葛根藥材HPLC 指紋圖譜與6 種成分含量測定研究

葉 彬，閆小巧#，雷 婷，蔡鑫坤，林敏生*

1. 廣州白云山中一藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510530

2. 廣州白云山奇星藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510530

葛根藥材為豆科植物野葛Puerarialobate(Willd.) Ohwi 的干燥根，習稱野葛，具有解肌退熱、透疹、生津止渴、升陽止瀉等功效[1]。主要化學成分為3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆素、大豆苷等異黃酮類化合物[2-3]。在臨床常用于治療表證發(fā)熱、麻疹不透、陰虛消渴、脾虛泄瀉等癥[4-5]。現(xiàn)代藥理藥效研究表明，葛根具有廣泛的藥理作用，如保肝、抗腫瘤、神經(jīng)保護、心臟保護、改善胰島素抵抗、抗炎、抗氧化等，在治療心腦血管疾病、治療糖尿病、抗腫瘤、預防骨質(zhì)疏松、發(fā)揮雌激素作用等方面發(fā)揮重要作用[6]。

葛根目前已被國家衛(wèi)生部批準列入“既是食品又是藥品”名錄，隨著藥食同源概念的普及與應用，葛根的市場開發(fā)潛力和使用需求量也日益增加。作為野生資源為主的中藥材，有效保證其資源品質(zhì)、控制其產(chǎn)品質(zhì)量是葛根藥材可持續(xù)利用的重要環(huán)節(jié)。因此亟需建立其質(zhì)量控制和質(zhì)量評價方法。據(jù)此，本研究建立葛根藥材的高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜方法，該方法同時適用于葛根中6 種主要異黃酮成分的含量測定，并對從各主產(chǎn)區(qū)收集的樣品進行了質(zhì)量研究。以6 種葛根異黃酮總含量平均值及RSD、浸出物含量及RSD、相似度為指標，對不同產(chǎn)地葛根進行了質(zhì)量比較研究，為制定優(yōu)質(zhì)葛根藥材質(zhì)量標準以及穩(wěn)定原料產(chǎn)地提供方法和依據(jù)。

1 儀器與材料

Aglient HP 1100 高效液相色譜儀聯(lián)用DAD 檢測器（美國安捷倫科技公司）。對照品葛根素（批號200912）、染料木素（批號201312）、染料木苷（批號201702）、芒柄花素（批號201504）、大豆苷（批號201603）、大豆苷元（批號200402）、鷹嘴豆芽素A（批號200501）均購自中國食品藥品檢定研究院，質(zhì)量分數(shù)均大于98%；對照品3′-羥基葛根素（批號CHB170224）、3′-甲氧基葛根素（批號CHB160902）、葛根素芹菜糖苷（批號CHB160421），質(zhì)量分數(shù)均大于98%，均購自成都克洛瑪生物科技有限公司。

從葛根主產(chǎn)區(qū)河南、陜西、四川、安徽等地收集樣品共32 批，經(jīng)鑒定符合《中國藥典》2020 年版標準，為豆科植物野葛P.lobate(Willd.) Ohwi 的干燥根。經(jīng)廣州白云山中一藥業(yè)有限公司陳自泓副主任中藥師鑒定。樣品信息見表1。

表1 32 批葛根藥材樣品信息Table 1 Sample information of 32 batches of Puerariae Lobatae Radix

2 方法與結果

2.1 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱為Hypersil BDS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水（A）-乙腈（B）；梯度洗脫（0～2 min，5% B；2～3 min，5%～9% B； 3～20 min，9% B；20～21 min，9%～12% B；21～35 min，12% B；35～36 min，12%～15% B；36～50 min，15%～20% B；50～60 min，20% B；60～72 min，20%～50% B；72～80 min，50% B）；體積流量為1.0 mL/min；檢測波長為250 nm；柱溫為25 ℃；進樣量為10.0 μL。

2.1.2 供試品溶液的制備 精密稱取葛根藥材粉末0.1 g，置錐形瓶中，精密加入30%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用30%乙醇補足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，用微孔濾膜（孔徑為0.45 μm）濾過，濾液作為供試品。

2.1.3 對照品儲備液的制備 分別精密稱取約3′-羥基葛根素5 mg、葛根素10 mg、3′-甲氧基葛根素5 mg、葛根素芹菜糖苷5 mg、大豆苷5 mg、大豆苷元5 mg、染料木素0.2 mg、染料木苷4 mg、芒柄花素0.2 mg 定容至10 mL 量瓶，鷹嘴豆芽素A 0.1 mg 定容至20 mL量瓶，用甲醇溶解，制得對照品儲備液。

