素對(duì)胞外蛋白產(chǎn)量的影響從大到小的順序?yàn)锽、A、C、D，對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響從大到小的順序?yàn)锳、B、D、C。不同因素的交互作用對(duì)胞外蛋白和胞外多糖產(chǎn)量的影響如圖2所示。響應(yīng)面圖能夠直觀反映各因素之間的交互影響。響應(yīng)面坡度越陡，因素間交互作用影響越顯著，反之，則越不顯著。響應(yīng)面圖底部為等高線，等高線越接近圓形因素間交互作用影響越不明顯，越接近橢圓形則越顯著。結(jié)合響應(yīng)面圖和等高線可以看出：各因素間的交互作用對(duì)Klebsiellaaerogenes分泌胞外蛋白產(chǎn)量的影響從大到小的順序?yàn)锳B＞BD＞AD＞AC＞BC＞CD，對(duì)胞外多糖產(chǎn)量的影響從大到小的順序?yàn)锳B＞AC＞BD＞BC＞AD＞CD，說明相比于pH 和接種量的交互作用，培養(yǎng)時(shí)間和培養(yǎng)溫度的交互作用影響更顯著。

表4 不同因素對(duì)胞外蛋白(EP)和胞外多糖(EX)產(chǎn)量影響的響應(yīng)面模型的方差分析Table 4 ANOVA of response surface models for effects of different factors on extracellular protein(EP) and extracellular polysaccharide(EX) yields

2.2.2 驗(yàn)證試驗(yàn)

通過回歸模型的預(yù)測得到Klebsiellaaerogenes的EPS 最優(yōu)的培養(yǎng)條件如下：培養(yǎng)時(shí)間為4.64 d，培養(yǎng)溫度為28.35 ℃，接種量為2.97%，pH=7.69，在此最優(yōu)條件下，胞外蛋白和胞外多糖產(chǎn)量的預(yù)測響應(yīng)值分別為120.28 mg/L 和87.74 mg/L。為檢驗(yàn)預(yù)測模型的可靠性，在最優(yōu)條件下培養(yǎng)Klebsiellaaerogenes，得到胞外蛋白和胞外多糖產(chǎn)量的實(shí)際檢測值分別為122.03 mg/L和88.21 mg/L?？梢?，試驗(yàn)檢測值與理論預(yù)測值非常接近，并顯著高于單因素優(yōu)化條件下的EPS 產(chǎn)量。因此，通過響應(yīng)面優(yōu)化分析建立的胞外蛋白和胞外多糖產(chǎn)量回歸模型能較好地預(yù)測Klebsiellaaerogenes的EPS產(chǎn)量。

2.3 EPS 對(duì) Klebsiella aerogenes 誘導(dǎo)形成碳酸鈣晶體的影響

2.3.1 X射線衍射（XRD）分析

添加不同質(zhì)量濃度EPS 后，Klebsiellaaerogenes 通過MICP 形成的碳酸鈣晶體的XRD 譜圖如圖3所示。由圖3可知：生成的碳酸鈣晶體主要產(chǎn)物包含球霰石和方解石2種晶型；隨著EPS質(zhì)量濃度增加，碳酸鈣晶體的XRD 譜圖中球霰石的衍射峰強(qiáng)度逐漸減小，而方解石的衍射峰強(qiáng)度逐漸增大。碳酸鈣晶體中球霰石和方解石的含量如圖4所示。從圖4可見：與對(duì)照組相比，當(dāng)添加的EPS 質(zhì)量濃度增加到1.0 g/L 時(shí)，Klebsiella aerogenes誘導(dǎo)形成方解石的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從27.1%增加到98.3%，球霰石的質(zhì)量分?jǐn)?shù)從72.9%降低到1.7%?？梢姡琄lebsiellaaerogenes的EPS 對(duì)方解石的生成有促進(jìn)作用，對(duì)生成球霰石有抑制作用。球霰石型熱力學(xué)穩(wěn)定性極差，在顆粒間無法形成穩(wěn)定狀態(tài)，膠結(jié)作用弱，不能將松散的顆粒粘結(jié)起來，只起到填充作用，抵抗剪切的能力弱，抗剪強(qiáng)度低[18]，而方解石型碳酸鈣在熱力學(xué)上穩(wěn)定，對(duì)提高M(jìn)ICP 固化體的力學(xué)強(qiáng)度有一定實(shí)際效果[17]。因此，在MICP過程中可以通過添加不同濃度的EPS 來調(diào)控方解石和球霰石的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，以提高固化體力學(xué)強(qiáng)度。

圖3 不同質(zhì)量濃度的EPS調(diào)控下碳酸鈣的XRD圖譜Fig. 3 XRD patterns of calcium carbonate under regulation of different EPS concentrations

圖4 不同質(zhì)量濃度EPS下球霰石和方解石質(zhì)量分?jǐn)?shù)Fig. 4 Mass fraction of vaterite and calcite under different EPS concentrations

2.3.2 EPS紅外表征

EPS 的紅外譜圖如圖5 所示。從圖5 可見：3 396 cm-1附近的強(qiáng)寬峰為蛋白質(zhì)的N—H 的伸縮振動(dòng)和羥基—OH 峰[23]；2 926 cm-1附近的吸收峰為C—H的伸縮振動(dòng)峰[24]；1 650～1 500 cm-1的特征峰是蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)β 折疊所引起的N—H 的變角振動(dòng)峰[25]，說明含有羥基和氨基；1 415 cm-1附近的峰是由C—O伸縮振動(dòng)引起，這說明分子間或分子內(nèi)的羥基發(fā)生締合[26]；1 057 cm-1的峰是糖醛酸中—COOH 伸縮振動(dòng)的特征峰[27]。紅外光譜分析表明，Klebsiellaaerogenes的EPS 組分含有許多羥基、羧基等負(fù)電荷基團(tuán)，為蛋白質(zhì)和多糖的特征官能團(tuán)。

