長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體的微生物菌群結(jié)構(gòu)和潛在病原菌分析

田 甜，張建明，朱 欣，張德志，舒婷婷

中國長江三峽集團有限公司中華鱘研究所/三峽工程魚類資源保護(hù)湖北省重點實驗室，湖北 宜昌 443100

像哺乳動物一樣，魚類的微生物主要集中在體表和消化道，并形成了相應(yīng)的菌群結(jié)構(gòu)，對宿主的健康發(fā)育和生長具有重要作用。魚類體表是保護(hù)機體的一道重要屏障，體表分泌的黏液構(gòu)成了魚體與水環(huán)境的隔離界面[1]，成為防御入侵的第一道防線，同時也是魚體天然免疫的重要組成部分[2]。腸道微生物菌群數(shù)量豐富、結(jié)構(gòu)復(fù)雜，被稱為宿主的額外器官，具有維持宿主營養(yǎng)吸收[3]、免疫調(diào)控[4]、生長發(fā)育[5]等重要作用。魚類的腸道微生物系統(tǒng)是后天形成的，其菌群結(jié)構(gòu)與宿主自身發(fā)育狀態(tài)、養(yǎng)殖環(huán)境和餌料種類密切相關(guān)。魚類生活在水中，水中含有復(fù)雜多樣的微生物，其皮膚黏液和腸道更容易受到水環(huán)境的影響。Giatsis 等[6]認(rèn)為水環(huán)境對孵化后羅非魚 (Oreochromismossambicus) 腸道微生物的最初定殖起到了重要作用。因此，魚類和體表黏液、腸道、水環(huán)境中的微生物互相依賴、互相制約、動態(tài)平衡才能保證宿主的健康生長。

研究發(fā)現(xiàn)不同生境導(dǎo)致草魚 (Ctenopharyngdon idellus) 前腸微生物組成差異較大：自然生境的優(yōu)勢菌屬是不動桿菌屬 (Acinetobacter) 和貪銅菌屬(Cupriavidus)；高密度池塘養(yǎng)殖生境的優(yōu)勢菌屬是鯨桿菌屬 (Cetobacterium) 和希瓦氏菌屬 (Shewanella)；低密度池塘生境的優(yōu)勢菌屬是鏈球菌屬(Streptococcus) 和消化鏈球菌屬 (Peptostreptococcus)[7]。樊英等[8]采用16S rRNA 高通量測序技術(shù)分析大瀧六線魚 (Hexagrammosotakii) 表皮黏液和腸道內(nèi)容物的微生物多樣性，結(jié)果顯示表皮黏液和腸道內(nèi)容物的微生物既有相似性又有差異性，二者共有操作分類單元 (Operational Taxonomic Unit,OTU) 數(shù)量為33 個，表皮黏液具有更高的微生物多樣性，而腸道內(nèi)容物具有更高的微生物豐富度。郝佳慧等[9]通過Illumina MiSeq 擴增子高通量測序技術(shù)分析了小頭裸裂尻魚 (Herzensteiniamicrocephalus) 的皮膚黏液、腸道黏膜和腸道內(nèi)容物間微生物菌群的組成差異，發(fā)現(xiàn)皮膚黏液微生物多樣性最高，腸道黏膜和腸道內(nèi)容物之間微生物多樣性差異較小，3 個部位的優(yōu)勢菌門均以放線菌門、變形菌門、厚壁菌門、綠彎菌門和藍(lán)藻門為主。已有眾多針對不同魚類體表黏液、腸道和不同養(yǎng)殖環(huán)境開展的單一或兩者之間的微生物菌群結(jié)構(gòu)研究[10-12]，但鮮見對魚類體表黏液、腸道以及養(yǎng)殖水環(huán)境三者之間聯(lián)合開展的菌群結(jié)構(gòu)和動態(tài)分析研究。

