動(dòng)物源沙門氏菌的復(fù)蘇、保藏與抗藥性檢測(cè)

文│方杰（山東省青島市即墨區(qū)農(nóng)業(yè)農(nóng)村局）

為了掌握獸醫(yī)藥敏試驗(yàn)技術(shù)，復(fù)蘇與保藏了2013—2014年采集的不同動(dòng)物來源的沙門氏菌共300株，采用96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀檢測(cè)這些菌株對(duì)9種常用藥物（氨芐西林、硫酸粘菌素、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、硫酸新霉素、慶大霉素、頭孢噻呋、多西環(huán)素、氟苯尼考）的最低抑菌濃度（MIC）。96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀根據(jù)瓊脂稀釋法原理，結(jié)合圖像分析技術(shù)、數(shù)據(jù)庫(kù)技術(shù)和互聯(lián)網(wǎng)，構(gòu)建山東省的抗藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)。結(jié)果顯示，菌株復(fù)蘇率98%；動(dòng)物源沙門氏菌的抗藥頻率高，尤其是對(duì)多粘菌素藥物，抗藥率高達(dá)78.76%以上；多數(shù)菌株對(duì)4～6種藥物有抗性。鴨源沙門氏菌比豬源的抗藥性高，臨沂地區(qū)比平度地區(qū)抗藥性高。研究結(jié)果表明，沙門氏菌抗藥性較普遍，應(yīng)通過建立獸醫(yī)抗藥性監(jiān)測(cè)網(wǎng)進(jìn)行匯集和統(tǒng)一監(jiān)管，為抗菌藥物的有效使用提供依據(jù)和保障。

沙門菌屬是腸桿菌科中的一個(gè)大屬，是危害人類與畜禽等動(dòng)物的一類重要病原菌。該菌為革蘭氏陰性菌，無(wú)芽孢桿菌。禽類（特別是雞）感染沙門菌后容易引發(fā)多種疾病，主要為雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒3種。沙門氏菌感染人類而引發(fā)的一系列疾病已經(jīng)對(duì)人類的勞動(dòng)生產(chǎn)及人類自身健康產(chǎn)生了極大的影響，對(duì)公共衛(wèi)生安全和正常的生產(chǎn)秩序產(chǎn)生了不良影響，應(yīng)引起重視。近年來，隨著我國(guó)養(yǎng)殖業(yè)不斷增長(zhǎng)，抗生素的大量使用，使沙門氏菌的抗藥性逐漸增強(qiáng)，這也是危害養(yǎng)殖業(yè)的一大隱患。

藥敏試驗(yàn)通過采取不同形式的方法檢測(cè)一系列抗菌藥物對(duì)試驗(yàn)菌的抑制效果，并以一定的方式進(jìn)行結(jié)果描述，對(duì)臨床用藥有指導(dǎo)性意義。藥敏試驗(yàn)的常用方法有紙片法、E測(cè)定法和稀釋法。在本研究中，山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所根據(jù)CLSI提出了瓊脂稀釋法的工作原理，自主研發(fā)96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀及圖像采集系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)了藥敏檢測(cè)的大通量、高效率和結(jié)果采集自動(dòng)化。

一、實(shí)驗(yàn)材料

1.試劑。滅菌生理鹽水、滅菌水，無(wú)水乙醇、PBS（pH＝6，0.1摩爾/升）；MHB肉湯、MHA肉湯、普通瓊脂粉均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

2.試驗(yàn)設(shè)備和儀器。一次性培養(yǎng)皿、接種針、棉棒、紙片、酒精燈、甘油、EP管、鑷子等。

3.藥品。氟苯尼考可溶粉、硫酸慶大霉素可溶性粉、頭孢噻呋鈉、氨芐西林可溶性粉、硫酸黏菌素可溶性粉、硫酸新霉素可溶性粉、乳酸環(huán)丙沙星可溶性粉、鹽酸多西環(huán)素可溶性粉、鹽酸恩諾沙星均來自亞康藥業(yè)抗生素標(biāo)準(zhǔn)品。

二、試驗(yàn)方法

1.菌種的復(fù)蘇。

（1）培養(yǎng)基配制。MHA平板的配制：稱取MHA培養(yǎng)基以38克/升加入錐形瓶中，加水，搖勻，121℃、15分鐘條件下進(jìn)行高壓滅菌后冷卻至45～50℃。高壓滅菌過程中將一次性培養(yǎng)皿在超凈臺(tái)中進(jìn)行紫外線照射。將冷卻好的MHA培養(yǎng)液傾注于紫外線照滅菌的一次性培養(yǎng)皿中。將凝固好的瓊脂平板對(duì)應(yīng)需要復(fù)蘇的細(xì)菌進(jìn)行編號(hào)。

