動脈粥樣硬化進展中差異免疫相關基因與免疫細胞的相關性及潛在干預中藥的探索①

李興淵 李曉輝 彭廣操 王建茹 （河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院心臟中心，鄭州 450000）

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是一種免疫系統(tǒng)參與的慢性炎癥性疾病，是多種心腦血管疾病主要的共同病理基礎［1-2］。AS 是多種因素共同作用的結果，病理過程較復雜，目前尚未完全闡明［3］。一直以來，不同時期的研究者從不同角度對AS的病理機制進行了闡述，并提出了不同的學說和觀點，如脂質滲入學說、內皮損傷學說、炎癥學說等。

過去的幾年里，越來越多的研究者意識到免疫學機制與AS 密切相關，免疫細胞功能障礙在AS 的發(fā)病及不同病理階段均發(fā)揮重要作用［4-6］。雖然免疫細胞已被證明參與AS 的開始到進展和斑塊破裂階段，但其潛在作用機制尚不清楚，限制了以免疫細胞為靶標治療AS 相關疾病的應用研究［4-6］?，F(xiàn)階段，高通量技術聯(lián)合生物信息學方法已被用于探索免疫細胞在AS 不同階段中的作用，為AS 的發(fā)病機制、發(fā)展、轉歸和治療提供了一些新見解［7-12］。但在這些與AS相關的大數(shù)據(jù)研究中分析基因，尤其是免疫基因和免疫細胞間相關性的研究較少。

中醫(yī)學通過“扶正”和“祛邪”來雙向調節(jié)人體免疫功能，體現(xiàn)了其“整體觀”和“陰陽平衡論”［13］。中藥及其復方可通過其有效成分群調節(jié)機體多個靶點和通路發(fā)揮綜合治療免疫性疾病作用，在防治AS 方面同樣也表現(xiàn)出了多靶點、多環(huán)節(jié)、多途徑的優(yōu)勢［14-15］。目前，中藥干預免疫損傷防治AS 的作用機制尚缺乏系統(tǒng)和全面的了解，積極探索中藥調節(jié)AS免疫平衡可能的靶點和環(huán)節(jié)，挖掘其用藥規(guī)律具有重要的意義。

基于以上認識，本文從基因表達綜合數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）中獲取GSE28829 數(shù)據(jù)集，利用生物信息學方法對GSE28829 中人頸動脈早期動脈粥樣硬化斑塊（early atherosclerotic plaques，EAP）和晚期動脈粥樣硬化斑塊（advanced atherosclerotic plaques，AAP）的差異免疫相關基因（differential immune-related genes，DIRGs）進 行 研究，運用CIBERSORT 算法分析了EAP 和AAP 的免疫細胞浸潤情況，并對DIRGs 與EAP 和AAP 間的差異免疫細胞進行了相關性分析；同時，利用Coremine Medical數(shù)據(jù)庫預測干預DIRGs 的中藥，總結其一般藥物規(guī)律（圖1）。本研究將有助于更好地理解免疫機制在AS 病理進展過程中的可能作用，并為AS 的中藥免疫治療提供一定的科學依據(jù)。

圖1 本研究思路流程圖Fig.1 Flow chart of this research

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集來源 從GEO 數(shù)據(jù)庫（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中下載GSE28829 數(shù)據(jù)集和GPL570-55999 平臺文件。數(shù)據(jù)集包括人頸動脈EAP 樣本13 個和AAP 樣本16 個。采用Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array 檢 測EAP 和AAP差異基因的表達。

1.2 數(shù)據(jù)預處理和DEGs 的篩選 依據(jù)平臺文件對表達數(shù)據(jù)進行注釋，將探針矩陣轉化為基因矩陣。然后利用impute 包對缺失值進行填充，利用avereps 函數(shù)對基因對應的多個探針取均值，利用normalizeBetweenArrays 函數(shù)對數(shù)據(jù)進行矯正。最后，利用limma 包，以|log2（fold change，F(xiàn)C）|>1 和P<0.05 為閾值標準篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）。

