牡蠣諾如病毒受體類Lewis 抗原合成相關(guān)基因CgFUT5 的克隆與表達(dá)鑒定

桂彬彬，曲 夢(mèng)，張蔚然,3，李明玉,4，江艷華，姚 琳，王聯(lián)珠

1.中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部水產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)與評(píng)價(jià)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266071

2.大連工業(yè)大學(xué) 食品學(xué)院，遼寧 大連 116034

3.上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海 201306

4.中國(guó)海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東 青島 266003

諾如病毒是人類所有年齡組急性腸胃炎散發(fā)和暴發(fā)的重要原因[1-3]，具有高度傳染性，10～100 個(gè)病毒顆粒即可引發(fā)感染[3]。在進(jìn)入人體后，諾如病毒會(huì)特異性地與腸道中的附著因子結(jié)合，導(dǎo)致胃腸炎[4]。組織血型抗原 (Histoblood group antigcns,HBGAs) 已被確定為多種諾如病毒毒株的附著因子[5]。作為一種濾食性雙殼軟體動(dòng)物，在被病毒污染的水體中，牡蠣體內(nèi)的諾如病毒含量比環(huán)境中的高100 倍，病毒進(jìn)入其體內(nèi)難以被清除[6-7]，因此牡蠣被認(rèn)為是諾如病毒的重要傳播媒介[8]。多項(xiàng)研究指出，諾如病毒在牡蠣中的富集是由于其能與牡蠣消化道中的碳水化合物特異性結(jié)合，而這些碳水化合物具有類似于人類HBGAs 的結(jié)構(gòu)[9-11]。因此，有理由假設(shè)牡蠣中可能存在與人HBGAs相似的合成途徑和關(guān)鍵基因。

Lewis 抗原作為HBGAs 的一種，已經(jīng)在微生物黏附和癌癥轉(zhuǎn)移等領(lǐng)域得到了深入研究[12-16]，Lewis 抗原在多種糖基轉(zhuǎn)移酶依次催化下合成[17]，根據(jù)不同巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的底物特異性，將巖藻糖從GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)移至不同的前體寡糖上，產(chǎn)生不同類型的Lewis 抗原。在人類基因組中，F(xiàn)UT5基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是合成Lewis 抗原的糖基轉(zhuǎn)移酶之一，屬于α-1,3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 (α-1,3/4 fucosyl transferases,α-1,3/4 Fuc Ts)[18]，同屬于這一類糖基轉(zhuǎn)移酶的還有FUT3、FUT4、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10 和FUT11[19-20]。FUT5 偏好于在二型前體的基礎(chǔ)上合成LeX和sLeX抗原，也有研究表明FUT5 還參與合成Lea、Leb和sLea抗原[21]。Lewis 抗原在諾如病毒結(jié)合過(guò)程中起重要作用，這些經(jīng)巖藻糖基化產(chǎn)生的碳水化合物可以和人A/H 型HBGAs 抗原在結(jié)合諾如病毒時(shí)產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)性抑制[22]，在對(duì)牡蠣類HBGAs 的研究中也有類似發(fā)現(xiàn)[23]。

目前已經(jīng)證實(shí)牡蠣中存在Lewis 抗原，種類包括Lea、Leb、LeX和LeY等[24]，然而未見(jiàn)具體合成途徑及關(guān)鍵基因的研究。本研究克隆了太平洋牡蠣 (Crassostreagigas)FUT5基因，通過(guò)熒光定量法檢測(cè)了太平洋牡蠣各組織中FUT5基因的表達(dá)量，探討太平洋牡蠣FUT5基因的組織表達(dá)差異性，旨在為牡蠣富集諾如病毒的分子機(jī)理研究提供新的證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

