一株耐高氨氮好氧反硝化細(xì)菌的鑒定及脫氮性能研究

馮雨薇，蘇新國(guó)，孫慧明，林浩澎，陳瓊?cè)A，舒 琥

廣州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510006

近年來(lái)，我國(guó)工廠化養(yǎng)殖水產(chǎn)品產(chǎn)量持續(xù)上升，2021 年達(dá)679 908 t[1]，隨之而來(lái)的養(yǎng)殖污染也呈加劇趨勢(shì)。富含蛋白質(zhì)的商業(yè)飼料是水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的主要氮 (N) 源，但只有約25%的飼料可以轉(zhuǎn)化為魚(yú)類(lèi)的生物量[2]；氨氮 (NH4+-N)、硝態(tài)氮(NO3--N)、亞硝態(tài)氮 (NO2--N) 等含N 化合物成為工廠化養(yǎng)殖系統(tǒng)中的主要污染物。隨著養(yǎng)殖密度的不斷增大，飼料投喂量增加，殘留餌料、殘骸、魚(yú)糞等含N 污染物也不斷增加[3-4]。這些含N 污染物在微生物的作用下進(jìn)行蛋白質(zhì)脫氨作用產(chǎn)生NH+4-N，進(jìn)而被氧化成NO2--N、NO3--N。在水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中，3 種含氮化合物的含量不同，其中NH4+-N 的生成量最大，但這些N 污染對(duì)養(yǎng)殖水生動(dòng)物均有不同程度的毒害作用，長(zhǎng)時(shí)間暴露其中會(huì)破壞魚(yú)體的鰓組織、干擾生物體氧化過(guò)程，導(dǎo)致生長(zhǎng)減緩、肝組織惡化甚至死亡[5]。此外，NH4+-N 濃度過(guò)高還會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化，溶解氧含量下降，有毒物質(zhì)增加，進(jìn)而破壞水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)的生態(tài)平衡[4]。因此，亟須經(jīng)濟(jì)有效的方法清除水產(chǎn)養(yǎng)殖系統(tǒng)中的N 污染，避免水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟(jì)損失。

為了減少NH4+-N 及其他N 污染，人們通過(guò)充氧曝氣、物理化學(xué)法、生物法等手段進(jìn)行治理，實(shí)現(xiàn)工廠化養(yǎng)殖水體的循環(huán)再利用[6]。物理化學(xué)方法包括反滲透、電滲透析和離子交換，需要高昂的運(yùn)營(yíng)和維護(hù)成本，并會(huì)產(chǎn)生二次廢物。與之相比，生物法省時(shí)高效且成本低，極具發(fā)展前景[7]。好氧反硝化細(xì)菌以生長(zhǎng)周期快、脫氮周期短、降解能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)常被運(yùn)用于生物修復(fù)。目前已有研究發(fā)現(xiàn)的好氧反硝化細(xì)菌種類(lèi)有芽孢桿菌屬 (Bacillus)、假單胞菌屬 (Pseudomonas)、產(chǎn)堿桿菌屬 (Alcaligenes)、紅球菌屬 (Rhodococcus)等，能將水體中的含N 化合物還原為氣態(tài)N 進(jìn)而有效減少水中N 污染[8]。例如，劉方劍[9]篩選出的菌株WZ17 具有高效脫氮性能，對(duì)NH4+-N、NO2--N 和NO-3-N 的去除率分別為99.31%、91.82%和83.60%；Xia 等[10]從淡水中篩出菌株ND7 可在低濃度條件下 (約50 mg·L-1)分別去除約99.8%的NH4+-N、96.2%的NO2--N 和97.18%的NO3--N，表明好氧反硝化細(xì)菌具有較好的脫氮作用。但僅有少數(shù)研究者對(duì)反硝化菌株的生物安全性進(jìn)行了研究[11]，而未經(jīng)生物安全性檢驗(yàn)的菌株在投放使用后極可能對(duì)漁業(yè)造成危害。此外，現(xiàn)有研究的菌株存在生長(zhǎng)緩慢、NH4+-N 耐受性差等問(wèn)題，不能較好地適應(yīng)高濃度NH4+-N 的極端環(huán)境，如高濃度NH4+-N 的工業(yè)和養(yǎng)殖廢水等；缺乏能夠兼用于處理農(nóng)業(yè)、工業(yè)廢水的菌株。本研究設(shè)計(jì)了高濃度NH4+-N 實(shí)驗(yàn)，探索了菌株對(duì)濃度范圍較廣 (100～1 000 mg·L-1) 的NH+4-N 的耐受性及去除能力。

