復(fù)方黃柏液激活Notch1/Twist1軸對(duì)皮膚潰瘍大鼠傷口愈合的影響①

蔣曉蕾 朱立宏 （武漢市中醫(yī)醫(yī)院中醫(yī)皮膚科，武漢 430014）

皮膚作為人體最大器官，在日常生活和工作中極易受損［1］。皮膚潰瘍是常見皮膚病之一，可由物理、化學(xué)、微生物病原體、免疫功能異常等多種因素造成［2］。皮膚潰瘍因損傷可達(dá)真皮層甚至肌肉組織，故而其愈合和修復(fù)過程相對(duì)緩慢，且愈合后產(chǎn)生瘢痕的可能性較大。另外，皮膚創(chuàng)傷潰瘍常引起創(chuàng)面疼痛、瘙癢、炎癥黏液滲出等情況，給患者帶來極度不適，影響其正常生活［3-4］。

復(fù)方黃柏液是以黃柏、連翹、金銀花、蒲公英、蜈蚣等為主要成分的一種復(fù)方中成藥，具有清熱解毒、消腫止癢、祛腐消炎、治療傷口感染等多種功效［5-6］。復(fù)方黃柏液雖能促進(jìn)傷口愈合，然而其潛在的分子機(jī)制尚不清楚。Notch 信號(hào)通路在細(xì)胞增殖、分化、發(fā)育和穩(wěn)態(tài)中起著關(guān)鍵作用，有研究發(fā)現(xiàn)Notch1/Twist1軸在傷口愈合和組織修復(fù)中具有重要意義，抑制Notch1 信號(hào)通路會(huì)降低細(xì)胞增殖和遷移能力，影響創(chuàng)面愈合效果［7-8］。因此，本研究通過構(gòu)建皮膚潰瘍大鼠模型來探討復(fù)方黃柏液是否能夠通過激活Notch1/Twist1 信號(hào)通路對(duì)皮膚潰瘍大鼠傷口愈合發(fā)揮促進(jìn)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF 級(jí)雄性SD 大鼠，體質(zhì)量190～220 g，購(gòu)于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXY（粵）2018-0002。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理規(guī)章制度，并獲得武漢市中醫(yī)醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2022-S0321)。

1.1.2 主要試劑、儀器 復(fù)方黃柏液購(gòu)于山東漢方制藥有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：Z10950097）；紅霉素軟膏購(gòu)于新鄉(xiāng)市新輝藥業(yè)有限公司（國(guó)藥準(zhǔn)字：H41021297）；蘇木素-伊紅（HE）染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司（G1120-100、G1340）；大鼠IL-1β ELISA 試劑盒、TNF-α ELISA 試劑盒、總一氧化氮（NO）檢測(cè)試劑盒、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β（TGF-β） ELISA 試劑盒（PI303、PT516、S0024、PT878）購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司；羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒、鼠抗Notch1、鼠抗Twist1、鼠抗GAPDH、HRP 標(biāo)記的山羊抗鼠IgG（ab222941、ab167441、ab50887、ab9484、ab205719）購(gòu)于Abcam 公司。TGL-16B高速離心機(jī)購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器廠；ChemiDoc MP 化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 皮膚潰瘍大鼠模型制備 使用戊巴比妥鈉將大鼠麻醉后固定，剃毛備皮后用75%乙醇消毒。之后使用冰乙酸（75%，40 μl）進(jìn)行皮下注射。24 h后觀察大鼠皮膚，若出現(xiàn)發(fā)紅、炎癥滲出、潰瘍等現(xiàn)象，表明模型構(gòu)建成功［9］。