（2）細(xì)菌培養(yǎng)。將細(xì)菌從-20℃保存箱里取出，室溫解凍。用無(wú)菌接種針在潔凈工作臺(tái)中挑取菌液并劃線接種于編號(hào)相同的MH瓊脂培養(yǎng)基平皿上，需劃出單菌落。劃線后的MH瓊脂培養(yǎng)基平皿放置37℃恒溫箱中靜置培養(yǎng)18～24小時(shí)。

培養(yǎng)結(jié)束后取出培養(yǎng)皿，觀察是否所有培養(yǎng)皿細(xì)菌都生長(zhǎng)、是否為沙門氏菌，以及沒有被其他細(xì)菌污染。如果出現(xiàn)對(duì)應(yīng)培養(yǎng)基中沒有長(zhǎng)菌，則需要將原來菌樣放到37℃搖床中培養(yǎng)12小時(shí)以上，然后重新接種到培養(yǎng)皿中觀察。

（3）細(xì)菌保存。從溫箱中取出接種細(xì)菌的MHA培養(yǎng)皿，觀察每個(gè)平皿中的細(xì)菌生長(zhǎng)情況，選擇生長(zhǎng)良好的進(jìn)行細(xì)菌保存。細(xì)菌分為兩種保存方法：紙片法保存。在超凈臺(tái)中將滅好的2毫升EP管進(jìn)行編號(hào)，跟之前細(xì)菌編號(hào)一致，一一對(duì)應(yīng)；用鑷子夾取滅菌過的紙片4～6片平放到細(xì)菌生長(zhǎng)良好的MHA培養(yǎng)皿中，用鑷子輕輕夾取紙片在培養(yǎng)基表面蘸取細(xì)菌，然后夾取蘸有細(xì)菌的紙片放到對(duì)應(yīng)的EP管中，蓋好管蓋，進(jìn)行下一個(gè)細(xì)菌保存。甘油肉湯保存法。取滅菌的2毫升EP管，用移液槍在每個(gè)管中加入1毫升配好的滅菌過的甘油肉湯，將EP管進(jìn)行編號(hào)，與原細(xì)菌編號(hào)相同，再用高壓滅菌好的棉棒在細(xì)菌生長(zhǎng)良好的MHA培養(yǎng)基表面輕輕滑動(dòng)，將細(xì)菌蘸取到棉棒上，將棉棒放入對(duì)應(yīng)編號(hào)的甘油肉湯中，用力擠壓，使細(xì)菌能夠完全稀釋到生理鹽水中，蓋緊管蓋。將用紙片法保存的細(xì)菌放入冰箱中儲(chǔ)存，將甘油肉湯法保存的細(xì)菌放入到-20℃儲(chǔ)存，以備常用。

2.MIC的測(cè)定。

（1）藥物平板的配制。將抗菌藥物粉劑按照有效含量計(jì)算，判定完全抑制菌落生長(zhǎng)的抗菌藥物的濃度即為殺菌濃度，將HPLC純度、含水量、鹽的形式提供的藥物活性分?jǐn)?shù)都考慮在內(nèi)，獲得各種藥物預(yù)計(jì)的終濃度溶液。

（2）用96點(diǎn)陣接種儀接種。選取需要測(cè)定的細(xì)菌和質(zhì)控菌株，在MHA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，方法同細(xì)菌復(fù)蘇培養(yǎng)法。

取96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀，將高壓滅菌過的96孔針安裝到96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀上。取加樣好的96孔菌樣放置到96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀的一端，第一個(gè)接種對(duì)照組空白瓊脂板，再將不同藥物濃度梯度的瓊脂板從低濃度到高濃度依次接種，在所有藥物平板接種大約到一半數(shù)量時(shí)增加另外一個(gè)空白瓊脂板作為第二個(gè)對(duì)照。將所有平板按順序倒放在37℃恒溫箱中恒溫培養(yǎng)18～24小時(shí)。

（3）結(jié)果圖像采集和MIC統(tǒng)計(jì)。從溫箱中取出平板按順序放好，從低濃度到高濃度排放。鏈接藥敏圖像采集儀，打開電腦中的藥敏檢測(cè)軟件，輸入相應(yīng)信息，按藥物濃度由16R到1/8R設(shè)置藥物梯度。設(shè)備連接好后將藥物瓊脂培養(yǎng)基按不同的藥物由低濃度到高濃度依次放入藥敏圖像檢測(cè)儀中進(jìn)行拍照采集，采集沙門氏菌在不同藥物及同種藥物不同藥物濃度下的生成情況，采集結(jié)束將采集到的所有數(shù)據(jù)統(tǒng)一保存到數(shù)據(jù)庫(kù)中做進(jìn)一步處理。應(yīng)注意到儀器在采集過程中可能會(huì)出現(xiàn)誤差，需要人工檢查，并及時(shí)修改。