為獲得耐高NH4+-N 且安全高效脫氮的好氧反硝化細(xì)菌，本文基于一株從廣東省佛山市某羅非魚(yú)養(yǎng)殖池塘中分離純化出來(lái)的好氧反硝化細(xì)菌WM28，對(duì)其進(jìn)行菌株種屬鑒定、抗生素藥敏實(shí)驗(yàn)和毒性實(shí)驗(yàn)，研究了其異養(yǎng)硝化-好氧反硝化的能力及高NH4+-N 耐受性，以期為廢水脫氮提供良好的菌種來(lái)源，并為未來(lái)該菌種在新型脫氮工藝中的開(kāi)發(fā)利用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株

菌株WM28 篩選自廣東省佛山市某羅非魚(yú)養(yǎng)殖池塘采取的池水和底泥。用甘油冷凍保存法將菌株保存于實(shí)驗(yàn)室中，實(shí)驗(yàn)前進(jìn)行富集培養(yǎng)。

1.2 培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基為：牛肉膏3 g·L-1，蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉 (NaCl) 5 g·L-1，瓊脂17 g·L-1，雙蒸水 (ddH2O) 1 L，pH 7.2～7.4；

單一氮源模擬廢水：磷酸二氫鉀 (KH2PO4) 1.5 g·L-1，七水硫酸鎂 (MgSO4·7H2O) 0.2 g·L-1，磷酸氫二鈉 (Na2HPO4) 7.9 g·L-1，檸檬酸鈉 7.169 g·L-1，氯化銨 (NH4Cl) 0.764 g·L-1或硝酸鈉(NaNO3) 1.214 g·L-1或亞硝酸鈉 (NaNO2) 0.986 g·L-1，微量元素溶液 2 mL，H2O 1 L，pH 7.2；

高氨氮模擬廢水培養(yǎng)基在單一氮源模擬廢水(NH4Cl) 的基礎(chǔ)上，改變NH4Cl 和檸檬酸鈉的濃度：NH4+-N 初始質(zhì)量濃度分別為100、200、500、700 和1 000 mg·L-1，分別加入0.382、0.764、1.911、2.675 和3.821 g·L-1的NH4Cl，分別加入3.584、7.169、17.912、25.090 和35.843 g·L-1的檸檬酸鈉。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 形態(tài)學(xué)分析

將菌株接種至牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)24 h，肉眼觀察單菌落生長(zhǎng)形態(tài)；再通過(guò)革蘭氏染色在油鏡下觀察菌體的染色特性。用掃描電鏡對(duì)分離菌株個(gè)體形態(tài)進(jìn)行觀察并拍照記錄。菌株的生理生化特性鑒定根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]及《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》[13]進(jìn)行。

1.3.2 菌株16SrRNA基因序列分析

使用DNA 提取試劑盒提取菌株WM28 的DNA，并以之為模板擴(kuò)增其16SrRNA基因。使用的引物為：上游引物 (27 F)：5'-AGAGTTTGA TCCTGGCTCAG-3'；下游引物 (1 492 R)：5'-GGC TACCTTGTTACGACTT-3'。用瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，并將擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果先提交到NCBI，在Gen-Bank 中獲得注冊(cè)號(hào)。使用BLAST 進(jìn)行序列比對(duì)，選取同源性較高的模式菌株，利用MEGA 6 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，分析菌株的種屬關(guān)系。

1.3.3 常見(jiàn)抗生素紙片藥敏實(shí)驗(yàn)