鮮活太平洋牡蠣 (體長(zhǎng)10～13 cm) 樣本 (10 只) 采集自青島市黃島區(qū)某貝類養(yǎng)殖場(chǎng)。

1.2 總RNA 提取與cDNA 模板制備

取牡蠣消化腺組織，在液氮中研磨，根據(jù)試劑盒的操作說(shuō)明，用動(dòng)物組織RNA 提取試劑盒 (天根生化科技有限公司，中國(guó)) 制備牡蠣消化腺總RNA。用1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA 的完整性。用Nano Photometer Pearl 微分光光度計(jì) (Implen，德國(guó)) 測(cè)定RNA 濃度。使用SMATER RACE 5'/3' 試劑盒 (TaKaRa，中國(guó)) 對(duì)總RNA 進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄合成5'/3' cDNA 末端 (RACE)，使用Evo M-MLV Plus cDNA 合成試劑盒 (艾科瑞生物工程有限公司，中國(guó)) 對(duì)總RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成1st Strand cDNA。

1.3 中間片段克隆

根據(jù)NCBI 公布的人 (Homosapiens,NC_000019.10)、黑猩猩 (Pantroglodytes,NC_036898.1)、熱帶爪蟾 (Xenopus tropicalis,NC_030680.2)、狗 (Canislupusfamiliaris,NC_051824.1) 等物種的FUT5基因序列，使用DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，選取相似度較高的氨基酸序列在NCBI 網(wǎng)站上公布的太平洋牡蠣全基因組中搜索比對(duì)，找到預(yù)測(cè)的太平洋牡蠣FUT5(CgFUT5) 基因序列(XM_020069167.2)。利用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)中間片段擴(kuò)增引物FT5-1 和RT5-1 (表1)，以太平洋牡蠣消化腺總RNA 反轉(zhuǎn)錄合成的1st Strand cDNA 為模板，擴(kuò)增CgFUT5基因中間片段。PCR 反應(yīng)體系 (50 μL) 為：FT5-1、RT5-1 (10 μmol·L-1) 各1 μL，PCR 預(yù)混液25 μL，cDNA 模板3 μL，RNase free water 20 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃5 min；94 ℃ 1 min，48 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳后，使用凝膠成像儀對(duì)電泳條帶進(jìn)行觀察，選擇合適條帶進(jìn)行切膠并送至測(cè)序公司測(cè)序。

表1 實(shí)驗(yàn)中所用引物Table 1 Primers used in this experiment

1.4 基因全長(zhǎng)克隆

根據(jù)中間片段克隆得到的序列，使用Primer 5 軟件設(shè)計(jì)RACE 克隆引物FRT5/RRT5 (表1)。以SMATER RACE 5'/3' 試劑盒合成的cDNA 做模板，擴(kuò)增5'/3' 序列。反應(yīng)體系為：RNase Free Water 15.5 μL，2×seqAmp Buffer 25 μL，SeqAmp DNA polymerase 1 μL，5'/3' RACE cDNA 2.5 μL，10×UPM 5 μL，RRT5/FRT5 1 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，65 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃5 min。

將RACE PCR 產(chǎn)物經(jīng)1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳，膠回收純化后克隆到pUC19 線性載體上。將重組載體轉(zhuǎn)化到TOP10 感受態(tài)細(xì)胞，并進(jìn)行藍(lán)白斑篩選和PCR 鑒定。選擇結(jié)果良好的克隆送至測(cè)序公司測(cè)序。

1.5 序列分析

分析測(cè)序結(jié)果，將中間片段及5'、3' 序列拼接，得到完整的CgFUT5基因序列。使用Snapgene 軟件預(yù)測(cè)氨基酸序列并計(jì)算出分子量和等電點(diǎn)；運(yùn)用TMHMM 在線系統(tǒng)(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 分析蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)域；利用DNAMAN 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，在MEGA 7.0 軟件中采用鄰接法進(jìn)行序列比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.6 組織表達(dá)分析