長江鱘 (Acipenserdabryanus) 是中國特有魚類，主要分布于長江上游干流以及部分重要支流[13]。近年來，由于環(huán)境污染、過度捕撈、生境破壞等因素的影響，其自然種群資源急劇下降，已被國際自然保護(hù)聯(lián)盟 (International Union for Conservation of Nature,IUCN) 列為極危級 (CR) 物種。對長江鱘開展科學(xué)、有效的人工養(yǎng)殖工作仍是維持其種群數(shù)量的關(guān)鍵。本研究采用Illumina 高通量測序技術(shù)，探究了長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體的微生物菌群組成、多樣性及動態(tài)變化，以期為長江鱘幼魚的健康養(yǎng)殖和病害分析提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用長江鱘幼魚由中華鱘研究所2022 年春季自主繁育。2022 年6—9 月單養(yǎng)在直徑4 m、水深0.8 m 的圓形流水養(yǎng)殖池。水源為井水和塘水混合水，6、7 和9 月每日投喂2 次鱘魚配合飼料，投喂量約為魚體質(zhì)量的1%；8 月水溫升高，調(diào)整為每日投喂1 次鱘魚配合飼料，投喂量約為魚體質(zhì)量的0.5%。養(yǎng)殖期間每日排污2 次，換水量約為20%，每周開展常規(guī)水質(zhì)監(jiān)測。

1.2 樣品采集

春夏季節(jié)，水溫適宜，各種病原體容易滋生繁殖，是魚類疾病的高發(fā)期。2022 年6—9 月期間，每月對長江鱘幼魚開展一次體表黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體樣品的采集工作，每種樣品設(shè)置6 個平行。黏液樣品和腸道內(nèi)容物樣品的采集方法為：隨機挑取6 尾魚，在2 mL 無菌EP 管中加入1 mL無菌水，用無菌鑷輕輕刮取鰭條、腹部、體側(cè)及背部黏液與無菌水混合均勻，于—80 ℃保存?zhèn)錅y。隨后，用75% (φ) 乙醇棉球?qū)︳~肛門、腹部及體側(cè)進(jìn)行消毒，用無菌解剖剪從腹部剪開，取出腸道，用無菌PBS 緩沖液沖洗3 次，無菌棉球擦拭干燥后將瓣腸、直腸腸道內(nèi)容物置于2 mL 無菌EP 管中，于—80 ℃保存?zhèn)錅y。同時，采集與黏液、腸道樣品同時期的養(yǎng)殖水體樣品，采集方法為：在養(yǎng)殖池3 個對角線點分別用無菌水樣采集袋采集500 mL水樣，3 個水樣混合均勻，用0.22 μm 濾膜抽濾收集菌體，—80 ℃保存?zhèn)錅y。

1.3 16S rRNA 高通量測序

采集的全部樣品于干冰保存送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行16S rRNA 高通量測序。具體流程如下：利用Fast DNA?Spin Kit for Soil (MP Biomedical，美國) 試劑盒提取黏液、腸道內(nèi)容物及其水環(huán)境微生物總DNA，用1% (w) 瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 的質(zhì)量。使用V3—V4 變異區(qū)引物(338F-806R) 進(jìn)行PCR 擴增，產(chǎn)物經(jīng)回收、純化后進(jìn)行定量和均一化處理，構(gòu)建文庫并通過Illumina Miseq PE300 平臺進(jìn)行高通量測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析

在美吉生物云平臺完成數(shù)據(jù)處理及生物信息學(xué)分析工作。使用Fastp 0.19.6 軟件對測序得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控，使用Flash 1.2.11 軟件進(jìn)行拼接。使用Uparse 11 軟件根據(jù)97%的相似度對序列進(jìn)行OTU 聚類并剔除嵌合體。采用PDR Classifier 2.13 軟件對每條序列進(jìn)行物種注釋分類，設(shè)置比對閾值為70%，比對Silva 16S rRNA 數(shù)據(jù)庫。按照最小樣本序列數(shù)對數(shù)據(jù)抽平處理后，進(jìn)行物種組成分析、Alpha 和Beta 多樣性分析、潛在病原菌分析及功能預(yù)測分析，采用Kruskal-Wallis 秩和檢驗開展指數(shù)間差異檢驗。

2 結(jié)果

2.1 測序結(jié)果分析

共計采集到長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物、養(yǎng)殖水體樣品72 個，PCR 擴增顯示69 個樣品滿足實驗要求，測序結(jié)果顯示69 個樣品共計獲得3 462 138條高質(zhì)量序列，有效序列的平均長度為417 bp。對有效序列進(jìn)行97% 的相似性聚類，可劃分為4 349 個OTUs，鑒定出50 門、154 綱、381 目、632 科、1 306 屬、2 360 種。各樣品稀釋曲線顯示稀釋曲線已到達(dá)平臺期 (圖1)，表明本次測序幾乎已覆蓋所有的細(xì)菌，可真實反映出細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性。

