基于細(xì)胞響應(yīng)譜的注射用雙黃連（凍干）質(zhì)量評(píng)控研究

馬麗娜，顧媛媛，何 婷，毛柳英，郭媛媛，趙 薇，曹俊嶺，鄢 丹，肖小河

1. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院 藥學(xué)部，北京 100078

2. 北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門(mén)醫(yī)院，北京 100700

3. 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 100050

4. 中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院 第五醫(yī)學(xué)中心 肝病醫(yī)學(xué)部研究所，北京 100039

注射用雙黃連（凍干）是由金銀花、連翹、黃芩提取物制成的一種中藥注射劑，為中藥抗菌抗病毒的著名方劑[1]，臨床廣泛用于治療急性呼吸道感染，因其使用方便、療效確切，被國(guó)家中醫(yī)藥管理局指定為全國(guó)中醫(yī)治療急診的首批15 種必備藥物之一。然而，近年來(lái)隨著其在臨床的廣泛使用，有關(guān)其不良反應(yīng)報(bào)道日漸增多[2-8]，引起國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局廣泛重視，先后2 次因過(guò)敏性休克發(fā)布暫停銷(xiāo)售或使用的不良反應(yīng)通報(bào)[9]。雖然很多學(xué)者分別從注射劑致敏成分[10-14]、輔料[15-17]及過(guò)敏/類過(guò)敏現(xiàn)象機(jī)制[18-20]等不同角度對(duì)中藥注射劑臨床發(fā)生不良反應(yīng)的可能原因進(jìn)行了系統(tǒng)和深入的研究，但是依然無(wú)法避免臨床不良反應(yīng)的發(fā)生。

中藥注射劑臨床不良反應(yīng)[21-30]，主要表現(xiàn)為過(guò)敏，尤其是類過(guò)敏，首次用藥即可發(fā)生，即藥物可通過(guò)靜脈給藥直接作用于肥大細(xì)胞引發(fā)脫顆粒效應(yīng)，釋放出組胺、β-氨基己糖苷酶等大量過(guò)敏介質(zhì)，從而導(dǎo)致系列癥狀的產(chǎn)生，且具有明顯的劑量相關(guān)性。而中藥注射劑因給藥途徑特殊，無(wú)首過(guò)效應(yīng)，相對(duì)來(lái)說(shuō)其全息成分可能直接作用于免疫細(xì)胞，為通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，表征類過(guò)敏反應(yīng)提供了可能，且可關(guān)聯(lián)體內(nèi)外試驗(yàn)結(jié)果。生物評(píng)價(jià)作為一種直接關(guān)聯(lián)藥物活性的評(píng)價(jià)方法，已越來(lái)越受到人們的重視，尤其適合類似中藥復(fù)雜體系的質(zhì)量控制。細(xì)胞響應(yīng)譜法具有非侵入、無(wú)標(biāo)記、實(shí)時(shí)在線、靈敏專屬、定性定量、指紋特性等優(yōu)點(diǎn)，能夠讓細(xì)胞在接近生理或病理?xiàng)l件下以活體狀態(tài)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)特性監(jiān)測(cè)，通過(guò)該技術(shù)可完整地呈現(xiàn)藥物和細(xì)胞之間發(fā)生的系列生化反應(yīng)。

因此，本研究在深入分析引發(fā)中藥注射劑不良反應(yīng)現(xiàn)象及原因的基礎(chǔ)上，借鑒生物藥品的質(zhì)量評(píng)控模式，結(jié)合中藥注射劑不良反應(yīng)特點(diǎn)，引入可實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)的細(xì)胞響應(yīng)譜方法，通過(guò)相似度評(píng)價(jià)和聚類分析，考察不同批次產(chǎn)品間生物效應(yīng)的一致性和穩(wěn)定性，以補(bǔ)充常規(guī)制劑通則和化學(xué)指紋譜無(wú)法檢測(cè)到的變化信息，探索建立基于細(xì)胞響應(yīng)譜監(jiān)測(cè)的中藥注射劑質(zhì)量一致性預(yù)警方法，以減少中藥注射劑臨床不良反應(yīng)/事件發(fā)生。