1.2.2 分組及給藥 將模型構(gòu)建成功的大鼠隨機(jī)分為模型組、復(fù)方黃柏液低、中、高劑量組（復(fù)方黃柏液L、M、H 組）和紅霉素軟膏組，10只/組。另隨機(jī)挑選10 只大鼠（除不進(jìn)行冰乙酸注射外，其余操作同模型構(gòu)建大鼠）為正常組。復(fù)方黃柏液L、M、H組分別清潔創(chuàng)面后，使用無菌注射器將復(fù)方黃柏液注射進(jìn)紗布內(nèi)，紗布將藥完全吸收后覆蓋在傷口表面，之后用無菌敷料包扎。復(fù)方黃柏液L、M、H組分別給予2.5 ml、5 ml、10 ml 復(fù)方黃柏液［10］；紅霉素軟膏組使用棉簽將紅霉素軟膏均勻涂抹在創(chuàng)面，厚度約1 mm［11］；模型組和正常組不給予藥物處理，每天1次，連續(xù)14 d。

1.2.3 組織處理 大鼠給藥14 d 后，采用戊巴比妥鈉過量麻醉的方式處死各組大鼠。在無菌環(huán)境下，沿著創(chuàng)面外緣約2 mm 處切下整個(gè)創(chuàng)面組織，并將其分成兩部分。一部分創(chuàng)面皮膚放置在多聚甲醛中固定24 h，經(jīng)乙醇脫水，石蠟包埋后，切成3 μm左右的切片；另一部分進(jìn)行凍存，用于羥脯氨酸、IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β水平及Notch1、Twist1蛋白含量檢測(cè)。

1.2.4 大鼠創(chuàng)面愈合評(píng)估 分別在大鼠給藥0 d、3 d、7 d 和14 d 拍攝傷口照片，并在給藥7 d 和14 d使用滌綸投影膜覆蓋創(chuàng)面，計(jì)算創(chuàng)面大小，通過圖像分析軟件加以分析，獲取創(chuàng)面面積并計(jì)算創(chuàng)面愈合率。創(chuàng)面愈合率（%）=（初始創(chuàng)面面積-剩余創(chuàng)面面積）/初始創(chuàng)面面積×100%。

1.2.5 大鼠創(chuàng)面組織病理學(xué)變化 取1.2.3 中制備的石蠟切片，進(jìn)行HE 染色，光學(xué)顯微鏡觀察創(chuàng)面組織病理變化情況。參照Masson 三色染色試劑盒說明將組織切片進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6 大鼠創(chuàng)面組織羥脯氨酸水平檢測(cè) 取1.2.3 中凍存大鼠創(chuàng)面皮膚的2/3，使用PBS 制備組織勻漿，一半勻漿通過羥脯氨酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織中羥脯氨酸水平。具體步驟按試劑盒說明要求進(jìn)行。

1.2.7 大鼠創(chuàng)面組織IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β 水平檢測(cè) 取1.2.6 中剩余的創(chuàng)面，通過試劑盒分別檢測(cè)IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β水平。具體步驟按試劑盒說明要求進(jìn)行。

1.2.8 大鼠創(chuàng)面組織Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)檢測(cè) 取1.2.3 中凍存大鼠創(chuàng)面組織的1/3，使用RIPA細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒提取總蛋白并定量。經(jīng)SDS-PAGE 凝膠電泳后，半干轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，使用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入鼠抗Notch1、鼠抗Twist1、鼠抗GAPDH（1∶1 000），4 ℃孵育過夜；加入山羊抗鼠IgG（1∶5 000），室溫孵育1 h。完成后滴加發(fā)光液，使用化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)采集圖像，Image Lab軟件進(jìn)行條帶灰度值分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 使用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)采用±s描述，兩組比較行t檢驗(yàn)，多組間比較行單因素方差分析，組間多重比較行SNK-q檢驗(yàn)。P<0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 復(fù)方黃柏液對(duì)大鼠創(chuàng)面愈合的影響 在給藥0 d、3 d、7 d 和14 d 對(duì)傷口區(qū)域進(jìn)行拍攝，觀察傷口愈合情況。結(jié)果顯示，復(fù)方黃柏液和紅霉素軟膏處理后能夠有效加速傷口愈合。給藥7 d 后，與模型組比較，復(fù)方黃柏液L、M、H組和紅霉素軟膏組創(chuàng)面愈合率均明顯提高（P<0.05）。給藥14 d 后，各組創(chuàng)面愈合率均明顯提高，與模型組比較，復(fù)方黃柏液L、M、H 組和紅霉素軟膏組創(chuàng)面愈合情況良好，創(chuàng)面愈合率均明顯提高（P<0.05），尤其是復(fù)方黃柏液H組和紅霉素軟膏組，創(chuàng)面幾乎愈合。見圖1、表1。