圖1 樣品稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curves and Shannon curves of different samples

2.2 多樣性分析

Venn 圖分析顯示，長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物和養(yǎng)殖水體共有OTUs 數(shù)量為485 個，養(yǎng)殖水體特有OTUs 數(shù)量最多 (1 229 個)，黏液和腸道內(nèi)容物特有OTUs 數(shù)量相似，分別為680 和691 個(圖2)。三者之間微生物多樣性存在差異。Chao 指數(shù)和Ace 指數(shù)顯示，黏液和腸道內(nèi)容物微生物物種豐富度無顯著性差異，二者均極顯著低于養(yǎng)殖水體(P<0.001，圖3-a、3-b)。Shannon 指數(shù)和Simpson指數(shù)顯示，養(yǎng)殖水體微生物的物種多樣性最高、黏液次之、腸道內(nèi)容物最低 (圖3-c、3-d)。基于bray_curtis 的PCoA 分析顯示，黏液和腸道內(nèi)容物樣本部分重疊 (圖4-a)，說明二者的菌群差異較小，而養(yǎng)殖水體與二者間有一定距離，說明它們之間的菌群具有差異?；谙嗤嚯x算法的樣本層級聚類分析將樣本明顯分成2 個簇 (圖4-b)，其中黏液和腸道內(nèi)容物聚為一簇，養(yǎng)殖水體單獨為一簇，表明黏液和腸道內(nèi)容物菌群更為相似，且可與養(yǎng)殖水體菌群區(qū)分開來。

圖2 黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體 OTUs 分布 Venn 圖Fig.2 Venn diagram analysis of mucus,intestinal content and culture water

圖3 黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體中微生物的 Alpha 多樣性指數(shù)間差異檢驗注：*.P<0.05；**.P<0.01；***.P<0.001。Fig.3 Alpha diversity difference of microorganism in mucus,intestinal content and culture waterNote: *.P<0.05; **.P<0.01; ***.P<0.001.

圖4 黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中微生物的 Beta 多樣性注：a.PCoA 圖 (屬水平)；b.樣本層級聚類樹 (屬水平)。Fig.4 Beta diversity of bacteria in mucus,intestinal content and culture waterNote: a.PCoA on genus level; b.Hierarchical clustering tree on genus level.

2.3 物種組成及變化分析

在門水平，長江鱘幼魚黏液和腸道內(nèi)容物微生物優(yōu)勢菌門較為相似，均以放線菌門、變形菌門和厚壁菌門為主，不同門類的排列順序有所差異(圖5-a、5-b)。6—9 月期間，黏液微生物優(yōu)勢菌門變幅不大，而腸道內(nèi)容物微生物中梭桿菌門在8 月明顯增加，在9 月明顯減少并趨于正常，這可能與高溫季節(jié)投喂頻率和投喂量下降有關(guān)。養(yǎng)殖水體微生物優(yōu)勢菌門依次為變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門，與前兩者優(yōu)勢菌門有所差異 (圖5-c)。6 月，養(yǎng)殖水體中排名前三的優(yōu)勢菌門分別為變形菌門 (占比58.91%)、厚壁菌門 (35.60%) 和擬桿菌門 (3.46%)。7 月，養(yǎng)殖水體微生物優(yōu)勢菌門發(fā)生改變，擬桿菌門成為第一優(yōu)勢菌門 (占比46.80%)，變形菌門下降至25.45%，厚壁菌門下降至3.16% (圖5-c)。8—9 月，開始重新建立新的平衡。9 月，變形菌門恢復(fù)為第一優(yōu)勢菌門 (占比60.29%)，擬桿菌門成為第二優(yōu)勢菌門 (占比34.08%)，厚壁菌門占比3.07%。6—9 月，養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌門排序發(fā)生變化可能與高溫、枯水期水源改變有關(guān)。

圖5 黏液 (a)、腸道內(nèi)容物 (b) 及養(yǎng)殖水體中 (c) 微生物在門水平的菌群結(jié)構(gòu)組成Fig.5 Dominant species of bacteria in mucus (a),intestinal content (b) and culture water (c) on phylum level

