小兒化積顆粒調(diào)節(jié)胃腸功能的藥效學(xué)及質(zhì)量控制研究

劉全國，宮 辰，陳金鵬，劉 毅，蓋曉紅，田成旺*，陳常青*

1. 海南葫蘆娃藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，海南 ?？?570216

2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617

3. 天津藥物研究院，和光中藥科技（天津）有限公司，天津 300462

4. 天津市中藥質(zhì)量標(biāo)志物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

5. 藥物成藥性評(píng)價(jià)與系統(tǒng)轉(zhuǎn)化全國重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300462

積滯是小兒常見的脾胃系疾病之一，3～8 歲兒童高發(fā)，未得到及時(shí)診治會(huì)影響患兒的體格與智力發(fā)育。西醫(yī)多采用針對(duì)病因的藥物治療，但缺乏系統(tǒng)評(píng)價(jià)以支持其療效。中醫(yī)藥治療小兒積滯歷史悠久，經(jīng)驗(yàn)豐富[1]。積滯的主要病機(jī)為中焦積而不化，氣滯不行。而化積組方對(duì)于積滯有良好的療效。

小兒化積片為海南葫蘆娃藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的明星產(chǎn)品，具有消食化積的作用，用于治療小兒脾胃不和、停食停乳、積聚痞塊、肚腹膨脹、四肢倦怠、面色萎黃、不思飲食等癥，有著多年的臨床應(yīng)用基礎(chǔ)，療效確切。該方由山楂（焦）、麥芽（炒）、六神曲（麩炒）、檳榔（炒）、雞內(nèi)金（炒）、牽牛子（炒）組成。山楂具有消食健胃、行氣散瘀和化濁降脂的功效，為消食導(dǎo)積要藥[2-3]，其中的山楂中總黃酮類有促進(jìn)胃腸功能、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝的作用[4]；麥芽具有行氣消食、健脾開胃、回乳消脹，善消導(dǎo)米面諸果食積等功效；六神曲具有健脾和胃、消食調(diào)中的作用，用于脾胃虛弱、飲食停滯、胸痞腹脹、小兒食積等癥[5]；檳榔藥效廣泛，具有驅(qū)殺寄生蟲及助消化等藥理作用[6-7]。其中的主要藥效成分檳榔堿具有增加胃腸蠕動(dòng)、增強(qiáng)唾液分泌、促進(jìn)消化等功能[8]；雞內(nèi)金具有健胃消食、澀精止遺、通淋化石的作用，用于食積不消、嘔吐瀉痢、小兒疳積等癥；牽牛子具有瀉水通便、消痰滌飲、殺蟲攻積的作用，用于消食化積等癥。6 味藥組方使用可消食化積，理氣行滯。

小兒化積片市售劑型為片劑，該劑型對(duì)于幼兒來講存在片重大、水送服用困難等情況；另外口嚼服藥，兒童不配合，順應(yīng)差，在一定程度上限制了患者的用藥，難以滿足臨床及市場需求。因此在臨床和市場調(diào)研的基礎(chǔ)上將小兒化積片改變?yōu)檫m合兒童服用的顆粒劑。本研究使用ICR 幼齡小鼠以及SD大鼠進(jìn)行化積顆粒的胃腸功能性實(shí)驗(yàn)，觀察其對(duì)小鼠的胃腸功能性影響，效果良好，并且提示毒性成分在安全有效范圍內(nèi)；此外，在原劑型小兒化積片中定量項(xiàng)為有機(jī)酸的基礎(chǔ)上，增加了藥效成分檳榔堿的含量測定方法，對(duì)其在化積顆粒中的含量測定、方法學(xué)考察進(jìn)行研究，建立化積顆粒更完整、全面的質(zhì)量控制方法，為小兒化積顆粒的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)，臨床應(yīng)用提供可靠的保障。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF 級(jí)ICR 幼齡小鼠100 只，體質(zhì)量12～14 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001（用于小鼠腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)）。

SPF 級(jí)SD 大鼠40 只，體質(zhì)量50～70 g，雌雄各半，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2012-0001（用于大鼠胃酸分泌實(shí)驗(yàn)）。