1.3 獲取免疫相關基因 分別從ImmPort 數(shù)據(jù)庫（https：//www.immport.org/shared/genelists）和MSig-DB：GSEA 數(shù)據(jù)庫（http：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）中下載免疫相關基因；其中MSigDB：GSEA 數(shù)據(jù)庫下載的基因集為IMMUNE_RESPONSE（編號M19817）和IMMUNE_SYSTEM_PROCESS（編號M13664）。

1.4 DIRGs 的獲取及其富集分析 將1.2 中篩選出的DEGs和1.3中獲取的免疫相關基因取交集，獲取DIRGs。然后利用clusterProfiler 包對DIRGs 進行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.5 DIRGs 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡的構建及樞紐基因的篩選 將1.4 中獲得的DIRGs 上傳至STRING 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db.org/），選擇“Multiple proteins”模式，互作得分設置為最高置信度≥0.400，進行PPI 分析，并將結果導入Cytoscape3.7.2 軟件構建PPI 網(wǎng)絡。然后利用Cyto-Hubba 插件中的Degree 算法篩選PPI 網(wǎng)絡中的核心DIRGs，即Hub基因。

1.6 免疫細胞浸潤分析 基于R 軟件，利用CIBERSORT 反卷積法對預處理后的GSE28829的表達譜矩陣進行模擬計算，進而獲得所有樣本的22種免疫細胞浸潤模式。然后根據(jù)P值篩選樣本，P<0.05 表示該樣本免疫細胞浸潤的預測結果準確可信（即可信樣本），否則需剔除該樣本。最后，利用Wilcoxon 檢驗，以P<0.05 為閾值篩選EAP 和AAP可信樣品間的差異免疫細胞。

1.7 Hub 基因與差異免疫細胞的相關性分析 參考文獻［6］，利用R 語言中的cor.test（）函數(shù)，采用Pearson 法分別對EAP 樣本和AAP 樣本中的差異免疫細胞和Hub 基因進行相關性系數(shù)的計算和檢驗。相關系數(shù)過濾條件為corFilter=0.3，相關性檢驗P值過濾條件為Pvalue Filter=0.05。相關系數(shù)的絕對值越大，P值越小表示Hub 基因和差異免疫細胞間的相關性越強。

1.8 預測DIRGs 的中藥 將1.4 中獲取的DIRGs輸入Coremine Medical數(shù)據(jù)庫（https：//coremine.com/medical/），以P<0.05為篩選條件預測中藥。然后將預測到的中藥在中醫(yī)藥整合藥理學研究平臺V2.0（http：//www.tcmip.cn/）、中國醫(yī)藥信息查詢平臺（https：//www.dayi.org.cn/）、中國藥典2020 年版、中藥大辭典第二版（上海科學技術出版社）中檢索其性味歸經信息，并統(tǒng)計分析中藥性味歸經的出現(xiàn)頻次和頻率。若中藥的性味歸經不止1 個，則要全部如實記錄。頻率（%）=出現(xiàn)頻次/總頻次×100%。同時，提取Hub 基因所對應的中藥，利用Cytoscape 3.7.2軟件構建中藥-Hub基因網(wǎng)絡。

2 結果

2.1 DEGs和DIRGs的篩選結果 差異分析結果顯示，共有182 個DEGs，其中上調157 個，下調25 個（圖2A）。從ImmPort 數(shù)據(jù)庫中獲得1 793 個免疫相關基因，M19817 中獲得235 個，M13664 中獲得332 個，剔重后共獲得1 959 個，與DEGs 取交集后共獲得63個DIRGs，其中上調60個，下調3個（圖2B）。