按照我國(guó)衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS/T 639—2018《抗菌藥物敏感性試驗(yàn)的技術(shù)要求》中的“紙片擴(kuò)散法”要求開(kāi)展常見(jiàn)抗生素紙片藥敏實(shí)驗(yàn)。菌株活化后，取150 μL 菌液于平板上，均勻涂布，待平板晾干后，使用無(wú)菌鑷子將含有抗生素的紙片貼于平板中間，重復(fù)貼3 個(gè)，15 min 內(nèi)倒置平板。于30 ℃恒溫條件下培養(yǎng)18 h 后，使用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑并記錄。

1.3.4 生態(tài)毒性評(píng)價(jià)—魚(yú)類(lèi)毒性實(shí)驗(yàn)

取出活化培養(yǎng)至16 h 的WM28 菌液，在5 000 r·min-1離心5 min，去上清液，用無(wú)菌PBS 緩沖液洗滌沉淀，重復(fù)2 次后，再用滅菌水重懸菌體，測(cè)定OD600，根據(jù)OD600與菌濃度的變化趨勢(shì)得到實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。參照Shu 等[14]的方法，選取體長(zhǎng)為(3±1) cm 且健康的斑馬魚(yú) (Daniorerio) 60 尾，隨機(jī)分配到裝有15 L 淡水的玻璃容器中，每缸10尾，設(shè)置3 個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)組加入WM28 并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)控制其菌量在1×106CFU·mL-1，對(duì)照組加入等體積無(wú)菌水。實(shí)驗(yàn)期間，正常飼養(yǎng)斑馬魚(yú)，每隔3 d 對(duì)水體進(jìn)行更換，換水后按上述方法重新加入菌株，實(shí)驗(yàn)持續(xù)10 d，記錄斑馬魚(yú)的成活率。

1.3.5 菌株在3 種單一氮源模擬廢水下的生長(zhǎng)情況與脫氮性能

實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 種單一含氮模擬廢水 (設(shè)置初始NH+4-N、NO-3-N 和NO-2-N 的質(zhì)量濃度分別為197.06、211.70 和194.04 mg·L-1)，其他變量保持一致，設(shè)置不添加菌液的空白對(duì)照組，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。將活化培養(yǎng)至第16 小時(shí)的菌株以體積比1%的接種量，分別接種到3 種高溫滅菌后的單一含N 模擬廢水中，在恒溫?fù)u床中培養(yǎng)48 h；前12 h 每4 h 取樣，后36 h 每8 h 取樣，測(cè)定發(fā)酵液中的生物量 (以光密度OD600為表征)，再在5 000 r·min-1，5 min 條件下進(jìn)行離心處理后取其上清液，檢測(cè)其N(xiāo)H4+-N、NO3--N 和NO2--N 的濃度，以觀察菌株的生長(zhǎng)情況及氮源的動(dòng)態(tài)變化情況。

1.3.6 菌株WM28 對(duì)高濃度NH4+-N 模擬廢水的耐受性

為探究菌株是否具備處理養(yǎng)殖尾水、工業(yè)廢水的潛力，分別使用NH4+-N 質(zhì)量濃度為100、200、500、700 和1 000 mg·L-1的模擬廢水對(duì)菌株WM28進(jìn)行培養(yǎng)，其他變量保持一致，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)置3 個(gè)平行。將活化培養(yǎng)至16 h 的菌株以體積分?jǐn)?shù)1%接種量分別接種到不同濃度的NH4+-N 模擬廢水中，在30 ℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)120 h，前72 h 每8 h 取樣，后48 h每12 h 取樣。測(cè)定發(fā)酵液中的OD600及其N(xiāo)H4+-N 濃度，驗(yàn)證菌株對(duì)高濃度NH4+-N模擬廢水的耐受性。

1.3.7 N 檢測(cè)方法及去除率計(jì)算

NH4+-N 采用納氏試劑分光光度法 (HJ 535—2009) 測(cè)定；NO3--N 采用紫外分光光度法 (HJ/T 346—2007) 測(cè)定；NO2--N 采用N-(1-萘基)-乙二胺二鹽酸鹽分光光度法 (GB 7493—1987) 測(cè)定。去除率η的計(jì)算公式如下：