本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用經(jīng)機(jī)構(gòu)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理與使用委員會(huì)（IACUC）批準(zhǔn)（倫理批準(zhǔn)號(hào)2016040101）。溫度、濕度、換氣次數(shù)由中央系統(tǒng)自動(dòng)控制，溫度20～26 ℃，相對(duì)濕度40%～70%，通風(fēng)次數(shù)為10～15 次/h 全新風(fēng)，光照為12 h 明、12 h 暗。大鼠飼料由天津市華榮實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司提供，飲用多重微孔濾膜過濾系統(tǒng)制備的無菌水（四級(jí)過濾紫外滅菌）。

1.2 藥品與試劑

小兒化積顆粒（批號(hào)20151217，相當(dāng)于8.93 g生藥/g 干膏粉）、小兒化積顆粒3 批中試樣品（批號(hào)20160620、20160625、20160629）由天津藥物研究院有限公司提供；化積片（批號(hào)150101）購自承德新愛民制藥有限公司；異氟烷（批號(hào)C002150201）購自河北一品制藥股份有限公司；NaOH（批號(hào)20120202）購自天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司；阿拉伯膠（批號(hào)20130507）購自天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司；印度墨汁（批號(hào)20090115）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；胃蛋白酶測試盒（批號(hào)20160419）購自南京建成生物工程研究所；對(duì)照品氫溴酸檳榔堿（批號(hào)111684-200401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%）、枸櫞酸（批號(hào)100396-201302，質(zhì)量分?jǐn)?shù)100.0%）購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，甲醇為分析純，磷酸為分析純，三乙胺為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 儀器

AB204-N 型電子天平、DL53 型電位滴定儀[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；BT-25S 型電子天平（德國Sartorius 公司）；Varioskan Flash 酶標(biāo)儀（美國Thermo Fisher Scientific 公司）；LXJ-ⅡB 型低速大容量多管離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器有限公司）；1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；PHS-25 型pH 計(jì)（上海雷磁公司）。

2 方法

2.1 小兒化積顆粒調(diào)節(jié)胃腸功能的作用

2.1.1 對(duì)幼齡小鼠腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響 50 只ICR幼齡小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及小兒化積顆粒高、中、低劑量（5.00、2.50、1.25 g/kg）組和化積片（2.5 g/kg）組，每組10 只，雌雄各半。每天ig 給藥1 次，連續(xù)3 d，給藥體積20 mL/kg，對(duì)照組ig 等體積去離子水。于末次給藥（給藥前小鼠禁食5 h）后40 min，各組小鼠ig 2%印度墨汁（用5%阿拉伯膠溶液配制），20 min 后脫頸椎處死小鼠，剖開腹部，輕輕取出并分離整個(gè)胃至肛門的腸段，平鋪于蠟板上，測量幽門到回盲部的長度，作為小腸全長，再測量幽門到墨汁推進(jìn)前沿的長度為小腸推進(jìn)長度，計(jì)算腸推進(jìn)率。將各給藥組與對(duì)照組平均腸推進(jìn)率比較，進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)。

2.1.2 對(duì)幼齡小鼠胃排空的影響 50 只ICR 幼齡小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及小兒化積顆粒高、中、低劑量（5.00、2.50、1.25 g/kg）組和化積片（2.5 g/kg）組，每組10 只，雌雄各半。按“2.1.1”項(xiàng)下方法給藥，于末次給藥前禁食4 h、末次藥后40 min，ig 0.1%酚紅溶液（0.2 mL/只），20 min 后處死小鼠，摘取胃，置于燒杯中，沿胃大彎剪開胃，用5 mL 蒸餾水沖洗胃內(nèi)容物，調(diào)pH 值為6.0～6.5，3000 r/min離心10 min，分離上清液。用酶標(biāo)儀在波長420 nm下測定各樣品中酚紅的吸光度（A）值，以0.1%酚紅0.2 mL 加蒸餾水至5 mL 溶液的A值作為酚紅吸收基數(shù)，計(jì)算各組動(dòng)物胃中酚紅殘留率，各給藥組與對(duì)照組胃中酚紅殘留率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)。