1 材料

1.1 細(xì)胞

大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病RBL-2H3 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，采用15% DMEM 高糖培養(yǎng)液在37 ℃、5% CO2、飽和濕度環(huán)境培養(yǎng)。

1.2 樣品

正常雙黃連樣品（編號(hào)NS1～NS5）、過(guò)期雙黃連樣品（編號(hào)OD1～OD5）及臨床導(dǎo)致過(guò)不良反應(yīng)的雙黃連樣品（編號(hào)AR1～AR5）由哈藥集團(tuán)中藥二廠生產(chǎn)。其中過(guò)期樣品按照藥品說(shuō)明書(shū)有效期，過(guò)期時(shí)間分別為16、10、28、20、31 個(gè)月，不良反應(yīng)樣品為企業(yè)提供的臨床上曾發(fā)生發(fā)熱、皮疹等不良反應(yīng)的樣品。此外，為模擬雙黃連（凍干）樣品在運(yùn)輸儲(chǔ)藏過(guò)程中可能出現(xiàn)的情況，同時(shí)制備了雙黃連凍干粉特殊處理樣品。高溫加速變質(zhì)樣品（編號(hào)TS1～TS5）：60 ℃恒溫箱中放置10 d；光照加速變質(zhì)樣品（編號(hào)LS1～LS5）：光照強(qiáng)度（4500±500）Lx 的可調(diào)光源下持續(xù)照射10 d；開(kāi)放環(huán)境放置樣品（編號(hào)ES1～ES5）：開(kāi)瓶放置于室溫避光開(kāi)放環(huán)境10 d 制得（以上特殊處理所用樣品均為同一批次的正常樣品）。

1.3 試劑

DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)11995-065）、胎牛血清（批號(hào)10099-141）、青霉素-鏈霉素（批號(hào)15140-148）、0.25%胰酶（批號(hào)25200-072）購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；PBS 緩沖液（批號(hào)P1020-500）購(gòu)自北京Solarbio 科技有限公司；Compound 48/80（批號(hào)073M4050V）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司。

1.4 儀器

培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、凍存管、離心管、移液管（購(gòu)美國(guó)Corning 公司）；xCELLigence 實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳感系統(tǒng)（艾森生物有限公司）；TC-10 型自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；Synergy H1 型全功能酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Tek 公司）；HC-3018R 型高速冷凍離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；NAPCO 5410 型二氧化碳培養(yǎng)箱（法國(guó)JOUAN 公司）；SINCE 1889 型立式高壓滅菌鍋（重慶雅馬拓科技有限公司）；超凈工作臺(tái)（北京冠鵬凈化設(shè)備有限責(zé)任公司）；AB135-S 型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；0.22 μm 針頭式過(guò)濾器、Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore 公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 注射用雙黃連（凍干）樣品的細(xì)胞響應(yīng)譜方法建立

2.1.1 供試品溶液的制備 取注射用雙黃連（凍干）內(nèi)容物，混勻，精密稱取粉末適量，置棕色量瓶中，加生理鹽水制成30 mg/mL 的溶液，用0.22μm 微孔濾膜濾過(guò)即得。

2.1.2 細(xì)胞接種濃度和給藥時(shí)間的選擇 細(xì)胞接種濃度和給藥時(shí)間是影響體外細(xì)胞活性評(píng)價(jià)的重要因素。采用實(shí)時(shí)細(xì)胞電子傳感系統(tǒng)監(jiān)測(cè)不同濃度RBL-2H3 細(xì)胞生長(zhǎng)曲線（圖1-A）。結(jié)果顯示，當(dāng)接種濃度低于2.5×105個(gè)/孔時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)36 h 后才能進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，實(shí)驗(yàn)周期過(guò)長(zhǎng)；當(dāng)超過(guò)2.5×105個(gè)/孔時(shí)，細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)間過(guò)短，實(shí)驗(yàn)不易操作、重復(fù)性差、誤差較大。因此，選擇2.5×105個(gè)/孔作為RBL-2H3 細(xì)胞優(yōu)化接種濃度。