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（±s，n=10，%）Tab.1 Comparison of wound healing rate of rats in each group （±s， n=10，%）

表1 各組大鼠創(chuàng)面愈合率比較（±s，n=10，%）Tab.1 Comparison of wound healing rate of rats in each group （±s， n=10，%）

Note：Compared with model group， 1）P<0.05； compared with compound huangbai liquid L group， 2）P<0.05；compared with compound huangbai liquid M group， 3）P<0.05；compared with the same group for 7 days， 4）P<0.05.

Administration for 14 days 64.25±6.13 79.44±8.051）4）82.16±7.811）4）88.34±8.271）4）87.55±8.421）4）Groups Model Compound huangbai liquid L Compound huangbai liquid M Compound huangbai liquid H Erythromycin ointment Administration for 7 days 23.45±1.82 32.66±3.051）35.57±3.131）46.82±3.961）2）3）49.27±3.711）2）3）

圖1 各組大鼠治療0 d、3 d、7 d、14 d后傷口愈合情況Fig.1 Wound healing of rats in each group after 0 d，3 d， 7 d and 14 d of treatment

2.2 復(fù)方黃柏液對(duì)大鼠創(chuàng)面組織病理變化的影響 在藥物干預(yù)14 d 后，對(duì)創(chuàng)面組織進(jìn)行病理學(xué)變化觀察。HE 染色結(jié)果顯示，與模型組比較，在使用復(fù)方黃柏液和紅霉素軟膏對(duì)創(chuàng)面進(jìn)行處理后，復(fù)方黃柏液L、M、H 組及紅霉素軟膏組大鼠表皮和真皮厚度明顯增加，傷口已完全再上皮化且無明顯炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象。見圖2。

圖2 各組大鼠創(chuàng)面組織病理變化（HE×100）Fig.2 Pathological changes of wound tissue of rats in each group （HE×100）

2.3 復(fù)方黃柏液對(duì)皮膚創(chuàng)面膠原沉積的影響 膠原蛋白是組織再生的關(guān)鍵成分，通過Masson 染色觀察大鼠創(chuàng)面膠原蛋白情況。結(jié)果顯示，與模型組比較，復(fù)方黃柏液和紅霉素軟膏處理后，大鼠創(chuàng)面膠原蛋白沉積明顯增加（圖3）。為進(jìn)一步對(duì)膠原蛋白含量變化進(jìn)行驗(yàn)證，對(duì)能夠反映膠原蛋白含量的重要指標(biāo)羥脯氨酸進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中羥脯氨酸水平升高（P<0.05）；與模型組比較，復(fù)方黃柏液L、M、H 組及紅霉素軟膏組羥脯氨酸水平明顯升高（P<0.05），且羥脯氨酸水平與復(fù)方黃柏液存在劑量效應(yīng)關(guān)系；復(fù)方黃柏液H 組與紅霉素軟膏組比較，羥脯氨酸水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05，表2）。

表2 各組大鼠羥脯氨酸水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of hydroxyproline levels of rats in each group （±s， n=10）

表2 各組大鼠羥脯氨酸水平比較（±s，n=10）Tab.2 Comparison of hydroxyproline levels of rats in each group （±s， n=10）

Note：Compared with normal group， 1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05； compared with compound huangbai liquid L group，3）P<0.05； compared with compound huangbai liquid M group， 4）P<0.05.