2.1.3 對(duì)幼齡大鼠胃酸分泌以及胃蛋白酶活性的影響 50 只幼齡SD 大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組及小兒化積顆粒高、中、低劑量（3.2、1.6、0.8 g/kg）組和化積片（1.6 g/kg）組，每組10 只，雌雄各半。每天ig給藥1 次，連續(xù)3 d，對(duì)照組ig 等體積去離子水。動(dòng)物禁食不禁水16 h，末次給藥后1 h，異氟烷麻醉，仰位固定，腹部剃毛，常規(guī)消毒，于劍突下沿正中線剪1 個(gè)約1.5 cm 切口，輕取胃，在胃幽門與十二指腸結(jié)合部用手術(shù)線結(jié)扎胃幽門，縫合切口。術(shù)后禁食、禁水4 h 后，用異氟烷麻醉后脫頸椎處死，剖開切口，結(jié)扎胃賁門，取出胃，沿胃大彎剖開，收集胃液，3000 r/min 離心10 min，吸取上清液，測量胃液體積。取胃液0.5 mL 置入小錐形瓶中，加入酚酞指示劑1 滴，以0.01 mol/L 氫氧化鈉滴定至出現(xiàn)紅色（顏色不再加深）為終點(diǎn)。計(jì)算胃酸分泌速度。用試劑盒測定胃液胃蛋白酶活性（比色法），將各給藥組與對(duì)照組的胃液體積、胃酸分泌速度及胃蛋白酶活性進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)t檢驗(yàn)。

2.2 檳榔堿的含量測定

2.2.1 色譜條件 Dikma Diamonsil-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈-三乙胺溶液（15∶85，2 mL 三乙胺加入1000 mL 水中，磷酸調(diào)節(jié)pH 值至7.0）；檢測波長為215 nm；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

2.2.2 溶液的制備

（1）對(duì)照品溶液的制備：精密稱取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品適量，加流動(dòng)相制成0.360 4 mg/mL 的氫溴酸檳榔堿對(duì)照品儲(chǔ)備液（即檳榔堿對(duì)照品儲(chǔ)備液質(zhì)量濃度為0.236 9 mg/mL）。精密吸取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品儲(chǔ)備液1.0 mL，置10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即得對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備：取小兒化積顆粒，研細(xì)，取約5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醚50 mL，再加碳酸鹽緩沖液（取碳酸鈉1.91 g 和碳酸氫鈉0.56 g，加水溶解成100 mL）3 mL，放置30 min，振搖；加熱回流30 min，取乙醚液，殘?jiān)右颐鸭訜峄亓魈崛? 次，50mL/次，每次15 min，合并3 次乙醚液，加入磷酸溶液l mL，混勻，回收乙醚，殘?jiān)?0 %乙腈溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 量瓶中，加50%乙腈至刻度；搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

（3）陰性供試品溶液的制備：按小兒化積顆粒處方制法，制得缺炒檳榔的陰性顆粒，按供試品的溶液的制備方法制備，即得陰性供試品溶液。

2.2.3 HPLC 分析 分別精密吸取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，即得。

2.3 有機(jī)酸的含量測定

2.3.1 溶液的制備

（1）枸櫞酸對(duì)照品溶液制備：取枸櫞酸對(duì)照品適量，精密稱定，加水溶解制成質(zhì)量濃度為1.120 4 mg/mL 的枸櫞酸對(duì)照品溶液。

（2）供試品溶液的制備：取小兒化積顆粒，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，精密加水50 mL，搖勻，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，取出，稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，照電位滴定法，用0.05 mol/L 氫氧化鈉滴定液進(jìn)行滴定至pH 8.7，即得。每毫升氫氧化鈉滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于3.202 mg 的枸櫞酸。

（3）氫氧化鈉滴定液配制及標(biāo)定：照《中國藥典》2020 年版四部通則8006 項(xiàng)下，依法配制0.05 mol/L 氫氧化鈉滴定液，并進(jìn)行標(biāo)定。