在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，一般選擇細(xì)胞敏感的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（cd 段）作為加藥時(shí)間點(diǎn)，如圖1-B 所示，ab 段為RBL-2H3 細(xì)胞快速貼壁產(chǎn)生的細(xì)胞指數(shù)（cell index，CI）響應(yīng)曲線；隨著溶液中細(xì)胞貼壁的完全，CI 值響應(yīng)曲線出現(xiàn)暫時(shí)的停滯（bc 段），這期間也是細(xì)胞調(diào)整自身生理活動(dòng)以適應(yīng)外界環(huán)境的過(guò)程，準(zhǔn)備進(jìn)入指數(shù)生長(zhǎng)期的前奏，經(jīng)過(guò)一段時(shí)間的潛伏期后，細(xì)胞進(jìn)入大量分裂的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（cd段），CI 值響應(yīng)呈線性增加趨勢(shì)；在細(xì)胞生長(zhǎng)的后期，培養(yǎng)液被消耗殆盡，細(xì)胞死亡，CI 值響應(yīng)下降，CI 曲線重新回到基線（de 段）。因此，本研究結(jié)合上述原則，將CI 值接近于1 時(shí)的合適時(shí)間確定為給藥時(shí)間，即細(xì)胞接種后24h作為合適的加藥時(shí)間點(diǎn)（圖1-B）。同時(shí)為減少實(shí)驗(yàn)誤差、分析數(shù)據(jù)方便，采用實(shí)時(shí)在線檢測(cè)儀進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時(shí)，將加藥時(shí)間點(diǎn)的CI 值歸一化為1。

2.1.3 注射用雙黃連凍干溶液的細(xì)胞響應(yīng)譜表征取適量注射用雙黃連（凍干）正常樣品，設(shè)置系列質(zhì)量濃度，檢測(cè)其對(duì)RBL-2H3 細(xì)胞作用，如圖2 所示，注射用雙黃連（凍干）正常樣品，在0.8～3.2 mg/mL 對(duì)RBL-2H3 細(xì)胞的作用呈明顯的時(shí)效關(guān)系，且0.8 mg/mL 藥效曲線變化穩(wěn)定，故后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選取0.8 mg/mL 作為注射用雙黃連（凍干）的給藥質(zhì)量濃度。

圖2 注射用雙黃連（凍干）作用于RBL-2H3 細(xì)胞的實(shí)時(shí)細(xì)胞響應(yīng)譜Fig. 2 Real-time cell response spectrum of RBL-2H3 cells treated with Shuanghuanglian Lyophilized Injection

2.1.4 特征參數(shù)提取 為評(píng)價(jià)所得實(shí)時(shí)細(xì)胞響應(yīng)譜中各曲線相似性，在課題組前期相關(guān)研究[31-33]基礎(chǔ)上，提取以下特征參數(shù)：

（1）脫附時(shí)間（ΔT）：即從加藥開(kāi)始到CI 值接近于0 的時(shí)間間隔[34]。

tde表示CI 值接近于0 的時(shí)間點(diǎn)，tadd表示給藥的時(shí)間點(diǎn)

（2）曲線下面積（AUC）[35]：加藥開(kāi)始至CI 值接近于0 的曲線下面積。

（3）抑制率：藥物作用于RBL-2H3 細(xì)胞12、24 h 后CI 值。根據(jù)公式（2）計(jì)算細(xì)胞抑制率（I12、I24）。

I為抑制率，CIB為相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)空白組的CI 值，CIi為相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)實(shí)驗(yàn)組的CI 值

（4）相似度：采用夾角余弦法計(jì)算不同批次藥物作用于RBL-2H3 細(xì)胞所得細(xì)胞實(shí)時(shí)響應(yīng)譜各曲線間相似度。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 精密度實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)同一通道連續(xù)進(jìn)樣5 次，記錄CI 曲線。結(jié)果ΔT和AUC 的RSD 均小于3%，各CI 響應(yīng)曲線相似度均大于0.90，說(shuō)明在本實(shí)驗(yàn)條件下xCELLigence 實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)精密度良好。