三、試驗(yàn)結(jié)果與分析

1.菌株復(fù)蘇與保藏。細(xì)菌在MHA培養(yǎng)基上基本生長(zhǎng)良好，出現(xiàn)單菌落，根據(jù)單菌落的形態(tài)基本能確定是純凈的復(fù)蘇前細(xì)菌，對(duì)在MHA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的細(xì)菌進(jìn)行保存。

細(xì)菌經(jīng)過MHA培養(yǎng)基培養(yǎng)后生長(zhǎng)良好，也有因?yàn)樵囼?yàn)操作原因出現(xiàn)個(gè)別MHA培養(yǎng)基上的細(xì)菌沒有生長(zhǎng)，再次培養(yǎng)后細(xì)菌生長(zhǎng)良好。最后，將所有生長(zhǎng)良好的細(xì)菌在紙片保藏和甘油肉湯保藏兩種保存方法下存儲(chǔ)到冰箱中低溫保藏。

2.沙門氏菌MIC測(cè)定結(jié)果。由MIC分布圖可見，此次沙門氏菌對(duì)以上9種藥物的敏感性有所差異，可以直觀地看到對(duì)多粘菌素的抗性菌較多，抗藥率為78.76%；其次是恩諾沙星的抗藥率為73.07%。頭孢噻呋鈉的抗藥率較低，為22.74%。環(huán)丙沙星、氨芐西林、新霉素和慶大霉素分布跨度比較大，抗藥率分別為71.15%、57.91%、46.32%和41.71%。多西環(huán)素和氟苯尼考的抗藥率分別為61.92%和46.15%。

多重抗藥菌是指有多重抗藥性的病原菌，是同一病原菌對(duì)三類或三類以上抗菌藥物同時(shí)耐藥的現(xiàn)象。

通過上表可以得出，本試驗(yàn)的200株沙門氏菌存在較高的多重耐藥性，多重耐藥率高達(dá)74.5%。沙門氏菌出現(xiàn)較高的多重耐藥性，增加了治療沙門氏菌的難度。

四、討論

1.細(xì)菌復(fù)蘇重要性。細(xì)菌的復(fù)蘇是很重要的基礎(chǔ)試驗(yàn)，本試驗(yàn)可以確保細(xì)菌活性，對(duì)研究細(xì)菌耐藥性提供材料與基礎(chǔ)。雖然細(xì)菌復(fù)蘇是很簡(jiǎn)單的試驗(yàn)，但只有不斷保留原始證據(jù)才能發(fā)現(xiàn)和解決問題。可以根據(jù)之前細(xì)菌抗藥性的特點(diǎn)了解到當(dāng)時(shí)的用藥情況，還可以比較之前細(xì)菌跟現(xiàn)在細(xì)菌的抗藥性，發(fā)現(xiàn)細(xì)菌跟藥物之間存在的問題與聯(lián)系。

2.96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀的優(yōu)勢(shì)。

在采樣基數(shù)龐大的前提下，本試驗(yàn)運(yùn)用了96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀系統(tǒng)進(jìn)行科學(xué)的藥敏試驗(yàn)，得到樣本的具體MIC，簡(jiǎn)便快捷。比起微量肉湯稀釋法更加節(jié)約成本，節(jié)省資源，簡(jiǎn)單高效，科學(xué)準(zhǔn)確；比起紙片擴(kuò)散法測(cè)量抑菌圈直徑，這種方法可以得到具體的MIC值，方便給臨床選藥和確定用量提供更直接的理論依據(jù)。而連接計(jì)算機(jī)設(shè)備的數(shù)字化讀數(shù)方法更是將主觀誤差減到最小。

96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀的創(chuàng)新與使用實(shí)現(xiàn)了藥敏檢測(cè)大通量、高效率和準(zhǔn)確度高的目標(biāo)，減小了人為誤差，可準(zhǔn)確、高效地收集大量數(shù)據(jù)并保存。96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)儀將漸漸取代原始的藥敏檢測(cè)方法，但96點(diǎn)陣藥敏檢測(cè)由微量肉湯檢測(cè)法不斷演變而來，依然沒法完全包含微量肉湯檢測(cè)法的全部?jī)?yōu)點(diǎn)，所以96點(diǎn)陣檢測(cè)儀依然在不斷改進(jìn)和創(chuàng)新。

3.抗藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)體系的建立?？股厥侵委焺?dòng)物疾病的重要產(chǎn)品，但長(zhǎng)期濫用抗生素會(huì)使病原菌產(chǎn)生抗藥性，在畜產(chǎn)品和環(huán)境中也會(huì)有大量殘留，因此，建立完善的抗藥性監(jiān)測(cè)技術(shù)體系勢(shì)在必行。

表1 動(dòng)物源沙門氏菌多重抗藥情況