在屬水平，長江鱘幼魚黏液優(yōu)勢菌群為紅球菌屬 (Rhodococcus)、產(chǎn)堿菌屬 (Alcaligenes)、不動桿菌屬、檸檬酸桿菌屬 (Citrobacter) 和葉桿菌屬(Phyllobacterium) (圖6-a)。6 月以紅球菌屬 (占比31.25%)、葉桿菌屬 (17.72%) 和不動桿菌屬(14.53%) 為主；7 月葉桿菌屬、不動桿菌屬占比降低，優(yōu)勢菌屬變?yōu)橐约t球菌屬 (51.13%)和產(chǎn)堿菌屬 (28.07%) 為主；8 月仍以紅球菌屬 (53.91%)、產(chǎn)堿菌屬 (30.40%) 為主；9 月以紅球菌屬 (35.06%)、產(chǎn)堿菌屬 (19.81%)、檸檬酸桿菌屬 (16.16%) 和不動桿菌屬(13.11%) 為主。腸道內(nèi)容物優(yōu)勢菌屬為紅球菌屬、葉桿菌屬、鯨桿菌屬、乳球菌屬 (Lactococcus) 和Clostridium_sensu_stricto_1(圖6-b)。6 月以紅球菌屬 (38.25%)、Clostridium_sensu_stricto_1(26.69%) 和葉桿菌屬 (24.95%) 為主；7 月Clostridium_sensu_stricto_1占比大幅下降，以紅球菌屬(54.60%) 和葉桿菌屬 (27.59%) 為主；8 月，隨著投喂頻率和投喂量的下降，鯨桿菌屬成為第一大優(yōu)勢菌屬 (37.43%)，其次為紅球菌屬 (32.20%)，葉桿菌屬 (14.76%) 為第三大優(yōu)勢菌屬；9 月，紅球菌屬恢復(fù)為第一優(yōu)勢菌屬 (30.28%)，乳球菌屬激增成為第二大優(yōu)勢菌屬 (29.32%)，葉桿菌屬為第三大優(yōu)勢菌屬 (14.86%)。養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢菌屬為黃桿菌屬(Flavobacterium)、不動桿菌屬、乳球菌屬和檸檬酸桿菌屬 (圖6-c)。6 月以不動桿菌屬 (45.37%) 和乳球菌屬 (28.57%) 為主；隨著水溫升高和枯水期水源改變，7—8 月菌群種類更加豐富，打破原有平衡，黃桿菌屬成為第一優(yōu)勢菌屬；9 月形成以黃桿菌屬 (28.30%)、檸檬酸桿菌屬 (24.12%) 和不動桿菌屬 (19.40%) 為主的新平衡。

圖6 黏液 (a)、腸道內(nèi)容物 (b) 及養(yǎng)殖水體中 (c) 微生物在屬水平的菌群結(jié)構(gòu)組成Fig.6 Dominant species of bacteria in mucus (a),intestinal content (b) and culture water (c) on genus level

2.4 潛在病原菌的分析

對OTU 豐度進(jìn)行統(tǒng)計，選擇豐度前50 個OTUs 在屬水平進(jìn)行熱圖分析，以展示潛在病原菌在黏液、腸道內(nèi)容物和養(yǎng)殖水體中的分布情況(圖7)。發(fā)現(xiàn)檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬、愛德華氏菌屬 (Edwardsiella)、假單胞菌屬(Psedomonas)、鄰單胞菌屬 (Plesiomonas) 和氣單胞菌屬 (Aeromonas) 共計7 種潛在病原菌菌屬。養(yǎng)殖水體中潛在病原菌分布最廣，以檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬、鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬為主；黏液次之，以檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬和鄰單胞菌屬為主；腸道內(nèi)容物中各病原菌屬分布較窄。

圖7 屬水平下黏液、腸道內(nèi)容物及其養(yǎng)殖水體中微生物組成熱圖Fig.7 Heatmap of microbial communities in mucus,intestinal content and culture water on genus level

2.5 表型預(yù)測分析

為進(jìn)一步了解長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體微生物菌群的功能輪廓，利用BugBase 對細(xì)菌表型進(jìn)行預(yù)測。BugBase 表型預(yù)測分析開展了革蘭氏陽性、革蘭氏陰性、厭氧、兼性厭氧、好氧和潛在致病性共計6 種表型特征。結(jié)果顯示，腸道內(nèi)容物以革蘭氏陽性菌為主 (占比62.57%，圖8-a)，黏液和養(yǎng)殖水體以革蘭氏陰性菌為主，分別占比59.70% 和71.18% (圖8-b)。在厭氧菌組成方面，腸道內(nèi)容物厭氧菌豐度最高，養(yǎng)殖水樣次之，黏液厭氧菌豐度最低 (圖8-c)；在兼性厭氧菌組成方面，養(yǎng)殖水體兼性厭氧菌顯著高于黏液和腸道內(nèi)容物 (圖8-d)；在好氧菌組成方面，黏液好氧菌豐度為79.87%，腸道內(nèi)容物為62.73%，養(yǎng)殖水體為37.31% (圖8-e)。有潛在致病性的菌群主要富集在養(yǎng)殖水體和黏液中，遠(yuǎn)高于腸道內(nèi)容物(圖8-f)。