取3 只牡蠣的外套膜、鰓、閉殼肌、唇瓣和消化腺組織，在液氮中研磨混合，提取各組織總RNA，使用RT-qPCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒 (TaKaRa，中國(guó)) 制備熒光定量cDNA 模板。根據(jù)CgFUT5基因序列合成引物Q-FT5-A/Q-RT5-A (表1)，以太平洋牡蠣β-actin基因 (NCBI 網(wǎng)站登錄號(hào)AF026063) 為內(nèi)參基因，設(shè)計(jì)引物F-actin/R-actin (表1)[25-26]。通過(guò)RTqPCR 檢測(cè)牡蠣外套膜、鰓、閉殼肌、唇瓣和消化腺中的CgFUT5基因表達(dá)水平，每個(gè)組織樣品設(shè)置3 個(gè)平行組，反應(yīng)體系為：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s (收集熒光信號(hào))，40 個(gè)循環(huán)。組織相對(duì)表達(dá)量使用2-ΔΔCt方法計(jì)算[27]。

1.7 原核表達(dá)

對(duì)前期克隆得到的CgFUT5基因序列依據(jù)大腸桿菌密碼子偏好性進(jìn)行稀有密碼子優(yōu)化，使用金斯瑞密碼子優(yōu)化工具 (https://www.genscript.com.cn/gensmart-free-genecodon-optimization.html) 在線進(jìn)行。優(yōu)化后的基因序列在氨基酸序列C 端添加6×His 標(biāo)簽序列，克隆至pET-28a(+) 質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒命名為pET-CgFUT5。同時(shí)構(gòu)建截?cái)郚 端部分氨基酸序列并添加6×His 標(biāo)簽序列，克隆至pET-28a(+) 質(zhì)粒，得到的重組質(zhì)粒命名為pET-His-Δ59-CgFUT5。

將pET-CgFUT5 與pET-His-Δ59-CgFUT5 質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)卡那霉素篩選后挑取單菌落接種于含50 μg·mL-1卡那霉素的液體LB 培養(yǎng)基，經(jīng)36 ℃搖床過(guò)夜培養(yǎng)后按體積比1∶50 轉(zhuǎn)移至含有卡那霉素的TB 培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)。至菌液OD600為0.6 時(shí)，加入終濃度為0.6 mmol·L-1的IPTG 溶液，設(shè)置培養(yǎng)溫度為36 ℃，培養(yǎng)時(shí)間為6 h。取1 mL 誘導(dǎo)后的菌液離心并收集菌體沉淀。加入80 μL 雙蒸水 (ddH2O) 重懸菌體沉淀后，加入20 μL 5×蛋白上樣緩沖液吹打混勻，煮沸10 min 以裂解細(xì)菌，12 000 r·min-1離心2 min，取10 μL 上清液加入聚丙烯酰胺體積分?jǐn)?shù)為12%的SDS-PAGE 凝膠上樣孔中，同時(shí)加入蛋白標(biāo)準(zhǔn)Marker、BL21 空菌陰性對(duì)照和pET28a 空載陰性對(duì)照組菌液。在垂直電泳儀 (百晶生物有限公司，中國(guó)) 中經(jīng)120 V 電壓分離后，取膠塊置于室溫?fù)u床中用考馬斯亮藍(lán)染色液染色1 h，再經(jīng)脫色液充分脫色至蛋白條帶清晰可見(jiàn)。

