鐵門關(guān)地區(qū)奶牛肺炎細(xì)菌分離鑒定及3 種主要致病菌體外抑菌試驗

武魁，覃杰

（1.第二師24 團(tuán)農(nóng)發(fā)中心 新疆巴音郭楞 841200；2.第二師畜牧獸醫(yī)工作站 新疆鐵門關(guān) 841005）

肺炎是奶牛最常見和危害最嚴(yán)重的疾病之一，嚴(yán)重降低養(yǎng)殖戶積極性[1]。病原菌感染是引起奶牛肺炎的主要原因之一，目前治療奶牛肺炎主要依靠抗菌藥物，但隨著抗菌藥的長期大量使用，病菌逐漸產(chǎn)生了耐藥性，對治療肺炎帶來較大的影響。中藥治療奶牛肺炎，具有無藥殘、無耐藥性等優(yōu)點，但也存在療效不穩(wěn)定、療程長等缺點。消毒液能有效殺滅環(huán)境細(xì)菌，對預(yù)防奶牛肺炎有重要的作用。本試驗對從鐵門關(guān)地區(qū)奶牛肺炎分離鑒定出溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌和肺炎鏈球菌這3 種主要致病菌進(jìn)行體外抑菌試驗，找到高效抗菌藥和環(huán)境消毒藥，篩選高效中西藥，以期提高治療效果。

1 材料與方法

1.1 材料

1）樣品采集。在鐵門關(guān)地區(qū)3 家規(guī)模奶牛場和6 家散養(yǎng)戶采集肺炎奶牛臟器（肝、肺、心、脾和腎）和鼻拭子（采集前不對肺炎牛進(jìn)行任何針對性治療和免疫），共50 份。

2）主要培養(yǎng)基和試劑。血清營養(yǎng)瓊脂、MH 肉湯脂等，按常規(guī)方法配置[2]，藥敏紙片按照徐叔云方法制作[3]。

3）主要培養(yǎng)基：普通營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、普通瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血瓊脂培養(yǎng)基、脫纖維羊血。細(xì)菌微量生化反應(yīng)管購自杭州濱和微生物試劑有限公司。

4）藥物。抗生素：頭孢喹肟、氨芐西林、頭孢噻呋鈉、頭孢氨芐、慶大霉素、克林霉素、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、四環(huán)素、泰拉霉素、磺胺嘧啶鈉、氟苯尼考；消毒液：氫氧化鈉、聚維酮碘、次氯酸鈉、苯扎溴銨、碘附；中藥注射液：板藍(lán)根注射液、魚腥草注射液、雙黃連注射液，小檗堿注射液[4]。復(fù)方中藥：購置單味中藥，按照要求配成荊防敗毒散、款冬花散、清肺散、銀翹散、麻杏石甘湯、參附湯、養(yǎng)陰清肺湯[4]，采用水煎法熬成湯劑，含生藥1 g/mL 的濃度湯劑。以上藥物購自巴州鑫鑫畜牧有限公司和庫爾勒久久動物醫(yī)院。

1.2 方法

1）細(xì)菌分離鑒定。將采集的臟器、鼻拭子樣品按照常規(guī)劃線分離細(xì)菌的方法接種于普通營養(yǎng)瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、血平板培養(yǎng)基上，于37 ℃細(xì)菌恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察菌落生長情況及形態(tài)特征，挑取典型單個菌落涂片，革蘭氏染色，鏡檢。根據(jù)菌落形態(tài)特征、溶血與否、染色特性及菌體形態(tài)初步判定細(xì)菌類屬，參考各種細(xì)菌的生化特性，根據(jù)染色、鏡檢結(jié)果對分離的菌株有選擇地進(jìn)行生化試驗[5-6]。

2）體外抑菌實驗。抗生素采用K-B 紙片法[3]。將病菌接種于羊血清營養(yǎng)肉湯，37 ℃培養(yǎng)18 h，所得菌液用麥?zhǔn)蠞岱ㄟM(jìn)行比濁，用生理鹽水稀釋使其含菌量為1 億個/mL。吸取菌液0.1 mL 用滅菌L型玻璃棒均勻涂在加血清MH 瓊脂平板表面。然后貼上藥敏紙片。中藥采用瓊脂平板打孔法，在涂布好細(xì)菌的血清MH 瓊脂平板上，用直徑為6 mm 的無菌打孔器打孔，除去瓊脂，吸取含生藥1 g/mL的中藥加入孔中，以剛剛注滿為準(zhǔn)。每種藥物都做3 個重復(fù)。培養(yǎng)24 h 后，游標(biāo)卡尺測定抑菌圈直徑。消毒藥采用肉湯二倍稀釋法[3]，檢測最低抑菌濃度。

1.3 判定標(biāo)準(zhǔn)

抗生素采用按表1 的方法判斷結(jié)果[3]；中藥判定結(jié)果：即：抑菌直徑≥20 mm 為極敏，20 mm＞抑菌直徑≥15 mm 為高敏；15 mm＞抑菌直徑≥10 mm 為中敏，10 mm 以下為低敏。