2.1.4 對照品混合溶液的制備 精密吸取各對照品儲備液3′-羥基葛根素5 mL、葛根素12.5 mL、3′-甲氧基葛根素5 mL、葛根素芹菜糖苷4.3 mL、大豆苷4.3 mL、大豆苷元2.4 mL、染料木素1 mL、染料木苷1 mL、芒柄花素1 mL、鷹嘴豆芽素A 1 mL，至50 mL 量瓶中，用甲醇制成含3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元、染料木素、染料木苷、芒柄花素、鷹嘴豆芽素A 分別62.65、226.17、69.52、40.71、39.49、25.35、0.55、7.458、0.63、0.51 μg/mL 的混合對照品溶液。

2.1.5 精密度試驗 取同一批葛根樣品，按供試品溶液制備方法制備，取續(xù)濾液連續(xù)進樣6 次，圖譜導入相似度評價系統(tǒng)計算相似度，結果顯示各圖譜相似度均大于1，提示精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批葛根樣品，照供試品溶液制備方法制備6 份，分別進樣，記錄各自指紋圖譜色譜圖，圖譜導入相似度評價系統(tǒng)計算相似度，結果顯示各圖譜相似度均大于0.99。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取同一批葛根樣品，按供試品溶液制備方法制備，分別于0、3、6、9、12、24 h進樣測定，圖譜導入相似度評價系統(tǒng)計算相似度，結果顯示各圖譜相似度均大于0.99。

2.1.8 指紋圖譜的建立 取32 批葛根樣品，分別按照擬定供試品溶液制備方法制備，按擬定色譜條件進樣分析，將所得色譜圖導入相似度評價系統(tǒng)，以S1 為參照圖譜，對照圖譜生成方法為平均數(shù)，時間窗口1，經(jīng)2、3、7、9 號色譜峰多點校正，Mark 峰匹配后，生成對照圖譜（圖1、2），并計算相似度，標記共有峰10 個，32 批樣品與對照圖譜的相似度均大于0.94。

圖1 葛根樣品HPLC 指紋圖譜重疊圖Fig. 1 HPLC fingerprint overlay of Puerariae Lobatae Radix

圖2 葛根HPLC 對照指紋圖譜Fig. 2 HPLC control fingerprint of Puerariae Lobatae Radix

2.1.9 指紋圖譜共有峰的指認 通過對照品的保留時間，對葛根藥材的指紋圖譜共有峰進行指認（圖3），初步確認了其中6 種化學成分，分別為1 號峰3′-羥基葛根素、2 號峰葛根素、3 號峰3′-甲氧基葛根素、4 號峰葛根素芹菜糖苷、5 號峰大豆苷、6 號峰大豆苷元。

圖3 葛根HPLC 指紋圖譜色譜峰指認Fig. 3 HPLC fingerprint chromatographic peak identification of Puerariae Lobatae Radix

2.2 葛根HPLC 同時測定6 種異黃酮成分

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項方法。

2.2.2 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取約3′-羥基葛根素2.5 mg、葛根素12.5 mg、3′-甲氧基葛根素5 mg、葛根素芹菜糖苷2.5 mg、大豆苷2.5 mg、大豆苷元1.25 mg，加甲醇溶解并定容至50 mL量瓶，制得含3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元分別為55.02、254.72、101.74、53.76、53.02、27.48 μg/mL的混合對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備 同“2.1.2”項方法。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液各1、2、4、6、8、10 μL，按色譜條件注入液相色譜儀，以峰面積為縱坐標（Y），以進樣量為橫坐標（X），繪制標準曲線。結果見表2。

表2 對照品線性關系Table 2 Linear relation of reference substance

2.2.5 重復性考察 取樣品（S1），平行6 份，精密稱定，按上述方法平行制備成供試品溶液，分別進樣10 μL 進行測定。結果3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元質(zhì)量分數(shù)RSD 分別為0.14%、0.16%、0.18%、0.18%、0.41%、3.95%。

2.2.6 精密度考察 精密吸取葛根樣品（S1）的供試品溶液10 μL，連續(xù)進樣6 次，測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD 分別為0.10%、0.08%、0.17%、0.19%、0.41%、0.44%。

2.2.7 穩(wěn)定性考察 取樣品（S1）的供試品溶液，在室溫下放置，分別在0、3、6、9、12、24 h 進樣10 μL，測得3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元峰面積的RSD 分別為0.31%、0.22%、0.28%、0.17%、0.49%、1.98%。

2.2.8 加樣回收率考察 取已測定的樣品6 份（粉碎，過40 目篩），每份0.05 g，精密稱定，分別置錐形瓶中，精密加入3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元的對照品儲備液適量，按“2.1.2”項下方法制備供試液，進樣測定，計算得到上述6 個成分的平均加樣回收率分別為103.9%、104.7%、104.6%、96.8%、96.4%、96.4%；RSD 分別為0.94%、0.36%、0.80%、0.51%、1.44%、1.32%。