1.8 免疫印跡分析

取1 mL 成功表達(dá)CgFUT5 蛋白的菌液，離心收集菌體后按體積比8∶2 加入ddH2O 和蛋白上樣緩沖液，經(jīng)煮沸離心后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，同時(shí)加入蛋白Marker 和pET28a 空載陰性對(duì)照菌液。電泳完成后在30 V 恒定電壓下轉(zhuǎn)移蛋白至硝酸纖維素薄膜，置于預(yù)冷的TBS 緩沖液中洗滌后，轉(zhuǎn)移至含有1% (w) 牛血清白蛋白 (BSA) 的TBST 緩沖液中，于4 ℃冰箱孵育過(guò)夜。用TBST 緩沖液洗滌過(guò)夜孵育后的硝酸纖維素薄膜3 次，加入兔抗人FUT5 單克隆抗體 (ABnova，中國(guó)) (使用TBST 緩沖液稀釋2 000 倍)，同時(shí)在另一組加入鼠抗6×His 標(biāo)簽單抗體(Abcam，中國(guó)) (使用TBST 緩沖液稀釋3 000 倍)，室溫孵育2 h。孵育結(jié)束后使用TBST 緩沖液洗滌薄膜3 次，加入對(duì)應(yīng)的二抗 (使用含1% BSA 的TBST 緩沖液稀釋3 000 倍)室溫孵育1 h，用TBST 緩沖液洗滌薄膜3 次。按照HRPDAB 底物顯色試劑盒 (天根生化科技有限公司，中國(guó)) 說(shuō)明書(shū)配制顯色液，將顯色液滴加于洗滌后的硝酸纖維素薄膜表面，避光放置5 min 顯色。

2 結(jié)果

2.1 CgFUT5 基因全長(zhǎng)序列

根據(jù)設(shè)計(jì)的中間片段引物FT5-1/RT5-1，擴(kuò)增得到932 bp 的cDNA 片段；利用3'RACE 克隆擴(kuò)增得到322 bp 的片段，利用5'RACE 克隆擴(kuò)增得到417 bp 的片段；將序列拼接，得到一個(gè)具有1 173 bp 翻譯區(qū)的完整CgFUT5基因序列，包括一個(gè)起始密碼子 (ATG) 和一個(gè)終止密碼子(TAA)、一個(gè)加尾信號(hào) (AATAAA) 以及一段由34 個(gè)腺嘌呤核苷酸組成的poly(A) 結(jié)構(gòu) (圖1)。

2.2 CgFUT5 基因序列分析

對(duì)CgFUT5基因序列推導(dǎo)出的氨基酸序列進(jìn)行分析，序列由396 個(gè)氨基酸組成，經(jīng)ExPASy-Compute pI-Mw tool 在線預(yù)測(cè)顯示該蛋白相對(duì)分子質(zhì)量為46.0 kD，理論等電點(diǎn)為9.65，屬于堿性蛋白質(zhì)。利用TMHMM 推算其跨膜結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示，CgFUT5 具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，由位于7—24 的18 個(gè)氨基酸組成 (圖2)。

圖2 CgFUT5 蛋白跨膜結(jié)構(gòu)分析Fig.2 Transmembrane structure analysis of CgFUT5 protein

從NCBI 網(wǎng)站下載多個(gè)物種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶蛋白質(zhì)序列，構(gòu)建CgFUT5基因進(jìn)化樹(shù)，結(jié)果顯示，CgFUT5基因與秀麗隱桿線蟲(chóng) (Caenorhabditiselegans)FUT5(NC_003280.10)等具有合成Lewis 抗原功能的基因聚為一類 (圖3)。

圖3 FUTs 家族系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of FUTs family

2.3 CgFUT5 基因在太平洋牡蠣中的組織分布

通過(guò)RT-qPCR 分析了牡蠣5 種組織中的CgFUT5基因表達(dá)量，結(jié)果表明，CgFUT5基因在各組織中的表達(dá)量差異較大，以閉殼肌中的表達(dá)量為基準(zhǔn)，在鰓、外套膜和唇瓣中的表達(dá)量分別為44、7 和3 倍，而消化腺中的表達(dá)量則很低 (圖4)。

圖4 CgFUT5 基因在太平洋牡蠣 5 種組織中的相對(duì)表達(dá)量注：不同字母代表組間極顯著性差異 (P<0.01)。Fig.4 Relative expression of CgFUT5 gene in five tissues of C.gigasNote: Different letters represent extremely significant differences among the groups (P<0.01).