式中：C0表示第0 小時(shí)的相應(yīng)氮源質(zhì)量濃度(mg·L-1)；C1表示發(fā)酵培養(yǎng)之后某時(shí)間測(cè)得的相應(yīng)氮源質(zhì)量濃度 (mg·L-1)。采用Origin 2018 軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與繪圖。

2 結(jié)果

2.1 菌株的形態(tài)、生理生化及16S rRNA 分子鑒定

菌株WM28 在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上形成米白色菌落，透明、表面光滑濕潤(rùn)、形狀不規(guī)則(圖1-a)。革蘭氏染色結(jié)果呈陽(yáng)性 (圖1-b)。掃描電鏡下，菌株WM28 為長(zhǎng)約1.4 μm、寬約0.4 μm 的桿菌 (圖1-c)。根據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》[12]和《Bergey's Manual of Systematic Bacteriology》[13]進(jìn)行菌株的生理生化鑒定，初步鑒定WM28 為赤紅球菌 (表1)。

表1 菌株WM28 生理生化鑒定結(jié)果Table 1 Physiological and biochemical identification results of strain WM28

圖1 WM28 菌落形態(tài)特征觀察注：a.菌落特征；b.革蘭氏染色鏡檢；c.菌株掃描電鏡圖。Fig.1 Observation on morphological characteristics of WM28 colonyNote: a.Colony characteristics; b.Gram stain microscopy; c.Scanning electron microscope of strain.

將菌株WM28 的16S rRNA 序列上傳NCBI，在GenBank 中獲得注冊(cè)號(hào)MW578893.1。比對(duì)結(jié)果顯示 (系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)見(jiàn)圖2)，菌株WM28 與Rhodococcus屬Rhodococcussp.OUZC16 在同一個(gè)分支上，親緣關(guān)系最近，序列比對(duì)一致度為99.64%，故鑒定為紅球菌屬。

圖2 基于 16S rRNA 基因序列菌株WM28 的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain WM28 based on 16S rRNA sequence

綜合形態(tài)學(xué)、生理生化特征及16SrRNA基因序列和系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析結(jié)果，鑒定該菌株為紅球菌屬赤紅球菌，命名為RhodococcusruberWM28。

2.2 常見(jiàn)抗生素紙片藥敏實(shí)驗(yàn)及生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)

藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果 (表2) 顯示，菌株WM28 對(duì)氯霉素、鹽酸四環(huán)素、硫酸慶大霉素、左氧氟沙星等常見(jiàn)藥品敏感；對(duì)諾氟沙星、環(huán)丙沙星呈中介狀態(tài)；但對(duì)頭孢他啶、鏈霉素等常見(jiàn)抗生素呈耐藥性。這與抗生素的天然抗菌譜相關(guān)，實(shí)驗(yàn)菌WM28 為放線(xiàn)菌目、棒桿菌亞目、諾卡菌科、紅球菌屬，頭孢他啶對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的效果與第一代頭孢菌素近似，作用較弱[15]；鏈霉素產(chǎn)自放線(xiàn)菌目中的鏈霉菌[16]，對(duì)菌株不敏感，在實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)避開(kāi)使用頭孢他啶及鏈霉素等抗生素進(jìn)行滅菌。因此，推斷菌株WM28 對(duì)常見(jiàn)的抗生素具有較好的藥物敏感性。

表2 抗生素耐藥性實(shí)驗(yàn)結(jié)果表Table 2 Experimental results of antibiotic resistance

生態(tài)毒性實(shí)驗(yàn)中，正常飼養(yǎng)到第12 天時(shí)，菌株WM28 實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的斑馬魚(yú)成活率均為100%。由于本實(shí)驗(yàn)加入的菌液濃度為1×106CFU·mL-1，高于病原微生物的致病劑量 (1×104CFU·mL-1)，因此可以初步判斷菌株WM28 具有較高的生物安全性。

2.3 菌株在3 種單一氮源模擬廢水下的生長(zhǎng)與脫氮性能

菌株WM28 分別在3 種單一氮源模擬廢水中的生長(zhǎng)與脫氮性能如圖3 所示。異養(yǎng)硝化培養(yǎng)體系中 (圖3-a)，當(dāng)NH4+-N 作為唯一的氮源被菌株利用時(shí)，菌株WM28 在第12 小時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，第24 小時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)OD600(1.004)，培養(yǎng)至第36 小時(shí)NH4+-N 被完全去除，表明其具有良好的異養(yǎng)硝化NH4+-N 去除性能；在脫氮前期有6～7 mg·L-1NO3--N 少量生成后被去除，無(wú)NO2--N 積累。