Hydroxyproline/（μg·mg-1）0.73±0.07 1.17±0.081）1.43±0.112）1.52±0.112）1.85±0.133）4）1.84±0.143）4）Groups Normal Model Compound huangbai liquid L Compound huangbai liquid M Compound huangbai liquid H Erythromycin ointment

2.4 復(fù)方黃柏液對(duì)大鼠創(chuàng)面組織IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β 水平影響 與正常組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β水平明顯升高（P<0.05）；與模型組比較，復(fù)方黃柏液L、M、H 組及紅霉素軟膏組IL-1β、TNF-α、NO 水平明顯降低（P<0.05），TGF-β 水平明顯升高（P<0.05），且復(fù)方黃柏液干預(yù)對(duì)大鼠創(chuàng)面組織中IL-1β 等水平的作用存在劑量效應(yīng)關(guān)系；復(fù)方黃柏液H 組與紅霉素軟膏組比較，IL-1β、TGF-β 等水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β水平比較（±s，n=10）Tab.3 In wound tissue of rats in each group IL-1β， TNF-α， NO， TGF-β horizontal comparison （±s， n=10）

表3 各組大鼠創(chuàng)面組織IL-1β、TNF-α、NO、TGF-β水平比較（±s，n=10）Tab.3 In wound tissue of rats in each group IL-1β， TNF-α， NO， TGF-β horizontal comparison （±s， n=10）

Note：Compared with normal group， 1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05； compared with compound huangbai liquid L group，3）P<0.05； compared with compound huangbai liquid M group， 4）P<0.05.

TGF-β/（pg·ml-1）102.71±10.79 216.55±19.741）273.57±23.182）3）4）286.57±26.772）290.44±30.152）316.44±30.772）Groups Normal Model Compound huangbai liquid L Compound huangbai liquid M Compound huangbai liquid H Erythromycin ointment IL-1β/（pg·ml-1）18.56±2.07 94.78±8.161）74.32±7.082）57.31±5.842）3）35.66±2.972）3）4）32.91±3.052）3）4）TNF-α/（pg·ml-1）35.44±3.16 174.65±14.221）138.40±13.162）107.21±10.552）3）62.15±5.922）3）4）55.72±4.782）3）4）NO/［μmol·（L·g-1）］29.88±3.05 131.55±12.771）98.37±9.152）74.36±7.382）3）44.29±4.532）3）4）40.16±3.842）3）4）

2.5 復(fù)方黃柏液對(duì)大鼠創(chuàng)面組織Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)的影響 通過Western blot 對(duì)大鼠創(chuàng)面組織Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組大鼠創(chuàng)面組織Notch1、Twist1蛋白表達(dá)水平明顯降低（P<0.05）；與模型組比較，復(fù)方黃柏液-L、M、H 組及紅霉素軟膏組Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05）；復(fù)方黃柏液H 組與紅霉素軟膏組比較，Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見圖4、表4。

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of Notch1 and Twist1 protein expression in wound tissue of rats in each group （±s，n=10）

表4 各組大鼠創(chuàng)面組織Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)比較（±s，n=10）Tab.4 Comparison of Notch1 and Twist1 protein expression in wound tissue of rats in each group （±s，n=10）

Note：Compared with normal group， 1）P<0.05；compared with model group，2）P<0.05； compared with compound huangbai liquid L group，3）P<0.05； compared with compound huangbai liquid M group，4）P<0.05.