圖8 利用BugBase 對黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中微生物菌群表型進(jìn)行預(yù)測分析Fig.8 Phenotype analysis of bacteria in mucus,intestinal content and culture water by BugBase

3 討論

微生物是生命世界中豐富多樣的生物資源，不同來源的微生物表現(xiàn)出不同的菌群結(jié)構(gòu)和特征。本研究對長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示三者間的菌群結(jié)構(gòu)兼具相似性和差異性。魚類表皮細(xì)胞分泌大量黏液，其微生物群落結(jié)構(gòu)會受到物種、餌料、發(fā)育進(jìn)程以及健康狀態(tài)的影響，但這些影響隨著宿主發(fā)育而逐漸減弱[14]。魚類體表黏液根據(jù)自身需要建立特定菌群，并在特定發(fā)育時期保持相對穩(wěn)定[15]。研究認(rèn)為魚類黏液微生物菌群結(jié)構(gòu)和功能與腸道具有相似性[16]。本研究中，Alpha 和Beta 多樣性分析表明黏液和腸道內(nèi)容物微生物菌群結(jié)構(gòu)更為相似，且可與養(yǎng)殖水體微生物菌群區(qū)分開來。推測可能是魚類體表黏液和腸道與機體互利共存、相互作用的結(jié)果。養(yǎng)殖水體中存在大量的微生物，它們參與各項物質(zhì)循環(huán)，維持整個養(yǎng)殖系統(tǒng)的生態(tài)平衡[17]。研究表明，斑點叉尾鮰 (Ictalunespunctatus)[18]、大菱鲆 (Scophthalmusmaximus)[19]、花鱸 (Lateolabraxjaponicus) 和日本黃姑魚 (Nibeajaponica)[20]腸道的微生物多樣性低于養(yǎng)殖水體。本研究結(jié)果與上述結(jié)果一致，Alpha 多樣性分析結(jié)果顯示，長江鱘幼魚腸道內(nèi)容物中微生物的菌群豐富度和多樣性低于同時期養(yǎng)殖水體，且差異顯著 (P<0.001)。

在門水平，虹鱒 (Oncorhynchusmykiss) 體表黏液以變形菌門和擬桿菌門為主[21]；小頭裸裂尻魚體表皮膚的優(yōu)勢菌門為放線菌門和變形菌門[9]。變形菌門、厚壁菌門、梭桿菌門是大口黑鱸 (Micropterussalmoides) 腸道菌群的優(yōu)勢菌門[22]；變形菌門、放線菌門和擬桿菌門是玫瑰高原鰍 (Triplophysarosa) 腸道的主要菌群[23]；變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門是石首魚 (Aplodinotusgrunniens) 腸道的優(yōu)勢菌門[24]。本研究發(fā)現(xiàn)，長江鱘幼魚黏液和腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢菌門較為相似，均為放線菌門、變形菌門和厚壁菌門，與上述學(xué)者的研究結(jié)果有所差異。可能是由于不同組織來源、不同種類的微生物菌群因其宿主特征、餌料種類、組織特性不同，其優(yōu)勢菌門會呈現(xiàn)不同組成變化。本研究顯示6—9 月期間各門類比例呈現(xiàn)動態(tài)變化，其中黏液動態(tài)變幅不大，而腸道內(nèi)容物在8 月出現(xiàn)梭桿菌門明顯增加，9 月明顯下降恢復(fù)正常的現(xiàn)象。這可能與8 月水溫升高降低日投喂量和投喂頻率，9 月恢復(fù)正常投喂有關(guān)。這提示我們改變投喂策略可以直接影響腸道優(yōu)勢菌門的組成。