圖2 DEGs和DIRGs的篩選Fig.2 Screening of DEGs and DIRGs

2.2 DIRGs 的富集分析 DIRGs 的GO 功能富集分析結果顯示，依據(jù)P<0.05確定了616個GO 條目；生物學過程（biological process，BP）條目最多為524條，主要涉及細胞的遷移和趨化、炎癥細胞的活化與調節(jié)、免疫效應過程的調節(jié)等；細胞組分條目（cellular component，CC）為47條，主要涉及MHC蛋白復合物、內吞溶酶體、初級溶酶體等；分子功能（molecular function，MF）條目為45 條，主要涉及模式識別受體活性、受體配體活性、MHC 蛋白復合體結合、趨化因子和細胞因子活性及其受體結合等（圖3A）。DIRGs 的KEGG 通路富集分析結果顯示，依據(jù)P<0.05 共映射出46 條通路，其中與AS 密切相關的有趨化因子信號通路、細胞黏附分子、Toll樣受體信號通 路、IL-17 信號 通路、Th1/Th2/Th17 細胞分 化 等（圖3B）。

圖3 DIRGs的富集分析結果Fig.3 Results of DIRGs enrichment analysis

2.3 DIRGs PPI 網(wǎng)絡的構建及Hub 基因的篩選

經STRING 數(shù)據(jù)庫對DIRGs進行PPI分析后，利用Cytoscape 軟件構建PPI 網(wǎng)絡。該網(wǎng)絡包括3 306 條邊和58 個節(jié)點，其中上調基因57 個，下調基因1 個（圖4A）。如圖4B 所示，利用cytoHubba 插件中的Degree 算法在PPI 網(wǎng)絡中共篩選出10 個Hub 基因，即CD86、TLR2、TYROBP、CCR1、ITGB2、CCL2、CCL4、CSF1R、CXCR4、CTSS。

圖4 DIRGs PPI網(wǎng)絡的構建及Hub基因的篩選Fig.4 PPI network construction of DIRGs and screening of Hub genes

2.4 免疫細胞浸潤分析 通過CIBERSORT 反卷積法對早期動脈粥樣硬化（early atherosclerosis，EA）和晚期動脈粥樣硬化（advanced atherosclerosis，AA）樣本中22 種免疫細胞的相對比例進行分析，并以P<0.05 為條件對樣本進行篩選，最后得到26 個可信樣本，其中EA 有10 個，AA 有16 個（圖5A）。如圖5B 所示，EA 和AA 間存在7 種差異免疫細胞，其中調節(jié)性T細胞、活化的樹突狀細胞、靜息肥大細胞在EA中比例顯著升高；而記憶性B細胞、γδ T細胞、M0巨噬細胞、M2巨噬細胞在AA中比例顯著升高。

圖5 EA和AA的免疫細胞浸潤分析Fig.5 Analysis of immune cells infiltration in EA and AA

2.5 Hub 基因與差異免疫細胞的相關性分析 本文采用Pearson 檢驗分別在EA 和AA 樣本中對DIRGs中的Hub基因與差異免疫細胞間的相關性進行分析。如圖6 所示，在EA 中，CD86 與M2 型巨噬細胞表現(xiàn)出良好的相關性；在AA 中，有8 個Hub 基因與靜息肥大細胞、M0 巨噬細胞間具有相關性，其中CD86 與M0 巨噬細胞正相關性最強，CCL4 與靜息肥大細胞負相關性最強。

2.6 DIRGs的中藥預測 將63個DIRGs輸入Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫，并以P<0.05 為標準篩選后共獲得482 味中藥。482 味中藥有63 味藥未收集到歸經，2 味藥未收集到性味，13 味藥未收集到性味、歸經信息；性微溫者9味，微寒者23味，微涼者1味，均按性溫、性寒、性涼記錄；藥味微酸者2 味，微甘者7 味，微辛者4 味，微苦者26 味，均按味甘、味辛、味苦記錄。經統(tǒng)計后發(fā)現(xiàn)，具有調控DIRGs 作用的中藥在藥味方面以苦味的出現(xiàn)頻次和頻率最高，其次為甘味和辛味；在藥性方面，以性寒的出現(xiàn)頻次和頻率最高，其次為性溫和性平（表1）；在歸經方面，以肝經的出現(xiàn)頻次和頻率最高，其次為肺經、脾經和胃經（圖7A、B）。同時，本研究還構建了中藥-Hub基因網(wǎng)絡，并分析了中藥的Degree值分布，發(fā)現(xiàn)三七、澤蘭、人參、黃芪等中藥較重要（附圖1，www.immune99.com）。