2.2.9 樣品測定 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，每批樣品平行制備2 份，按“2.2.1”項色譜條件進樣分析，并計算含量。結果見表3。

表3 32 批葛根多成分含量測定結果 (n＝2)Table 3 Results of multicomponent content determination in 32 batches of Puerariae Lobatae Radix (n＝2)

2.3 浸出物測定

按照《中國藥典》2020 年版葛根浸出物項下方法對樣品進行檢測，結果見表4。

表4 32 批葛根樣品浸出物測定結果Table 4 Determination of extracts from 32 batches of Puerariae Lobatae Radix samples

2.4 綜合評分

通過考察，建立葛根HPLC 同時測定6 種異黃酮成分的方法。將不同產(chǎn)地葛根質(zhì)量采用綜合評分法對葛根藥材質(zhì)量進行綜合評分（綜合評分＝黃酮總量×0.6＋浸出物×0.4），結果顯示（表5），河南產(chǎn)地的藥材評分最高，其次為陜西。

3 討論

3.1 供試品溶液的制備方法考察

本研究在初期考察了供試品溶液的制備方法，包括采用回流提取與超聲的提取方法考察，結果從主要峰的積分面積可知，回流提取的效率高于超聲提取，故選取回流作為提取方法。用不同體積分數(shù)（30%、50%、70%、100%）的乙醇作為提取溶劑，發(fā)現(xiàn)30%乙醇提取的成分色譜峰總積分面積最大，且30%乙醇提取的液相色譜圖中各峰峰數(shù)較多，各主要成分色譜峰清晰可見，峰位峰形好，分離度高，故選取30%乙醇作為提取溶媒。對提取溶劑用量（15、25、50、75 mL 30%乙醇）考察發(fā)現(xiàn)，隨著溶劑用量的增加，提取的樣品主要成分含量越多，到50 mL 達到峰值后，含量水平趨于平穩(wěn)，故選取50 mL 作為最佳溶劑用量。

3.2 色譜條件的比較與優(yōu)化

對供試品溶液進行200～400 nm 的波長掃描，發(fā)現(xiàn)在250 nm 處可將全譜物質(zhì)均檢測出，各色譜峰的豐度、數(shù)目和分離度較好。同時還考察了不同色譜柱（Hypersil BDS C18、Hypersil ODS2、Spherisorb C18、Aglient Eelipee XDB-C18），發(fā)現(xiàn)Hypersil BDS C18柱分離效果較好。此外還對流動相（0.1%甲酸-乙腈、0.1%磷酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、乙腈-水、甲醇-水）進行考察，結果發(fā)現(xiàn)采用0.1%甲酸水-乙腈流動相色譜峰分離效果好，峰數(shù)多、峰形好，且基線平穩(wěn)。

3.3 分析與總結

《中國藥典》2020 年版中對葛根水分、總灰分、醇浸出物測定作了規(guī)定，含量測定項下以葛根素的含量評價其質(zhì)量。有學者認為以單一成分葛根素評價葛根的質(zhì)量，存在一定的不科學性和不合理性[7]。中藥指紋圖譜可以較全面地反映中藥所含化學成分的種類與數(shù)量，進而反映中藥的質(zhì)量和中醫(yī)用藥所體現(xiàn)的整體療效[8]。目前已有研究關于采用HPLC 法建立的葛根藥材指紋圖譜研究，但所建立的指紋圖譜中的化學成分不明確或研究成分數(shù)量較少[9-10]。本研究經(jīng)色譜條件及方法學考察，通過測定32 批葛根藥材，建立葛根藥材的指紋圖譜，提取出10 個共有峰，利用對照品保留時間共指認了其中6 個峰，分別為3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元。相似度評價顯示不同產(chǎn)地藥材測定的指紋圖譜與對照圖譜相似度均大于0.94，所建立的指紋圖譜穩(wěn)定可靠，可用于葛根質(zhì)量的評價。

采用葛根HPLC 同時測定6 種異黃酮成分，并對不同產(chǎn)區(qū)收集的32 份葛根樣品進行質(zhì)量研究。以3′-羥基葛根素、葛根素、3′-甲氧基葛根素、葛根素芹菜糖苷、大豆苷、大豆苷元6 種異黃酮成分的總和計算總黃酮含量，結合浸出物測定結果，綜合評價不同產(chǎn)地的葛根藥材質(zhì)量。相比僅采用葛根素含量或少數(shù)成分含量作為不同產(chǎn)地葛根質(zhì)量的評價指標[11-12]，本研究針對葛根6 種異黃酮成分，并結合浸出物測定的綜合評價方式更加全面，為制定優(yōu)質(zhì)葛根藥材質(zhì)量標準以及穩(wěn)定原料產(chǎn)地提供參考。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突