在門水平對養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌群進(jìn)行研究，結(jié)果表明遼寧長海刺參 (Apostichopusjaponicus) 養(yǎng)殖池水體[25]和凡納濱對蝦 (Litopenaeusvannamei) 異養(yǎng)、自養(yǎng)型生物絮團[26]以變形菌門和擬桿菌門為主；4 種鱘鰉網(wǎng)箱養(yǎng)殖水體優(yōu)勢菌門由變形菌門、放線菌門和擬桿菌門等組成[27]。本研究養(yǎng)殖水體中變形菌門、擬桿菌門和厚壁菌門占優(yōu)勢地位，與上述結(jié)果相一致。同時，本研究發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體隨外界因素影響呈現(xiàn)動態(tài)變化。6 月，優(yōu)勢菌門排列由高到低依次為變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門。7 月，枯水期水源改變導(dǎo)致擬桿菌門成為第一優(yōu)勢菌門，變形菌門降至第二。9 月，水源逐步趨于穩(wěn)定，形成以變形菌門、擬桿菌門、厚壁菌門為主的新平衡狀態(tài)。變形菌門是細(xì)菌中最大的一個門，具有利用碳源，去除氮與磷，降解有機物等作用[28-29]。擬桿菌門作為第二優(yōu)勢菌門，在降解生物大分子、發(fā)酵碳水化合物、參與碳循環(huán)等方面具有重要作用[30-31]。

在屬水平，長江鱘體表黏液優(yōu)勢菌屬為紅球菌屬、產(chǎn)堿菌屬、不動桿菌屬、檸檬酸桿菌屬和葉桿菌屬；腸道內(nèi)容物優(yōu)勢菌屬為紅球菌屬、葉桿菌屬、鯨桿菌屬、乳球菌屬和Clostridium_sensu_stricto_1；養(yǎng)殖水體中優(yōu)勢菌屬為黃桿菌屬、不動桿菌屬、乳球菌屬和檸檬酸桿菌屬。其中黏液和腸道內(nèi)容物共同優(yōu)勢菌屬2 個，且第一優(yōu)勢菌屬相同，黏液和養(yǎng)殖水體共同優(yōu)勢菌屬2 個，腸道內(nèi)容物和養(yǎng)殖水體共同優(yōu)勢菌屬1 個。魚體黏液與水環(huán)境密切接觸，水環(huán)境中含有復(fù)雜多樣的微生物群落，但物種組成分析結(jié)果和多樣性結(jié)果均顯示黏液與養(yǎng)殖水體的相似性低于其與腸道的相似性。推測產(chǎn)生此現(xiàn)象的原因有兩種：1) 黏液作為機體的第一道防御屏障，含有大量的土著微生物，水環(huán)境中的微生物難以定殖成功，其在水環(huán)境中會選擇自身需要的微生物并構(gòu)建特定的群落；2) 黏液和腸道共同與宿主互相作用、互相影響，宿主利用各種防御機制將二者中的微生物群落維持在一定的范圍，以保障機體健康生長。

水產(chǎn)養(yǎng)殖中，細(xì)菌性疾病是制約養(yǎng)殖成活率的一大瓶頸[32-33]。眾所周知，條件病原菌廣泛存在于養(yǎng)殖環(huán)境和魚體內(nèi)外，當(dāng)魚體體質(zhì)下降或外界環(huán)境惡化極易導(dǎo)致病害的發(fā)生。已報道的鱘魚病害研究顯示，柱狀黃桿菌 (Flavobacteriumcolumnare) 可導(dǎo)致中華鱘 (A.sinensis) 患爛鰓病[34]；嗜水氣單孢菌(Aeromonashydrophila)[35-36]、維氏氣單胞菌 (A.veronii)[37]、遲緩愛德華氏菌 (Edwardsiellatarda)[38]、弗氏檸檬酸桿菌 (Citrobacterfreundii)[39]可導(dǎo)致西伯利亞鱘 (A.baerii)、達(dá)氏鱘、中華鱘患細(xì)菌性敗血癥；惡臭假單胞菌 (Pseudomonasputida) 可導(dǎo)致雜交鱘 (Husodauricus♀×Acipenserschrenckii♂) 患腸炎病[40]；停乳鏈球菌 (Streptococcusdysgalactiae)[41]、海豚鏈球菌 (S.iniae)[42]可導(dǎo)致俄羅斯鱘 (A.gueldenstaedti)、波斯鱘 (A.persicus) 患鏈球菌??；偶發(fā)分枝桿菌 (Mycobacteriumfortuitum)[43]、龜分枝桿菌 (M.chelonae)[44]、海分枝桿菌 (M.marinum)[45]可導(dǎo)致小體鱘 (A.ruthenus)、俄羅斯鱘、中華鱘患分枝桿菌病。本研究通過對豐度前50 個OTUs 在屬水平進(jìn)行熱圖分析，發(fā)現(xiàn)潛在病原菌在長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中普遍存在，共計發(fā)現(xiàn)7 個潛在病原菌屬：檸檬酸桿菌屬、不動桿菌屬、黃桿菌屬、愛德華氏菌屬、假單胞菌屬、鄰單胞菌屬和氣單胞菌屬。提示在養(yǎng)殖過程中容易發(fā)生爛鰓病、腸炎病和細(xì)菌性敗血癥。潛在病原菌在三者之間的分布關(guān)系為養(yǎng)殖水體最廣、黏液次之、腸道內(nèi)容物最窄，表明在適宜的條件下，潛在病原菌可能會由外向內(nèi)導(dǎo)致上述疾病的發(fā)生。