2.2.2 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取同一供試品溶液，采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)，分別于0、1、2、4、8 h 檢測(cè)其對(duì)RBL-2H3 細(xì)胞作用，記錄CI 響應(yīng)曲線，結(jié)果ΔT和AUC 的RSD 均小于3%，各CI 響應(yīng)曲線相似度均大于0.90，說(shuō)明供試品溶液在8 h 內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取同一批次樣品，平行制備供試品溶液6 份，采用實(shí)時(shí)細(xì)胞分析系統(tǒng)分別監(jiān)測(cè)6份樣品對(duì)RBL-2H3 細(xì)胞作用，記錄CI 曲線，結(jié)果ΔT和AUC 的RSD 均小于3%，各CI 響應(yīng)曲線相似度均大于0.90，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.3 不同注射用雙黃連（凍干）樣品細(xì)胞響應(yīng)譜分析

分別將5 批正常樣品（NS1～NS5），制成0.8 mg/mL 供試品溶液，按照“2.1.3”項(xiàng)下方法，建立正常樣品的細(xì)胞響應(yīng)譜，如圖3-A 所示。提取特征圖譜數(shù)據(jù)，使用平均數(shù)法擬合正常樣品的標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照細(xì)胞響應(yīng)譜（reference standard biological fingerprint，RSBF）。

圖3 基于RBL-2H3 細(xì)胞的注射用雙黃連（凍干）細(xì)胞響應(yīng)譜Fig. 3 Cell response spectrum of Shuanghuanglian Lyophilized Injection based on RBL-2H3 cells

同法制備注射用雙黃連（凍干）高溫加速變質(zhì)樣品（TS1～TS5）、光照加速變質(zhì)樣品（LS1～LS5）、開(kāi)放環(huán)境放置樣品（ES1～ES5）及過(guò)期和不良反應(yīng)樣品溶液，采用實(shí)時(shí)細(xì)胞監(jiān)測(cè)儀，建立特殊樣品細(xì)胞響應(yīng)譜，如圖3-B～F 所示。

2.4 注射用雙黃連（凍干）樣品細(xì)胞響應(yīng)譜結(jié)果分析

2.4.1 相似度分析 根據(jù)“2.1.4”項(xiàng)下方法提取相關(guān)參數(shù)：ΔT、AUC、I1、I2、相似度。進(jìn)行相似度分析，結(jié)果顯示，正常組樣品與標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞響應(yīng)譜相比具有較高的相似度，均大于0.98，而其他不合格樣品相似度均低于0.98（除過(guò)期組樣品OD2、OD3 和不良反應(yīng)組AR3、AR5 外），其中開(kāi)放環(huán)境放置組樣品（ES）和不良反應(yīng)組樣品（AR）相似度最低。因此以相似度大于0.98 為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)，采用細(xì)胞響應(yīng)譜方法在25 批樣品中共檢出不合格樣品21 批，檢出率為84%，說(shuō)明細(xì)胞響應(yīng)譜方法能夠有效區(qū)分正常組樣品和高溫、光照、暴露及多數(shù)過(guò)期和不良反應(yīng)注射用雙黃連（凍干）樣品。

2.4.2 聚類分析 以不同批次注射用雙黃連（凍干）樣品細(xì)胞特征圖譜各項(xiàng)參數(shù)為指標(biāo)，采用IBM SPSS Statistics 20.0 軟件，對(duì)注射用雙黃連（凍干）正常樣品與特殊樣品進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見(jiàn)圖4，正常組樣品、高溫樣品、光照樣品、過(guò)期樣品均能夠各自聚為一類，提示細(xì)胞特征譜所提取的參數(shù)不僅能將正常樣品和其他樣品區(qū)分開(kāi)，而且能夠?qū)⒏邷亟M、光照組、過(guò)期組樣品和其他組分別區(qū)分開(kāi)，但是不能將開(kāi)放環(huán)境組和不良反應(yīng)組分開(kāi)。

圖4 注射用雙黃連（凍干）樣品細(xì)胞響應(yīng)譜聚類分析圖Fig. 4 Cluster analysis of cell response spectrum of Shuanghuanglian Lyophilized Injection samples

2.4.3 主成分分析 在聚類分析的同時(shí)，采用SIMCA-P11.5 軟件對(duì)細(xì)胞響應(yīng)譜所提取參數(shù)進(jìn)行相關(guān)分析，得到樣品得分圖（圖5）。結(jié)果顯示，細(xì)胞響應(yīng)譜方法可有效區(qū)分注射用雙黃連（凍干）正常組與其他特殊樣品（光照、高溫、暴露、過(guò)期及不良反應(yīng)組樣品），但是亦不能有效區(qū)分開(kāi)放環(huán)境組和不良反應(yīng)組樣品。