2.3.2 測定方法 照電位滴定法（《中國藥典》2020年版四部通則0701）測定。

3 結(jié)果

3.1 小兒化積顆粒對(duì)胃腸運(yùn)動(dòng)的作用

3.1.1 小兒化積顆粒對(duì)幼齡小鼠腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響如表1 所示，與對(duì)照組比較，小兒化積顆粒高、中劑量組及化積片組能夠顯著延長幼齡小鼠腸推進(jìn)率（P＜0.05）。其中小兒化積顆粒中劑量組延長幼齡小鼠腸推進(jìn)率與同劑量的化積片比較未見顯著性差異。結(jié)果表明，小兒化積顆粒和化積片均有推動(dòng)幼齡小鼠腸運(yùn)動(dòng)的作用，小兒化積顆粒的腸推進(jìn)作用與同劑量的化積片相當(dāng)。

表1 小兒化積顆粒對(duì)幼齡小鼠腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響 (±s,n = 10)Table 1 Effect of Xiaoer Huaji Granules on intestinal propulsion in young mice (±s, n = 10)

表1 小兒化積顆粒對(duì)幼齡小鼠腸推進(jìn)運(yùn)動(dòng)的影響 (±s,n = 10)Table 1 Effect of Xiaoer Huaji Granules on intestinal propulsion in young mice (±s, n = 10)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001，下表同*P < 0.05**P < 0.01***P < 0.001 vs control group, same as below tables

組別 劑量/(g·kg?1) 腸推進(jìn)率/%對(duì)照 － 56.7±9.2小兒化積顆粒 5.00 67.5±11.3*2.50 67.0±10.9*1.25 57.5±9.1化積片 2.5 65.6±6.1*

3.1.2 小兒化積顆粒對(duì)幼齡小鼠胃排空的影響 如表2 所示，與對(duì)照組比較，小兒化積顆粒各劑量組及化積片組能夠顯著減少幼齡小鼠胃中酚紅殘留率（P＜0.05）。其中小兒化積顆粒中劑量組減少幼齡小鼠胃中酚紅殘留率與同劑量的化積片比較未見顯著性差異，結(jié)果表明，小兒化積顆粒和化積片均有推動(dòng)幼齡小鼠胃排空的作用，小兒化積顆粒的胃排空作用與同劑量的化積片相當(dāng)。

表2 小兒化積顆粒對(duì)幼齡小鼠胃排空的影響 (±s,n = 10)Table 2 Effect of Xiaoer Huaji Granules on gastric emptyin function in young mice (±s, n = 10)

表2 小兒化積顆粒對(duì)幼齡小鼠胃排空的影響 (±s,n = 10)Table 2 Effect of Xiaoer Huaji Granules on gastric emptyin function in young mice (±s, n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 胃中酚紅殘留率/%對(duì)照 － 28.381±4.328小兒化積顆粒 5.00 17.510±3.821***2.50 15.227±3.786***1.25 17.675±3.111***化積片 2.5 15.889±3.954***

3.1.3 小兒化積顆粒對(duì)幼齡大鼠胃酸分泌以及胃蛋白酶活性的影響 如表3 所示，與對(duì)照組比較，小兒化積顆粒各劑量組和化積片組均顯著增加大鼠胃液體積和胃蛋白酶活性（P＜0.05、0.01、0.001），小兒化積顆粒高、中劑量組和化積片組顯著提高胃酸分泌速度（P＜0.05、0.01）；小兒化積顆粒中劑量組增加大鼠胃液體積、胃蛋白酶活性和提高胃酸分泌速度與同劑量的化積片比較未見顯著性差異。結(jié)果表明，小兒化積顆粒和化積片均有增加大鼠胃液體積、胃蛋白酶活性和提高胃酸分泌速度的作用，并且小兒化積顆粒的作用與同劑量的化積片相當(dāng)。

表3 小兒化積顆粒對(duì)幼齡大鼠胃液分泌和胃蛋白酶活性的影響 (±s, n = 10)Table 3 Effects of Xiaoer Huaji Granules on gastric secretion and pepsin activity in young rats (±s, n = 10)

表3 小兒化積顆粒對(duì)幼齡大鼠胃液分泌和胃蛋白酶活性的影響 (±s, n = 10)Table 3 Effects of Xiaoer Huaji Granules on gastric secretion and pepsin activity in young rats (±s, n = 10)