圖7 干預DIRGs的中藥預測Fig.7 Prediction of Chinese herbs for DIRGs intervention

3 討論

AS 病機復雜，從EA 進展到AA 的確切機制尚不清楚，但可以確定其涉及免疫細胞、免疫相關基因和免疫相關途徑，因此識別病變部位的特異性免疫失調可以為AS的進展提供見解［10-11，16］。本研究對GSE28829 中EAP 和AAP 間的免疫相關基因進行了挖掘，共篩選出63 個DIRGs。GO 富集分析結果顯示，DIRGs 的分子功能和生物學過程與免疫調節(jié)密切相關，主要涉及細胞的遷移和趨化、調節(jié)炎癥細胞活化、免疫效應過程的調節(jié)、模式識別受體活性、MHC 蛋白復合體結合、趨化因子和細胞因子活性及其受體結合等。KEGG 通路富集結果顯示，與AS 密切相關的有趨化因子信號通路、細胞黏附分子、Toll樣受體信號通路、IL-17 信號通路、Th1/Th2/Th17 細胞分化、NF-κB 信號通路、TNF 信號通路等。富集分析的結果進一步說明AS 從EA 進展到AA 階段為多種因素共同參與的免疫過程，演變機制錯綜復雜。

本文對DIRGs 進行PPI 分析，共篩選出10 個Hub 基因。研究顯示，這10 個基因均通過不同方式參與了AS 的病理過程，CD86 可調控M1 型巨噬細胞［17］；TLR2 促進CTSS 調控內皮細胞的血管生成作用［18］；TYROBP聯(lián)合CD36調控非經典單核細胞的監(jiān)視作用［19］；CSF1R 促進巨噬細胞的增殖［20］；ITGB2、CCR1、CCL2、CCL4、CXCR4 調節(jié)炎癥細胞的遷移和趨化，而CCL2 還可調控巨噬細胞極化，CXCR4 還可促進平滑肌細胞增殖［21-23］。此外，其他研究者利用生 物 信 息 學 方 法 也 證 實 了CTSS、CD86、CCR1、TYROBP、ITGB2、CCL4、CXCR4 在AS 病理過程中的重要地位［7-8，24-26］。以上報道在一定程度上佐證了本研究挖掘結果的科學性、可靠性。

為進一步探討免疫細胞在EA 和AA 階段的失調情況及其與Hub基因間的關系，本文利用CIBERSORT 反卷積法對EAP 和AAP 樣本中22 種免疫細胞的浸潤模式進行了預測，并分析了其與Hub 基因間的相關性。結果顯示，共有7 類免疫細胞出現(xiàn)失衡，表現(xiàn)為EA 階段調節(jié)性T 細胞、活化的樹突狀細胞、靜息肥大細胞比例增加；AA階段記憶性B細胞、γδ T細胞、M0巨噬細胞、M2巨噬細胞比例增加。早期報道顯示，與EAP 相比，AAP 中約70%的樹突狀細胞表現(xiàn)為成熟表型；而近期報道表明，擬行冠狀動脈旁路移植術的嚴重冠心病（AAP 階段）患者樹突狀細胞活化功能缺陷，合并糖尿病者尤甚［27-28］。γδ T 細胞缺陷減輕了EA 和AA 階段的病變，但也有研究證明其未影響EA 的發(fā)展［29-30］。肥大細胞現(xiàn)已被認為是他汀類藥物治療AS 的靶點之一，調節(jié)性T細胞也被證明具有抗AS 作用，并可作為防治AS 的新靶點［31-32］。在冠心病人群中，記憶性B 細胞與較低的繼發(fā)性心血管事件風險相關［33］。巨噬細胞在AS 中表現(xiàn)出可塑性和多樣生物學功能，M0 巨噬細胞在不同刺激因子作用下分化為M1 型和M2 型［34］。在EA 和AA 階段均有M1 型和M2 型巨噬細胞，隨著AS 的發(fā)展，M2 型巨噬細胞數(shù)量減少，但其在穩(wěn)定斑塊中的比例相對較高［35］。本文預測M2 型巨噬細胞在AA 階段比例高，考慮可能與GSE28829 的AAP 為穩(wěn)定斑塊有關?？傊P于M0 巨噬細胞、記憶性B細胞、靜息肥大細胞、調節(jié)性T細胞在EA和AA階段的浸潤情況報道較少。相關性分析結果顯示，EA階段，CD86 與M2 型巨噬細胞呈正相關；AA 階段，CD86、CTSS、CXCR4、CSF1R、ITGB2、TYROBP 與M0巨噬細胞正相關，CCL4、CCL2 與靜息肥大細胞負相關。目前，關于Hub基因與EA、AA階段的免疫細胞相對百分比的關系尚缺少相關研究，本研究結果可為后續(xù)研究提供一些借鑒。