表1 注射用雙黃連（凍干）樣品細(xì)胞特征圖譜參數(shù)提取Table 1 Parameters from cell characteristic curve spectra of Shuanghuanglian Lyophilized Injection samples

圖5 注射用雙黃連（凍干）樣品作用于RBL-2H3 細(xì)胞的特征譜主成分得分圖Fig. 5 Principal component score of characteristic spectrum of RBL-2H3 cells treated with Shuanghuanglian Lyophilized Injection samples

針對(duì)從細(xì)胞特征圖譜中所提取的各項(xiàng)參數(shù)，借助主成分分析方法進(jìn)一步挖掘其中蘊(yùn)藏的特征信息，尋找其代表性評(píng)價(jià)指標(biāo)。本研究對(duì)所提取的I1、I2、ΔT、AUC、相似度（分別以X1～X5代表，標(biāo)準(zhǔn)化值用Z1～Z5表示）進(jìn)行計(jì)算。由主成分分析的初始特征值和提取的載荷平方和可知，前2 個(gè)主成分的特征值均大于1，累積貢獻(xiàn)率超過(guò)85%。由成分負(fù)荷矩陣可知，提取了2 個(gè)主成分，用F表示，其表達(dá)式如下：

系數(shù)的絕對(duì)值越大，則說(shuō)明主成分與該參數(shù)的關(guān)系越密切。由上式可知，第1 主成分與I1、I2、ΔT、AUC 關(guān)系密切，第2 主成分與I2和相似度關(guān)系較為密切。

3 討論

本研究從注射劑質(zhì)量控制角度出發(fā)，以注射用雙黃連（凍干）為模式藥，以具有肥大細(xì)胞許多生物學(xué)特性的RBL-2H3 細(xì)胞為模式生物[36-37]，建立了基于細(xì)胞響應(yīng)譜的質(zhì)量均一性評(píng)價(jià)方法，可以辨識(shí)暴露、高溫、光照及部分過(guò)期和臨床發(fā)生不良反應(yīng)樣品產(chǎn)生的質(zhì)量差異，旨在模擬考察產(chǎn)品在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中受光照和高溫等因素影響導(dǎo)致的微小質(zhì)量變化，為早期預(yù)警藥源性不良反應(yīng)提供技術(shù)參考。

采用建立的細(xì)胞響應(yīng)譜方法，通過(guò)整體相似度分析發(fā)現(xiàn)，正常樣品間相似度較高，特殊處理樣品相似度普遍降低，提示該方法可將注射用雙黃連（凍干）正常樣品和特殊樣品有效區(qū)分。這可能是因?yàn)橐环矫孀⑸溆秒p黃連（凍干）制劑臨床不良反應(yīng)多為過(guò)敏或類過(guò)敏反應(yīng)[2-5]，且其所含成分對(duì)RBL-2H3細(xì)胞模型敏感[38-39]，即使細(xì)微的成分變化也可通過(guò)該方法有效表征，同時(shí)由于生物評(píng)價(jià)方法本身對(duì)生物信息變化敏感，這可能也是為何細(xì)胞響應(yīng)譜法比化學(xué)指紋譜法更靈敏、全面的原因所在。本分析方法之所以能夠有效區(qū)分不同樣品，很重要的一點(diǎn)是對(duì)特殊參數(shù)的選擇，本研究中選擇了ΔT、AUC、I1、I2和相似度，共5 個(gè)代表性參數(shù)，這5 個(gè)參數(shù)基本可全面細(xì)致地刻畫(huà)整個(gè)細(xì)胞響應(yīng)譜的變化。首先脫附時(shí)間主要是反映整個(gè)細(xì)胞的生存周期即生命的長(zhǎng)度，而曲線下面積是借鑒血藥濃度曲線下面積類似生命的厚度，12、24 h 2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的抑制率反映的是不同樣品關(guān)鍵點(diǎn)的變化趨勢(shì)，這2 個(gè)時(shí)間點(diǎn)的選擇可以根據(jù)實(shí)際情況進(jìn)行調(diào)整，最后相似度是對(duì)整體變化趨勢(shì)的一個(gè)量化表達(dá)，通過(guò)這5 個(gè)參數(shù)不僅可描繪出整個(gè)曲線的輪廓，同時(shí)又能夠捕捉關(guān)鍵變化點(diǎn)，在這一點(diǎn)上，希冀給同行學(xué)者啟示和參考。