2.4 CgFUT5 重組蛋白的原核表達(dá)

使用SDS-PAGE 電泳分析經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)后的大腸桿菌總蛋白，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)化pET-CgFUT5 質(zhì)粒的重組大腸桿菌總蛋白在46 kD 標(biāo)準(zhǔn)分子量大小處出現(xiàn)了蛋白條帶，且陰性對(duì)照中無(wú)此條帶，表明CgFUT5 蛋白在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功表達(dá)；而轉(zhuǎn)化pET-His-Δ59-CgFUT5 質(zhì)粒的大腸桿菌總蛋白在40 kD 標(biāo)準(zhǔn)分子量處出現(xiàn)了蛋白條帶，表明截?cái)嗖糠諲 端氨基酸序列的CgFUT5 蛋白也在大腸桿菌中成功表達(dá)，且表達(dá)量明顯高于未截?cái)嘈蛄匈|(zhì)粒的蛋白 (圖5)。

圖5 CgFUT5 重組蛋白的 SDS-PAGE 電泳分析Fig.5 Analysis of recombinant protein CgFUT5 by SDS-PAGE electrophoresis

2.5 CgFUT5 重組蛋白免疫印跡分析

使用鼠抗6×His 標(biāo)簽單克隆抗體 (圖6) 和兔抗人FUT5 蛋白多克隆抗體 (圖7) 的免疫印跡分析結(jié)果顯示，在泳道2 中 (目的蛋白組) 有一個(gè)約為46.0 kD 的條帶，而泳道1 中 (pET28a 空載對(duì)照組) 沒(méi)有出現(xiàn)類似大小的條帶。這一結(jié)果證實(shí)轉(zhuǎn)化后的CgFUT5 蛋白成功表達(dá)并被轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素薄膜，且重組CgFUT5 蛋白具有與人FUT5 蛋白相似的免疫原性。

圖6 以鼠抗 6×His 標(biāo)簽單克隆抗體為一抗分析CgFUT5 表達(dá)蛋白Fig.6 Expression of CgFUT5 protein analyzed by mouse anti-6×His labelled monoclonal antibody as primary antibody

圖7 以兔抗人 FUT5 單克隆抗體為一抗分析CgFUT5 表達(dá)蛋白Fig.7 Expression protein of CgFUT5 analyzed by rabbit antihuman FUT5 monoclonal antibody as primary antibody

3 討論

諾如病毒與牡蠣HBGAs 的相互作用及結(jié)合機(jī)制是目前研究的熱點(diǎn)[9,11]，關(guān)于牡蠣組織血型抗原的合成方式和來(lái)源的研究尚處于起步階段。通過(guò)類比人類HBGAs 的合成途徑，可以假設(shè)牡蠣通過(guò)與人類相似的途徑合成類HBGAs，因此逐一克隆牡蠣中的關(guān)鍵糖基轉(zhuǎn)移酶基因是驗(yàn)證上述假設(shè)的必要手段。