表1 藥敏試驗結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離鑒定結(jié)果。

在血清瓊脂平板上淡灰白色、閃光的露珠狀小菌落。堿性亞甲藍(lán)染色鏡檢可見兩極濃染菌體。生化鑒定結(jié)果：分解葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露糖和半乳糖，產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。發(fā)酵甘露醇、山梨醇和木糖。對乳糖、鼠李糖、楊昔、肌醇、菊糖、側(cè)金盞花醇不發(fā)酵。形成靛基質(zhì)，觸酶和氧化酶均為陽性，甲基紅試驗和VP 試驗均為陰性。鑒定為多殺性巴氏桿菌。

在血清瓊脂平板上光滑、半透明的菌落，直徑1～2 mm。堿性美藍(lán)染色鏡檢可見兩極濃染菌體。發(fā)酵葡萄糖不產(chǎn)氣，氧化酶陽性。不發(fā)酵山梨糖、海藻糖、甘露糖、阿拉伯糖或葡萄糖苷。發(fā)酵甘露醇、山梨醇、木糖、麥芽糖及糊精。靛基質(zhì)試驗陰性。鑒定為溶血性曼氏桿菌。

在血清瓊脂平板形成小圓形、隆起、表面光滑、濕潤的菌落。培養(yǎng)初期菌落隆起昰穹隆形，隨著培養(yǎng)時間延長，邊緣隆起成“臍狀”。膽汁溶解試驗陽性、Optochin 敏感試驗陽性。鑒定為肺炎鏈球菌。

溶血性曼氏桿菌檢出率最高32%，其次為肺炎鏈球菌24%，再次多殺性巴氏桿菌22%，見表2。

表2 細(xì)菌檢測結(jié)果

2.2 抗菌藥試驗結(jié)果

抗生素中對溶血性曼氏桿菌敏感的為頭孢喹肟、頭孢氨芐、達(dá)氟沙星、泰拉霉素、氟苯尼考；對多殺性巴氏桿菌敏感的為頭孢喹肟、達(dá)氟沙星、氟苯尼考、泰拉霉素；對肺炎鏈球菌敏感的為頭孢喹肟、頭孢噻呋鈉、氟苯尼考、泰拉霉素；中藥注射液中小檗堿注射液對溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌、肺炎鏈球菌極敏，雙黃連注射液對溶血性曼氏桿菌、多殺性巴氏桿菌中敏。復(fù)方中藥中清肺散對溶血性曼氏桿菌中敏，對其余兩種致病菌低敏，荊防敗毒散銀翹散對溶血性曼氏桿菌低敏麻杏石甘湯對多殺性巴氏桿菌低敏，其余無抑菌圈，具體結(jié)果見表3。

表3 各種藥物對三種主要致病菌的抑菌效果（單位mm）

2.3 消毒藥實驗結(jié)果

消毒液中MIC 最低是氫氧化鈉，其次為碘附，聚維酮碘、次氯酸鈉、苯扎溴銨相對較高，具體見表4。

表4 消毒液的最低抑菌濃度（MIC）

3 討論

肺炎病因復(fù)雜，但主要有兩個方面：①病原性肺炎由病毒、細(xì)菌或寄生蟲引起；②是非病原性肺炎由營養(yǎng)因素及飼養(yǎng)管理引起。本實驗對肺炎進(jìn)行分離鑒定發(fā)現(xiàn)溶血性曼氏桿菌檢出率最高32%，其次為肺炎鏈球菌24%，再次多殺性巴氏桿菌22%，并且多為混合感染，說明奶牛感染這3 種病原菌嚴(yán)重。本試驗中有2 份樣品未檢測到任何病原，可能為非病原性肺炎。

3 種主要病原菌對頭孢喹肟、頭孢氨芐、氟苯尼考、泰拉霉素敏感，對磺胺嘧啶鈉和四環(huán)素已經(jīng)完全耐藥，對其它藥物也有不同程度的耐藥?？梢妼ΤＳ玫目股匾旬a(chǎn)生不同程度耐藥性，對不常用的產(chǎn)生耐藥性的少?？赡苁丘B(yǎng)殖場由于長期大劑量的使用某些抗生素，從而導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生。選擇頭孢喹肟、頭孢氨芐、氟苯尼考、泰拉霉素這4 種抗生素對治療奶牛肺炎可能有較好的效果。

在幾種常用的中藥注射液中小檗堿具有較好的抑菌效果，其它單味中藥抑菌效果較差。在復(fù)方中藥中，所選擇的復(fù)方都是治療奶牛肺炎的經(jīng)典藥物，其中清肺散對3 種病菌有一定的效果，銀翹散對溶血性曼氏桿菌有一定效果麻杏石甘湯對多殺性巴氏桿菌有一定效果，其它復(fù)方體外抑菌效果都較差，這可能中藥主要通過增加機(jī)體的免疫力來抑菌、殺菌，不直接殺菌有關(guān)。選擇小檗堿、清肺散、銀翹散、麻杏石甘湯治療奶牛肺炎可能有較好的效果。

根據(jù)效果在消毒液中氫氧化鈉對主要病原菌的抑菌效果都好，其余幾種藥浴液出現(xiàn)不同程度的低敏現(xiàn)象。說明某些細(xì)菌已產(chǎn)生耐藥性。這就要求低敏消毒液使用濃度要高于規(guī)定的使用濃度，否則沒有殺菌效果或?qū)δ撤N細(xì)菌殺菌效果差。消毒液選用氫氧化鈉可能有較好的效果?！?/p>