圖3 菌株WM28 在單一NH4+-N (a)、NO3--N (b)、NO2--N (c)模擬廢水中的生長(zhǎng)及脫氮性能注：初始無(wú)機(jī)氮質(zhì)量濃度 (C0,mg·L-1)，NH+4-N 為197.06，NO-3-N 為211.70，NO2--N 為194.04。Fig.3 Growth and denitrification performance of strain WM28 under a single NH4+-N (a),NO3--N (b) and NO2--N (c) simulated wastewaterNote: Initial inorganic nitrogen mass concentration (C0,mg·L-1): NH4+-N 197.06; NO3--N 211.70; NO2--N 194.04.

在單一NO-3-N 的好氧反硝化體系中 (圖3-b)，觀察到顯著的NO3--N 去除，48 h 后去除率為76.3%。菌株WM28 在第24 小時(shí)達(dá)到最大生長(zhǎng)OD600(0.762)，后呈下降趨勢(shì)，可能與此時(shí)高濃度的NO2--N 相關(guān)。在好氧反硝化過(guò)程中，NO-3-N 首先轉(zhuǎn)化為NO-2-N，最大質(zhì)量濃度為81.20 mg·L-1，最終降至15.61 mg·L-1。推測(cè)高濃度的NO2--N 會(huì)對(duì)菌株WM28 產(chǎn)生毒性，一定程度上抑制其生長(zhǎng)和代謝。

在單一NO2--N 的好氧反硝化體系中 (圖3-c)，菌株WM28 培養(yǎng)至第24 小時(shí)后達(dá)到最大生長(zhǎng)OD600(0.705)，48 h 后NO2--N 去除率為66.99%，表明具有良好的好氧亞硝酸鹽去除性能。單一NO3--N 和單一NO2--N 在36 h 后分別檢測(cè)到0.909和2.734 mg·L-1的NH4+-N 生成，王田野等[17]認(rèn)為，Acinetobactersp.SQ2 菌體在利用NO-3-N 或NO-2-N 為氮源生長(zhǎng)合成細(xì)胞內(nèi)源N 后，菌體進(jìn)入內(nèi)源期后部分內(nèi)源N 通過(guò)氨化作用轉(zhuǎn)化成為NH4+-N，從而導(dǎo)致水體中NH4+-N 的產(chǎn)生。

異養(yǎng)硝化和好氧反硝化是重要的能量代謝途徑。比較3 種單一氮源的結(jié)果，菌株WM28 在反應(yīng)體系中具有良好的氮源降解效果，異養(yǎng)硝化體系能夠?qū)H4+-N 完全降解，在生長(zhǎng)及脫氮性能上優(yōu)于好氧反硝化體系。因此，推測(cè)該菌株用于去除NH4+-N 的能量高于NO3--N 或NO-2-N，但因能量供應(yīng)導(dǎo)致的生長(zhǎng)及脫氮性能的差異還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

2.4 菌 株 WM28 對(duì)高濃度 NH4+-N 模擬廢水的耐受性

菌株WM28 在不同濃度的NH4+-N 模擬廢水中的耐受性結(jié)果 (圖4，表3)顯示，隨著NH4+-N 質(zhì)量濃度上升，菌株生長(zhǎng)的對(duì)數(shù)期逐漸延后，OD600最大值逐漸增大。100、200 和500 mg·L-1初始NH4+-N 質(zhì)量濃度中的NH4+-N 分別在第16、第24和第56 小時(shí)被完全去除；700 mg·L-1初始NH+4-N質(zhì)量濃度中的NH4+-N 在第116 小時(shí)后可被去除88% 以上；在第120 小時(shí)，菌株WM28 對(duì)1 000 mg·L-1初始NH4+-N 質(zhì)量濃度中的NH4+-N 去除率為74.38%，這說(shuō)明菌株WM28 具有良好的耐受高濃度NH4+-N 的能力，在初始NH4+-N 質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1時(shí)仍有脫氮能力。