在前期的研究中筆者團(tuán)隊(duì)已克隆了2 個(gè)太平洋牡蠣類HBGAs 合成相關(guān)的糖基轉(zhuǎn)移酶基因[25,28]，其中牡蠣類FUT10基因與CgFUT5基因所預(yù)測(cè)的功能類似，但是二者在牡蠣中的組織分布規(guī)律卻差異明顯，類FUT10基因在消化腺組織中高表達(dá)而CgFUT5基因則幾乎不表達(dá)，在鰓中類FUT10基因的表達(dá)量最低而CgFUT5基因卻有極高的表達(dá)量。目前在人體中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)13 種巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，其中FUT3、FUT4、FUT5、FUT6、FUT7、FUT9、FUT10 和FUT11 均屬于α-1,3/4-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶，均具有合成Lewis 血型的功能[29-30]，部分巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶具有相同的底物特異性，但未見(jiàn)關(guān)于巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的組織特異性報(bào)道，在其他哺乳動(dòng)物中也未見(jiàn)報(bào)道。Kiem 等[31]在秀麗隱桿線蟲(chóng)α-1,3-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的研究中發(fā)現(xiàn)存在多種相同功能的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其中的CEFT-1(Caenorhabditiselegansfucosyl transferases 1) 基因也只在特定的組織或細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，推測(cè)這種表達(dá)模式或許是秀麗隱桿線蟲(chóng)存在多種具有相似功能的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因的原因。鑒于牡蠣與秀麗隱桿線蟲(chóng)同屬于無(wú)脊椎動(dòng)物，筆者推測(cè)太平洋牡蠣中同樣具有多種功能相似且底物特異性不同的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶基因，還進(jìn)化出了復(fù)雜的組織特異性表達(dá)模式。有研究表明，不同基因型的諾如病毒在牡蠣中的富集具有組織特異性，如GI 型主要分布于牡蠣消化腺，GII 型主要分布于鰓和外套膜，而GIII 型均勻分布于牡蠣各組織中[32]。雖然諾如病毒疫情在我國(guó)未大規(guī)模暴發(fā)，但諾如病毒的區(qū)域性感染案例屢見(jiàn)不鮮，其中GII 型諾如病毒是引發(fā)我國(guó)諾如病毒感染的優(yōu)勢(shì)毒株[33-36]。牡蠣消化腺組織是目前研究諾如病毒特異性富集的主要靶點(diǎn)，但鰓作為牡蠣的濾食器官是牡蠣接觸諾如病毒的第一道屏障，同樣具有富集GII 型諾如病毒的特點(diǎn)。據(jù)此，提出了牡蠣CgFUT5基因在鰓中特異性表達(dá)并產(chǎn)生Lewis 抗原可能與牡蠣鰓組織特異性富集GII 型諾如病毒有關(guān)的假設(shè)。挖掘牡蠣類HBGAs 合成路徑中的糖基轉(zhuǎn)移酶基因，進(jìn)一步了解牡蠣類HBGAs的合成機(jī)理，將能驗(yàn)證這一假設(shè)，從而為食源性諾如病毒疫情防控提供新的解決方案。

巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶廣泛存在于多種動(dòng)植物及細(xì)菌中，種類豐富且應(yīng)用價(jià)值大，但目前成功表征的真核生物來(lái)源的巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶只有較少的一部分。真核巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶屬于II 型跨膜蛋白，它們具有共同的結(jié)構(gòu)域特征，即具有一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域，其側(cè)翼是一個(gè)短的氨基端結(jié)構(gòu)域和一個(gè)大的羧基端催化結(jié)構(gòu)域[37]，這種特殊結(jié)構(gòu)制約著巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶的異源表達(dá)與酶活表征。已有研究表明，跨膜結(jié)構(gòu)域?qū)μ腔D(zhuǎn)移酶蛋白在原核或真核系統(tǒng)中的表達(dá)有直接影響，如可影響蛋白的可溶性、分泌性及表達(dá)量等[38-40]。母乳低聚糖的體外合成中所使用的糖基轉(zhuǎn)移酶通常來(lái)自于細(xì)菌，這是因?yàn)榧?xì)菌巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶不具有跨膜結(jié)構(gòu)域，更容易進(jìn)行大規(guī)模制備[41]。本文構(gòu)建了截?cái)嗫缒び蚪Y(jié)構(gòu)的CgFUT5基因原核表達(dá)質(zhì)粒，證明截?cái)嗪蟮馁|(zhì)粒在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了更高的表達(dá)量，不僅為CgFUT5 蛋白的提純及功能驗(yàn)證奠定了基礎(chǔ)，也可為牡蠣HBGAs 合成路徑中的其他糖基轉(zhuǎn)移酶基因的克隆表達(dá)研究提供參考。

4 結(jié)論

本研究主要對(duì)太平洋牡蠣FUT5基因進(jìn)行了克隆，通過(guò)對(duì)CgFUT5 重組蛋白進(jìn)行免疫印跡分析，證實(shí)其具有與人FUT5 蛋白相似的免疫原性，表明牡蠣中類HBGAs 的合成與人HBGAs 的合成路徑具有相似之處，為進(jìn)一步解析牡蠣特異性富集諾如病毒機(jī)理研究提供了新的證據(jù)。