組別 劑量/(g·kg?1) 胃液體積/mL 胃酸分泌速度/(mmol·h?1) 胃蛋白酶活性/(U·mL?1)對(duì)照 － 2.0±1.0 54.3±27.1 19.70±7.47小兒化積顆粒 3.2 3.8±0.9*** 81.7±17.1* 50.59±22.64**1.6 3.4±1.0** 101.4±28.5** 36.24±15.15*0.8 3.1±0.6** 73.4±21.1 29.78±11.43*化積片 1.6 3.6±1.0** 105.3±37.0** 28.53±6.75*

3.2 檳榔堿的含量測定

3.2.1 專屬性實(shí)驗(yàn) 分別精密吸取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性供試品溶液各10 μL，注入液相色譜儀，測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，該色譜條件下，對(duì)照品溶液中氫溴酸檳榔堿的色譜峰峰形良好，供試品溶液中氫溴酸檳榔堿相應(yīng)保留時(shí)間處的色譜峰峰形良好，氫溴酸檳榔堿色譜峰與雜質(zhì)峰的分離度大于1.5，陰性供試品溶液中在氫溴酸檳榔堿色譜峰相應(yīng)保留時(shí)間處無色譜峰出現(xiàn)，該色譜條件專屬性良好。

3.2.2 柱效及分離度測定 在選定色譜條件下，對(duì)供試品溶液中氫溴酸檳榔堿色譜峰的理論塔板數(shù)和分離度進(jìn)行測定，氫溴酸檳榔堿色譜峰的理論塔板數(shù)為6625（以氫溴酸檳榔堿色譜峰計(jì)）。氫溴酸檳榔堿色譜峰可達(dá)基線分離，且與其相鄰的色譜峰的分離度大于1.5，符合要求。

3.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 分別精密吸取氫溴酸檳榔堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.2、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 置10 mL 量瓶中，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，按上述色譜條件測定，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，讀取峰面積。以檳榔堿進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（x），峰面積為縱坐標(biāo)（y），繪圖，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，在進(jìn)樣量為0.047 38～1.184 5 μg，檳榔堿呈良好的線性關(guān)系（回歸方程為y＝3 424.352x－2.591 8，r＝1.000 0）。

3.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取小兒化積顆粒，制備供試品溶液和氫溴酸檳榔堿對(duì)照品溶液分別于室溫放置0、2、4、8、12、24 h 后分別進(jìn)樣，測定，記錄氫溴酸檳榔堿色譜峰面積，結(jié)果表明，供試品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定，峰面積RSD 為0.47%；對(duì)照品溶液在室溫放置24 h 內(nèi)穩(wěn)定，峰面積RSD 為0.35%，穩(wěn)定性良好。

3.2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取小兒化積顆粒約5 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，制備6 份，測定，記錄氫溴酸檳榔堿色譜峰面積，計(jì)算小兒化積顆粒中氫溴酸檳榔堿的含量，結(jié)果表明，檳榔堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)平均值為0.115 8 mg/g，RSD 為0.56%，重復(fù)性良好。

3.2.6 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取小兒化積顆粒9 份，每份約2.5 g，精密稱定，平行9 份，分別置于9 個(gè)錐形瓶中，各取3 份，分別精密加入氫溴酸檳榔堿對(duì)照品儲(chǔ)備液0.6、1.2、1.8 mL，加入乙醚50 mL，分別再加碳酸鹽緩沖液3mL，制備9 份供試品溶液，進(jìn)樣，測定，計(jì)算回收率。結(jié)果表明，平均回收率為103.35%，RSD 為3.76%，符合要求。

3.2.7 耐用性實(shí)驗(yàn) 液相色譜的變動(dòng)因素有體積流量、波長、酸度、流動(dòng)相比例、柱溫、色譜柱。取供試品溶液，結(jié)果表明，液相色譜條件如體積流量、波長、酸度、流動(dòng)相比例、柱溫有所變動(dòng)均對(duì)測定結(jié)果無明顯影響；色譜柱品牌改變對(duì)測定結(jié)果無明顯影響，同品牌不同批號(hào)的色譜柱無影響。

3.2.8 3 批中試樣品的含量測定 取3 批小兒化積顆粒中試樣品，按供試品溶液制備方法制備得供試品溶液，測定，結(jié)果表明，3 批小兒化積顆粒中試樣品中檳榔堿質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.11、0.10、0.11 mg/g。由此可知不同批次的小兒化積顆粒中檳榔堿含量穩(wěn)定，為臨床使用提供了可靠的保障。