表3 菌株WM28 在不同質(zhì)量濃度NH4+-N 模擬廢水中培養(yǎng)120 h 后的生長(zhǎng)及去除情況Table 3 Growth and removal of strain WM28 in simulated wastewater with different concentrations of NH4+-N for 120 h

圖4 菌株WM28 對(duì)高濃度NH4+-N 模擬廢水的耐受性Fig.4 Tolerance of strain WM28 to high concentrations of NH4+-N simulated wastewater

3 討論

3.1 赤紅球菌WM28 的安全性評(píng)價(jià)

作為天然環(huán)保制劑，微生態(tài)制劑能有效凈化水質(zhì)，改善生態(tài)環(huán)境，提高動(dòng)物的機(jī)體免疫力，故在水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域的應(yīng)用較為廣泛[18]。紅球菌屬是用于廢水處理的常見(jiàn)微生物，除了能夠有效降解苯酚、苯乙烯、鄰苯二甲酸酯、芘等有機(jī)化合物外，在處理含N 廢水上亦有較好效果[19-21]。例如，張智超等[19]從生豬養(yǎng)殖場(chǎng)篩出的紅球菌菌株ZZC-14 對(duì)NH4+-N 的降解率達(dá)到94.4%；田雅潔等[20]篩出的玫瑰紅紅球菌XH2 的最高NH4+-N 去除率均在98.0%以上，均能體現(xiàn)紅球菌屬在處理含N 廢水上的巨大潛能。但該屬部分菌種導(dǎo)致生物患病的報(bào)道亦令人擔(dān)憂(yōu)，如馬紅球菌 (R.equi) 導(dǎo)致馬駒(Equuscaballus) 患慢性化膿性支氣管肺炎、棒狀紅球菌 (R.kroppenstedtii) 致新生兒菌血癥和關(guān)節(jié)炎等[22-24]?；谒a(chǎn)健康養(yǎng)殖需要，微生態(tài)制劑研發(fā)篩選獲得菌株后需要重點(diǎn)關(guān)注風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)與安全性分析[25]。為確保微生物菌劑應(yīng)用中的生態(tài)環(huán)境安全和污染防治，本研究對(duì)篩選出的赤紅球菌WM28進(jìn)行了生物安全性評(píng)估，證明其是一株具有安全性的好氧反硝化菌株，在工廠化水產(chǎn)養(yǎng)殖領(lǐng)域具有潛在的開(kāi)發(fā)前景。但菌株對(duì)抗生素抗性是否具有轉(zhuǎn)移性或耐藥基因是否存在于菌株的DNA 上，仍需通過(guò)質(zhì)粒提取進(jìn)行更深入的實(shí)驗(yàn)研究[26]。

3.2 赤紅球菌WM28 的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化途徑

有研究表明，紅球菌屬通過(guò)完全異養(yǎng)硝化-好氧反硝化途徑除銨[27]。在已有的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化細(xì)菌的研究中，發(fā)現(xiàn)兩種不同的硝化途徑：NH4+-N→NH2OH→NO2--N (?NO3--N)→NO→N2O→N2和NH+4-N→NH2OH→N2O→N2。在菌株WM28 的異養(yǎng)硝化過(guò)程中，當(dāng)以NH4+-N 為唯一氮源時(shí)，培養(yǎng)48 h 后脫氮去除率為100%，顯著高于R.erythropolisATCC 4277 的47%[28]，脫氮效果明顯。異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中有NO3--N 少量積累，且無(wú)NO2--N 積累，這與Su 等[29]從對(duì)蝦養(yǎng)殖池中篩出的菌株GZWN4 的研究一致。本實(shí)驗(yàn)中，菌株WM28 的異養(yǎng)硝化作用與菌株生長(zhǎng)幾乎同步進(jìn)行。異養(yǎng)硝化途徑可能為NH4+-N→NH2OH→NO2--N→NO3--N[30]。而實(shí)驗(yàn)過(guò)程中積累的NO3--N 被菌株通過(guò)反硝化途徑去除。在菌株WM28 的好氧反硝化過(guò)程中，當(dāng)以NO3--N 為單一氮源時(shí)，NO3--N 先轉(zhuǎn)化為NO-2-N 后，再被去除；以NO-2-N 為單一氮源時(shí)，過(guò)程中無(wú)NO3--N 生成，推測(cè)反硝化途徑為NO3--N→NO2--N →NO→N2O→N2。因此，推斷菌株WM28能同時(shí)進(jìn)行硝化和反硝化作用，能夠快速高效進(jìn)行N 降解，在處理含N 廢水上有巨大的應(yīng)用潛能。但要驗(yàn)證菌株的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化途徑，還需要克隆菌株硝化、反硝化基因，例如氨氮加氧酶基因 (amo)、羥胺氧化酶基因 (hao)、硝酸鹽還原酶基因 (nap)、亞硝酸鹽還原酶基因 (nir)、氧化亞氮還原酶基因 (nos) 等[31]，以進(jìn)一步完善N 轉(zhuǎn)化途徑及代謝機(jī)制研究。