本研究發(fā)現(xiàn)通過調控免疫機制防治AS 的中藥大都歸肝經、肺經，藥味多為苦、甘，藥性以寒、溫為主；同時，挖掘出三七、澤蘭、人參、黃芪等中藥在調控免疫機制防治AS 方面表現(xiàn)出較大潛力。提示AS進展的免疫機制與中醫(yī)肝經、肺經、味苦、味甘、性寒、性溫密切相關。肝藏血主疏泄，肺朝百脈主治節(jié)，兩者的相互作用可調控全身氣機升降和氣血運行；苦味能泄、能燥、能堅，甘味能補、能和、能緩；寒性屬陰可清瀉除熱，溫性屬陽可溫通助陽。中醫(yī)學將AS的病機分為虛實兩類，虛（氣虛、陰虛、陽虛）為病之本，實（瘀血、痰濁、毒邪、濕熱）為病之標，虛可生實，實可致虛，虛實錯雜且相互轉化最終呈現(xiàn)為錯綜復雜的病理狀態(tài)［36］。綜上所述，本研究挖掘出的中藥性味歸經規(guī)律的結果與AS 的中醫(yī)病機相吻合。

本研究尚存在一定的局限性。①GEO 數(shù)據(jù)庫中滿足研究條件的樣本較少，最終納入分析的樣本有限；②CIBERSORT 反卷積算法已被廣泛用于預測腫瘤和非腫瘤疾病的免疫細胞浸潤模式，其預測精準度雖為諸多算法中的較優(yōu)者，但仍與實際情況存在偏倚；③Coremine Medical 數(shù)據(jù)庫存在一些不足，部分DIRGs 未能映射到對應的中藥；④由于收集中藥相關信息的書籍和平臺未對中藥進行功效分類，本研究未總結其功效規(guī)律。總之，本研究發(fā)現(xiàn)在AS 的 進 展 過 程 中 有10 個DIRGs（CD86、TLR2、TYROBP、CCR1、ITGB2、CCL2、CCL4、CSF1R、CXCR4、CTSS）最重要，7 種免疫細胞（調節(jié)性T 細胞、活化的樹突狀細胞、靜息肥大細胞、記憶性B 細胞、γδ T 細胞、M0 巨噬細胞、M2 巨噬細胞）出現(xiàn)失 調，其 中CD86、CTSS、CXCR4、CSF1R、ITGB2、TYROBP、CCL4、CCL2與靜息肥大細胞、M0和M1型巨噬細胞存在相關性；同時，發(fā)現(xiàn)干預DIRGs 的中藥大多歸肝經、肺經，性味多為寒、苦。本研究結果可為后續(xù)探索AS進展的免疫學機制，以及中醫(yī)臨床精準遣方用藥治療AS提供借鑒和思路。