3.3 有機(jī)酸的含量測定

3.3.1 繪制滴定曲線 取小兒化積顆粒，研細(xì)，取約2 g，精密稱定，精密加水50 mL，搖勻，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，取出，稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，照電位滴定法，用0.05mol/L 氫氧化鈉滴定液進(jìn)行滴定。記錄消耗氫氧化鈉滴定液的體積及相應(yīng)的pH值，以消耗氫氧化鈉滴定液體積為x，以pH 值為y，在Originlab originPro 軟件中作圖，繪制?pH/?V-V的滴定曲線，對(duì)曲線上的任一點(diǎn)計(jì)算其一階導(dǎo)數(shù)值，一階導(dǎo)數(shù)最大值對(duì)應(yīng)的pH 值為突躍點(diǎn)，即滴定終點(diǎn)。據(jù)此確定滴定終點(diǎn)的pH 值為8.7。

3.3.2 專屬性實(shí)驗(yàn) 按小兒化積顆粒處方制法，制得空白輔料顆粒，按供試品的制備方法制備，即得陰性供試品溶液。照電位滴定法，用0.05 mol/L 氫氧化鈉滴定液電位滴定至pH 8.7，即得。每毫升氫氧化鈉滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于3.202 mg 的枸櫞酸。結(jié)果表明，滴定中陰性供試品溶液消耗的氫氧化鈉滴定液的體積極微，因此，陰性供試品溶液無干擾。

3.3.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取小兒化積顆粒12 g，精密加水300 mL，制備供試品溶液，于室溫放置0、2、4、8、12 h 后分別滴定，相似度計(jì)算結(jié)果顯示，0～12 h測得的色譜圖與0 h 色譜圖相似度分別為1.000、0.996、1.000、1.000，結(jié)果表明，峰面積RSD 為0.18%，供試品溶液在室溫放置12 h 內(nèi)穩(wěn)定。

3.3.4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取小兒化積顆粒約2 g，精密稱定，按供試品溶液制備方法制備，制備6 份，依法滴定，各成分峰面積RSD 為0.28%；用相似度評(píng)價(jià)軟件計(jì)算，各色譜圖與其所得共有模式的相似度分別為1.000，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.5 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取小兒化積顆粒6 份，每份約1.0 g，精密稱定，分別置于6 個(gè)錐形瓶中，分別精密加入1.120 4 mg/mL 枸櫞酸對(duì)照品儲(chǔ)備溶液6 mL，再精密加水50 mL，搖勻，密塞，稱定質(zhì)量，超聲30 min，取出，稱定質(zhì)量，用水補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 mL，照電位滴定法，用0.05 mol/L 氫氧化鈉滴定液電位滴定至pH 8.7，即得。每毫升氫氧化鈉滴定液（0.05 mol/L）相當(dāng)于3.202 mg 的枸櫞酸，結(jié)果表明，平均回收率為97.37%，RSD 為0.91%，符合要求。

3.3.6 3 批中試樣品的含量測定 取3 批中試樣品，按供試品溶液制備方法制備供試品溶液，依法測定，結(jié)果表明，3 批小兒化積顆粒中試樣品中有機(jī)酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.24、7.1、7.23 mg/g。結(jié)果表明，不同批次小兒化積顆粒中有機(jī)酸含量穩(wěn)定，為臨床上的使用提供了有效保障。

4 討論

積滯是一類以食欲較差甚至不思飲食、脘腹部脹滿疼痛、大便酸臭稀溏或秘結(jié)、噯氣酸腐或嘔吐為主要特征的脾胃系疾病，中醫(yī)治療以消食化積、理氣行滯為基本原則[1]。中醫(yī)認(rèn)為積滯的病機(jī)為乳食停而不化，積而不消，氣滯不行。積滯若遷延不愈易發(fā)展為“疳證”，二者有接續(xù)關(guān)系，故有時(shí)合稱疳積。本病相當(dāng)于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中的功能性消化不良。其中3～8 歲兒童高發(fā)，未得到及時(shí)診治會(huì)影響患兒的體格與智力發(fā)育[2]。因此對(duì)小兒積滯的治療研究有很大的意義。