Twist1 0.81±0.08 0.27±0.031）0.39±0.042）0.56±0.062）3）0.73±0.062）3）4）0.71±0.072）3）4）Groups Normal Model Compound huangbai liquid L Compound huangbai liquid M Compound huangbai liquid H Erythromycin ointment Notch1 0.96±0.11 0.31±0.031）0.45±0.052）0.62±0.062）3）0.83±0.082）3）4）0.88±0.092）3）4）

圖4 各組大鼠創(chuàng)面組織Notch1、Twist1蛋白表達(dá)Fig.4 Protein expressions of Notch1 and Twist1 in wound tissue of rats in each group

3 討論

炎癥是傷口正常愈合的關(guān)鍵階段，其主要功能是通過釋放降解酶和自由基來殺死細(xì)菌和消除細(xì)胞碎片，從而促進(jìn)傷口進(jìn)入愈合的下一階段［12］。然而，除了在這個(gè)階段它對(duì)正常的傷口愈合有幫助外，其他階段它不僅沒有發(fā)揮正向作用，還會(huì)導(dǎo)致組織損傷和細(xì)胞增殖延遲，最終造成慢性傷口的形成［13］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠創(chuàng)面組織中炎癥介質(zhì)IL-1β、TNF-α和NO水平明顯升高，而與模型組比較，復(fù)方黃柏液L、M、H 組及紅霉素軟膏組IL-1β、TNF-α 和NO 水平明顯降低。這提示復(fù)方黃柏液促進(jìn)傷口愈合的原因之一可能是其可抑制炎癥介質(zhì)過度表達(dá)。TGF-β對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化、免疫功能、炎癥調(diào)節(jié)等均具有重要作用，它能夠刺激血管生成、促進(jìn)肉芽組織的形成、抑制炎癥因子產(chǎn)生、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM），如膠原蛋白、纖黏連蛋白的表達(dá)，在傷口愈合中發(fā)揮重要作用［14-15］。膠原蛋白能夠促進(jìn)傷口快速愈合，羥脯氨酸含量能夠間接反映創(chuàng)面組織中的膠原含量［16］。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠創(chuàng)面組織中TGF-β 和羥脯氨酸水平升高，而與模型組比較，復(fù)方黃柏液L、M、H 組及紅霉素軟膏組TGF-β 和羥脯氨酸水平進(jìn)一步升高。這提示，復(fù)方黃柏液處理促進(jìn)了TGF-β 的生成，從而有助于羥脯氨酸產(chǎn)生、細(xì)胞增殖、血管生成以及肉芽組織形成，促使創(chuàng)面愈合加快。直觀觀察、HE 和Masson 染色結(jié)果也顯示，復(fù)方黃柏液能夠減少創(chuàng)面組織炎癥細(xì)胞聚集、浸潤(rùn)等現(xiàn)象，增加膠原蛋白沉積，傷口愈合速度與模型組比較明顯加快。

研究發(fā)現(xiàn)，皮膚傷口愈合過程中許多關(guān)鍵信號(hào)通路被激活，如Notch、Wnt/β-連環(huán)蛋白等，Notch 信號(hào)通路是表皮分化調(diào)節(jié)器，在維持皮膚內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定中發(fā)揮重要作用［16-17］。Notch1 在正常組織的血管生成過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和遷移，并且被證明與傷口愈合中起著重要作用的角質(zhì)形成細(xì)胞有密切聯(lián)系［18］。Twist1 屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子超家族中的一員，能夠調(diào)控胚胎發(fā)育、誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生ECM 等功能［19-20］。古心怡等［8］研究發(fā)現(xiàn)，Notch1/Twist1軸在傷口愈合和組織修復(fù)中可能起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，模型大鼠創(chuàng)面組織中Notch1和Twist1 蛋白表達(dá)明顯降低，而低、中、高劑量復(fù)方黃柏液及紅霉素軟膏干預(yù)后Notch1、Twist1 蛋白表達(dá)明顯升高。提示復(fù)方黃柏液對(duì)創(chuàng)面愈合的促進(jìn)作用可能通過促進(jìn)組織中Notch1 和Twist1 蛋白表達(dá)、降低炎癥因子水平、提高TGF-β 和羥脯氨酸水平實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，復(fù)方黃柏液能夠促進(jìn)皮膚潰瘍大鼠傷口愈合，這可能與其促進(jìn)Notch1 和Twist1 蛋白表達(dá)，降低炎癥因子水平，增加TGF-β 和羥脯氨酸水平有關(guān)。