圖5 Klebsiella aerogenes的EPS紅外譜圖Fig. 5 FT-IR of EPS produced by Klebsiella aerogenes

2.3.3 Zeta電位分析

添加不同質(zhì)量濃度EPS 后，Klebsiella aerogenes通過MICP形成的碳酸鈣晶體表面的Zeta電位如表5所示。從圖5可見：空白組的碳酸鈣晶體表面電荷為-15.11 mV，添加0.1、0.5 和1.0 g/L的EPS 生成的碳酸鈣晶體表面電荷分別為-17.7、-25.39 和-27.57 mV，碳酸鈣晶體表面的Zeta 電位均為負(fù)值，且隨著EPS質(zhì)量濃度增加，Zeta電位絕對(duì)值增大，表明碳酸鈣晶體表面吸附了EPS 上的負(fù)電荷基團(tuán)。

表5 不同質(zhì)量濃度EPS下碳酸鈣表面Zeta電位Table 5 Zeta potential of calcium carbonate surface under different EPS concentrations

2.3.4 掃描電鏡（SEM）分析

圖6 所示為未添加EPS 的空白組及添加0.1、0.5和1.0 g/L的EPS所得碳酸鈣的SEM照片。從圖6可見：不同EPS質(zhì)量濃度下碳酸鈣的沉淀形態(tài)不同，空白組中存在大量球形的球霰石以及少量立方體的方解石；添加EPS后，球形的球霰石減少，立方體形狀的方解石含量增大，這與XRD 分析得到的結(jié)果一致。沉淀物的EDS 光譜(圖7)顯示其主要元素為Ca、C、O，證實(shí)沉淀物為碳酸鈣。EPS調(diào)控碳酸鈣晶體類型的機(jī)理如圖8 所示，Klebsiellaaerogenes通過代謝分解乙酸鈣產(chǎn)生CO2，以HCO-3的形式溶解在基質(zhì)中，隨著細(xì)菌代謝過程產(chǎn)生OH-，pH 升高，促進(jìn)釋放Ca2+和CO23-形成，誘導(dǎo)生成碳酸鈣晶體[9]。添加的EPS中含有大量蛋白質(zhì)和多糖的特征官能團(tuán)(圖5)，且這些官能團(tuán)通常帶負(fù)電荷，如羥基、羧基等。添加了EPS 后，帶負(fù)電荷的官能團(tuán)和溶液中帶正電的Ca2+發(fā)生螯合或者吸附作用形成絡(luò)合物，使得溶液中Ca2+濃度減小，過飽和度降低。碳酸鈣晶體類型與離子飽和度有關(guān)，在過飽和條件下更容易生成球霰石，而溶液中Ca2+飽和度降低有利于溶解度較低的多晶型方解石沉淀[28]，同時(shí)降低方解石結(jié)晶的自由能壁壘[29]，促進(jìn)不穩(wěn)定的球霰石向更穩(wěn)定的方解石轉(zhuǎn)化[30]。這些官能團(tuán)被認(rèn)為是成核位點(diǎn)，可以促進(jìn)Ca2+的吸附，提高碳酸鈣的沉淀效率，從而增加生成碳酸鈣沉淀總量[31]。

圖6 不同EPS質(zhì)量濃度下所得碳酸鈣的SEM照片F(xiàn)ig. 6 SEM images of calcium carbonate with different EPS mass concentrations

圖7 不同EPS質(zhì)量濃度下所得碳酸鈣的EDS圖譜Fig. 7 EDS patterns of calcium carbonate with different EPS mass concentrations

圖8 EPS調(diào)控碳酸鈣晶體類型的機(jī)理Fig. 8 Mechanism of regulation of calcium carbonate crystal type by EPS

3 結(jié)論

1) 通過響應(yīng)面優(yōu)化分析建立了Klebsiellaaerogenes胞外蛋白和胞外多糖產(chǎn)量的多元二次響應(yīng)面回歸模型，確定了該菌株EPS 產(chǎn)量的最優(yōu)培養(yǎng)條件，在該條件下，EPS實(shí)際產(chǎn)量顯著提高，最大可達(dá)210.24 mg/L。

2) 在Klebsiellaaerogenes以乙酸鈣為底物進(jìn)行MICP 過程中添加EPS，對(duì)方解石型碳酸鈣晶體的生成有促進(jìn)作用，對(duì)球霰石型碳酸鈣晶體的生成有抑制作用，且該調(diào)控作用隨著EPS 的濃度增大而增強(qiáng)。因此，可以通過添加不同濃度的EPS，調(diào)控KlebsiellaaerogenesMICP 過程中形成碳酸鈣晶型的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，強(qiáng)化碳酸鈣晶體向熱力學(xué)穩(wěn)定的方解石型碳酸鈣晶體轉(zhuǎn)化。

3)Klebsiellaaerogenes的EPS 組分含有羥基、羧基等負(fù)電荷基團(tuán)，吸附在碳酸鈣晶體表面，螯合或者吸附溶液中帶正電的Ca2+，使得溶液中Ca2+飽和度降低，從而有利于生成溶解度較低的方解石型碳酸鈣晶體。