胃腸的推進(jìn)作用和胃液的分泌情況可以判斷藥物的消食化積能力，其中胃液中所含的胃酸、胃蛋白酶是參與消化的主要成分，對(duì)營養(yǎng)物質(zhì)起到初步消化作用，并為后來的吸收創(chuàng)造了條件[9]；本研究通過幼齡小鼠和大鼠的胃排空實(shí)驗(yàn)、胃腸推進(jìn)實(shí)驗(yàn)和胃液分泌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了化積組方的消食化積能力，其中化積片與小兒化積顆粒均有較好的胃腸推進(jìn)、胃排空以及胃液分泌作用，并且相同劑量的化積片和小兒化積顆粒作用一致。結(jié)果表明了化積組方良好的消食化積療效。

山楂中的有機(jī)酸類成分可以通過促進(jìn)消化酶分泌增強(qiáng)小鼠的胃腸運(yùn)動(dòng)，并可拮抗阿托品引起的腸平滑肌松弛，有機(jī)酸具有抗炎癥反應(yīng)，抗氧化、抑制血小板聚集的藥理作用[10]，對(duì)心血管疾病的防治具有重要的臨床應(yīng)用價(jià)值。有機(jī)酸是山楂健胃消食、改善血液循環(huán)、降低高血壓和改善高脂血癥的關(guān)鍵生物活性成分之一[11]。由于山楂中的強(qiáng)極性有機(jī)酸類（如枸櫞酸、蘋果酸）等在常規(guī)C18反相色譜柱分離較困難，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[12]，本研究采用電位滴定法對(duì)小兒化積顆粒中的有機(jī)酸含量進(jìn)行測定。但是有機(jī)酸存在于多種藥材中，專屬性差。

研究表明，檳榔堿可以顯著增加胃底、胃體對(duì)食物的推動(dòng)力，并能加強(qiáng)胃竇部碾磨食糜的能力，促進(jìn)胃各部位動(dòng)力效應(yīng)協(xié)調(diào)，顯著提高胃動(dòng)力低下大鼠的胃排空率和小腸推進(jìn)率。檳榔堿為檳榔藥材的藥效成分，并且也是毒性成分，選擇檳榔堿作為小兒化積顆粒質(zhì)量控制指標(biāo)成分，既可以對(duì)小兒化積顆粒進(jìn)行質(zhì)量控制，也可以對(duì)其毒性成分進(jìn)行限定，保證其毒性成分在安全限定范圍內(nèi)，提高了其安全性和有效性。因此，小兒化積顆粒在對(duì)有機(jī)酸進(jìn)行質(zhì)量控制的基礎(chǔ)上增加了藥效成分檳榔堿的測定，建立了檳榔堿含量的方法，并進(jìn)行方法學(xué)研究，包括供試品溶液的制備方法考察、系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)、線性關(guān)系考察、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率實(shí)驗(yàn)等，結(jié)果均符合規(guī)定。該方法具有分離效果好、靈敏、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，可以用于小兒化積顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的定量控制，以保證小兒化積顆粒質(zhì)量均一性及療效的穩(wěn)定性。

本研究通過幼齡小鼠和大鼠的胃排空、腸運(yùn)動(dòng)、胃液分泌以及胃蛋白酶活性實(shí)驗(yàn)，證明小兒化積顆粒對(duì)幼齡小鼠以及大鼠具有消食化積的功效，與劑量呈正相關(guān)，對(duì)于小兒積滯的治療具有重大意義；并且對(duì)其中的藥效成分進(jìn)行質(zhì)量控制研究，不同批次間的有效成分含量穩(wěn)定，為小兒化積顆粒的質(zhì)量控制研究奠定基礎(chǔ)和臨床應(yīng)用提供安全有效的保障。然而，現(xiàn)有文獻(xiàn)多集中于臨床應(yīng)用及聯(lián)合用藥的報(bào)道，缺乏對(duì)于具體藥效機(jī)制的研究。因此，在后續(xù)研究中，應(yīng)借助分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)等現(xiàn)代研究手段，闡明小兒化積顆粒調(diào)節(jié)胃腸功能的作用機(jī)制，從而更好地服務(wù)于臨床。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突