此外，細(xì)胞響應(yīng)譜實(shí)驗(yàn)前，通過(guò)常規(guī)制劑通則和化學(xué)指紋譜的內(nèi)控檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高溫組和光照組樣品可引起化學(xué)成分變化，而這種變化在細(xì)胞響應(yīng)譜中也被充分體現(xiàn)并有效識(shí)別，這可能是由于雙黃連制劑中所含的綠原酸類成分和黃芩苷類成分對(duì)光和熱敏感。而臨床發(fā)生不良反應(yīng)的樣品通過(guò)內(nèi)檢均未發(fā)現(xiàn)明顯異常，但是通過(guò)細(xì)胞響應(yīng)譜方法卻可檢出5 批次中的3 批樣品波動(dòng)，提示細(xì)胞響應(yīng)譜法在直接關(guān)聯(lián)臨床有效性和安全性的檢測(cè)中靈敏性強(qiáng)于常規(guī)制劑通則和化學(xué)指紋譜法。還有2 批次不良反應(yīng)樣品未有效檢出，可能是由于患者本身特異質(zhì)或過(guò)敏體質(zhì)發(fā)生的不良反應(yīng)，而這種情況通過(guò)簡(jiǎn)單的體外檢測(cè)可能依然無(wú)法有效檢出，這也是本方法的局限性所在。還有2 批過(guò)期樣品未被檢出，經(jīng)追溯發(fā)現(xiàn)這2 批樣品過(guò)期時(shí)間相對(duì)較短，其中OD2 為5 批樣品中過(guò)期時(shí)間最短的10 個(gè)月，提示可能過(guò)期時(shí)間越長(zhǎng)樣品變化越大越易被檢出。OD3（過(guò)期28個(gè)月）雖然過(guò)期時(shí)間較OD1（過(guò)期16 個(gè)月）和OD4（過(guò)期20 個(gè)月）長(zhǎng)，但是在對(duì)樣品進(jìn)行前處理時(shí)，發(fā)現(xiàn)OD3 樣品的疏松度明顯大于后2 批樣品，提示不同批次樣品可能由于儲(chǔ)存、運(yùn)輸環(huán)境差異造成的異常變化。另聚類分析發(fā)現(xiàn)該方法不能有效區(qū)分開(kāi)放環(huán)境樣品和不良反應(yīng)組樣品。可能是因?yàn)殚_(kāi)放環(huán)境組樣品在放置過(guò)程中受空氣中氧氣、水分、微生物污染等因素影響，其生物活性發(fā)生了較大變化，而這種變化可能與不良反應(yīng)樣品所誘導(dǎo)的細(xì)胞響應(yīng)譜表現(xiàn)類似，即都跟生物敏感性相關(guān)，所以通過(guò)生物評(píng)價(jià)方法無(wú)法有效區(qū)分。

綜上，注射用雙黃連制劑對(duì)溫濕度及光和熱相對(duì)敏感，在生產(chǎn)、儲(chǔ)存、運(yùn)輸過(guò)程中需特別注意，而細(xì)胞響應(yīng)譜法可快速、靈敏、高通量地表征這些因素的變化，且可實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)在線、量化、動(dòng)態(tài)、全面地反映注射劑質(zhì)控過(guò)程中的整體信息，有效彌補(bǔ)常規(guī)質(zhì)控方法信息單一或靈敏性差的不足。但是該方法也存在常規(guī)體外實(shí)驗(yàn)不能有效反映機(jī)體整體情況的普遍性問(wèn)題，但是該方法作為一種新的、直接關(guān)聯(lián)臨床不良反應(yīng)的方法，可作為當(dāng)前不良反應(yīng)事件頻發(fā)的中藥注射劑質(zhì)控方法的有效補(bǔ)充，有望與其他方法一起廣泛應(yīng)用于中藥注射劑的質(zhì)量控制與不良反應(yīng)預(yù)警。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突