通過BugBase 對細(xì)菌表型進(jìn)行預(yù)測分析發(fā)現(xiàn)，長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體中存在革蘭氏陰性菌和陽性菌。其中腸道內(nèi)容物的優(yōu)勢菌群為革蘭氏陽性菌，占比超過60%；黏液和養(yǎng)殖水體的優(yōu)勢菌群均為革蘭氏陰性菌，占比分別為60%和70%。研究發(fā)現(xiàn)達(dá)氏鰉 (Husodauricus)[46]和大瀧六線魚幼魚[47]腸道中革蘭氏陽性菌分別占比80% 和56%，與本研究結(jié)果相似。這與梭菌屬、乳球菌屬等革蘭氏陽性菌的功能有關(guān)，它們可以在腸道中發(fā)酵碳水化合物、利用蛋白質(zhì)和糖分，幫助魚類從餌料中獲取營養(yǎng)和能量[48-49]。已有研究顯示小頭裸裂尻魚皮膚黏膜微生物中革蘭氏陰性菌占比約為50%[9]，南極中山站上層海水微生物中革蘭氏陰性菌占比約為60%[14]，二者革蘭氏陰性菌比例均小于本研究，這可能與物種、水源以及發(fā)育進(jìn)程的影響相關(guān)。在氧氣需求方面，黏液和腸道內(nèi)容物以好氧菌為主；養(yǎng)殖水體以好氧菌和兼性厭氧菌為主。與黏液和養(yǎng)殖水體相比，腸道內(nèi)容物中含有更多的厭氧菌，Clostridium_sensu_stricto_1在腸道厭氧菌中占比超過70%，成為優(yōu)勢菌屬。Clostridium_sensu_stricto_1具有促進(jìn)短鏈脂肪酸(SCFAs) 產(chǎn)生，改善腸道微生物結(jié)構(gòu)的作用[50]。在人類醫(yī)學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)，Clostridium_sensu_stricto_1可以通過阻礙病原微生物的定殖進(jìn)而增強嬰兒腸道中細(xì)菌的耐藥性[51]。潛在致病性菌群在養(yǎng)殖水體和黏液中占比均超過45%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于腸道內(nèi)容物(0.2%)。由此可見，養(yǎng)殖水體和黏液中存在著大量的條件致病菌，當(dāng)魚體處于應(yīng)激狀態(tài)或養(yǎng)殖環(huán)境惡化時，可能導(dǎo)致病害的發(fā)生。

4 結(jié)論

本研究利用高通量測序技術(shù)對長江鱘幼魚黏液、腸道內(nèi)容物及養(yǎng)殖水體的微生物多樣性進(jìn)行了研究。發(fā)現(xiàn)養(yǎng)殖水體的微生物多樣性最高、黏液次之、腸道內(nèi)容物最低。黏液和腸道微生物菌群結(jié)構(gòu)更為相似，且可與養(yǎng)殖水體微生物菌群區(qū)分開來。養(yǎng)殖水體和黏液中存在大量的潛在致病菌，當(dāng)魚體處于應(yīng)激狀態(tài)或養(yǎng)殖環(huán)境惡化時，可能導(dǎo)致病害的發(fā)生。

致謝：衷心感謝三峽金沙江川云水電開發(fā)有限公司柯偉主任在本研究過程中給予的支持與幫助！