3.3 赤 紅球菌WM28 在高NH4+-N 廢水處理中的潛力

在高NH4+-N 廢水處理方面，雖已發(fā)現(xiàn)較多去除NH4+-N 的菌株，但紅球菌屬在NH4+-N 質(zhì)量濃度超過(guò)200 mg·L-1的廢水處理上的研究較少[32-34]，且存在耐受力低、應(yīng)用成本高等問(wèn)題。以往研究中，Wang 等[33]通過(guò)紫外線(xiàn)-硫酸二乙酯復(fù)合誘變得到了紅球菌ΔCPZ 24 對(duì)100 mg·L-1NH4+-N 的去除率為81.99%，但并未有更高濃度的進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)，且誘變工程菌處理水環(huán)境在安全性上存在一定隱患；而張衛(wèi)藝等[34]使用紅平紅球菌 (R.erythropolis) 處理豬場(chǎng)廢水的NH4+-N 去除率僅為59.35%。本研究的目的是篩選出一株能安全、高效處理工廠化養(yǎng)殖廢水的耐高NH4+-N 環(huán)境的新型好氧反硝化細(xì)菌。本研究從池塘環(huán)境中獲得的赤紅球菌WM28 能在100～500 mg·L-1NH4+-N 質(zhì)量濃度模擬廢水中完全將其去除，700 mg·L-1NH4+-N 在116 h 后被去除88%以上，在第120 小時(shí)對(duì)初始NH4+-N 質(zhì)量濃度為1 000 mg·L-1的廢水仍有脫氮能力，去除率為74.38%。相較于同屬其他降NH4+-N 菌株，WM28在較寬的N 濃度范圍內(nèi)表現(xiàn)出良好的脫氮能力，擴(kuò)大了其在廢水處理中的應(yīng)用。總之，赤紅球菌WM28 在處理高NH4+-N 廢水的微生態(tài)制劑開(kāi)發(fā)中極具潛力。

4 結(jié)論

赤紅球菌WM28 是一株抗生素敏感性高、生物安全性強(qiáng)的天然菌株；在3 種單一氮源模擬廢水條件下培養(yǎng)48 h，NH4+-N 、NO3--N、NO2--N 的去除率分別為100%、76.3%、66.9%；在高質(zhì)量濃度100～1 000 mg·L-1模擬NH4+-N 廢水條件下的耐受力強(qiáng)，120 h 內(nèi)NH4+-N 去除率可達(dá)74.38%～100%。綜上所述，該菌株對(duì)N 濃度適應(yīng)范圍廣，是一株安全高效的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌，在處理養(yǎng)殖尾水、工業(yè)廢水領(lǐng)域具有較好的應(yīng)用前景。但開(kāi)發(fā)新型的微生物制劑還需要考慮菌株的穩(wěn)定性，今后可以對(duì)菌株繼續(xù)進(jìn)行固定化研究，使其能以一定比例在漁業(yè)生產(chǎn)尾水中持續(xù)存在，實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定高效且可循環(huán)利用的綠色生產(chǎn)。