紫杉醇還原敏感型聚合物膠束的制備及其逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥的研究

張夢(mèng)欣，于英杰，董 優(yōu)，宋 煜

福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122

目前，化療仍是臨床治療乳腺癌的主要方式之一[1-4]。臨床研究表明，多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）的存在是造成化療失敗和腫瘤復(fù)發(fā)的主要原因[5-10]。MDR[11]是指癌細(xì)胞因接觸一種化療藥物產(chǎn)生耐藥性的同時(shí)，對(duì)其他多種不同結(jié)構(gòu)、不同作用機(jī)制的化療藥物同樣存在耐藥性。研究表明，乳腺癌MDR 是多種細(xì)胞機(jī)制共同作用的結(jié)果，主要作用機(jī)制包括跨膜蛋白過度表達(dá)[12]、谷胱甘肽及其酶系統(tǒng)[13]、凋亡基因表達(dá)異常[14]、藥物作用靶點(diǎn)改變[15]等，致使癌細(xì)胞對(duì)化療藥攝取量減少、外排量增加以及增加了對(duì)化療藥凋亡作用的抗性等?；谌橄侔㎝DR 的病理特征，只考慮一種因素?zé)o法解決化療過程中出現(xiàn)的耐藥性問題，因此只有從多途徑、多因素、多靶點(diǎn)、多角度上進(jìn)行逆轉(zhuǎn)才可以更好地尋求合理的解決方案。

本研究所合成聚合物膠束載體還原敏感型透明質(zhì)酸-熊果酸聚合物（hyaluronic acid-cystamineursolic acid，HSU）中的熊果酸除自身具有明顯的抗腫瘤活性外，還具有多靶點(diǎn)逆轉(zhuǎn)MDR 的功能[16]；透明質(zhì)酸作為CD44 配體，可通過乳腺癌細(xì)胞表面過度表達(dá)CD44 受體進(jìn)而介導(dǎo)促進(jìn)藥物細(xì)胞內(nèi)吞[17]；與正常生理環(huán)境相比，腫瘤環(huán)境下的谷胱甘肽（glutathione，GSH）濃度高至100～1000 倍，而二硫鍵連接臂所構(gòu)建的還原敏感型膠束能夠在腫瘤微環(huán)境高還原響應(yīng)下快速釋放化療藥物進(jìn)而減少藥泵外排[18]。因此，本研究聯(lián)合以上3 種策略所構(gòu)建的還原敏感型載體用于遞送化療藥紫杉醇，考察PTXHSU 的體外釋放行為，并對(duì)該載藥膠束的細(xì)胞毒性、細(xì)胞攝取和胞內(nèi)GSH 進(jìn)行研究，以期實(shí)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)乳腺癌多藥耐藥性的目標(biāo)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

JY92-2D 型超聲波細(xì)胞破碎儀，寧波新芝生物科技公司；Alpha1-2 LD plus 型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ 公司；Nicolet iS5 型傅里葉變換紅外光譜儀，賽默飛世爾科技公司；NicompTM380ZLS 型激光粒徑測(cè)定儀（DLS），美國(guó)Santa Barbara 公司；Avance III 500 型核磁共振波譜儀，瑞士Bruker 公司；H7650型透射電子顯微鏡（TEM），日本日立公司；DKZ 型系列電熱恒溫振蕩水槽，上海一恒科技公司；Infinite M200 PRO 型酶標(biāo)儀，瑞士Tecan 公司；LC 2030 型高效液相色譜儀，島津公司；DMIi8-M 型倒置熒光顯微鏡，德國(guó)Christ 公司。

1.2 材料

熊果酸（批號(hào)F1928106，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、碳二亞胺鹽酸鹽（EDC，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、己二酸二酰肼（ADH，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%）、甲酰胺（分析純）、二甲基亞砜（DMSO，分析純）、二甲基甲酰胺（DMF，分析純），阿拉丁生化科技公司；紫杉醇，批號(hào)902-1812401，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，福建南方制藥股份有限公司；胱胺二鹽酸鹽（CYS），質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥97%，梯希愛化成工業(yè)發(fā)展公司；透明質(zhì)酸，相對(duì)分子質(zhì)量9850，江蘇海華生物科技有限公司；透析袋，截留相對(duì)分子質(zhì)量（MWCO）3500，上海源葉生物科技有限公司；RMPI 1640 基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清，Gibco公司；MTT、香豆素-6（coumarin-6，C6，質(zhì)量分?jǐn)?shù)98%），Sigma 公司。

1.3 細(xì)胞

人乳腺癌紫杉醇敏感細(xì)胞株MCF-7 細(xì)胞、人乳腺癌紫杉醇耐藥細(xì)胞株MCF-7/ADR 細(xì)胞，上海艾研生物科技有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 HSU 與HU 的合成

合成路徑如圖1 所示。本實(shí)驗(yàn)將熊果酸和透明質(zhì)酸中的-COOH 通過酰胺化反應(yīng)分別連接在CYS或ADH 兩端的-NH2上，得到具有還原敏感型的HSU 和非還原敏感型的HU。

圖1 HSU/HU 的合成路徑圖Fig. 1 Synthesis path diagram of HSU/HU

2.1.1 HSU 的合成 稱取透明質(zhì)酸（0.8 mmoL）置燒瓶中，甲酰胺溶解，加入EDC（1.6 mmoL）和NHS（1.6 mmoL），冰浴0.5 h，加入CYS（8 mmoL），攪拌反應(yīng)24 h 后，冰丙酮沉淀、抽濾，適量水復(fù)溶，0.8 μm 微孔濾膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HA-CYS 純品。

稱取熊果酸（0.1 mmoL），置燒瓶中，30 mL DMF-甲酰胺（1∶1）混合溶劑溶解，加入EDC（0.7 mmoL）和NHS（0.7 mmoL），冰浴4 h，加入HACYS（0.2 mmoL），室溫反應(yīng)24 h 后，冰丙酮沉淀，抽濾，適量水復(fù)溶后，離心，上清液0.8 μm 膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HSU 純品。

2.1.2 HU 的合成 稱取透明質(zhì)酸（0.8 mmoL）置燒瓶中，超純水溶解，加入EDC（1.6 mmoL）和ADH（7.5 mmoL），冰浴1 h，室溫下保持pH 4.75 反應(yīng)2 h，調(diào)節(jié)反應(yīng)溶液至pH 7.0，0.8 μm 微孔濾膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HA-ADH 純品。

稱取熊果酸（0.5 mmoL），置燒瓶中，40 mL DMF-甲酰胺混合溶劑溶解，加入EDC（4.6 mmoL）和NHS（4.6 mmoL），冰浴4 h，加入0.1 g HA-ADH，室溫反應(yīng)24 h 后，冰丙酮沉淀，抽濾，適量水復(fù)溶后，離心，上清液0.8 μm 膜濾過，超純水透析（MWCO3500）48 h 后，冷凍干燥，即得HU 純品。

2.2 結(jié)構(gòu)表征

2.2.1 FT-IR 分析 分別稱取透明質(zhì)酸、HA-CYS、HA-ADH、HU 和HSU 適量，KBr 壓片法，F(xiàn)T-IR 表征結(jié)構(gòu)。HSU、HU 及反應(yīng)原料的FT-IR 圖譜如圖2所示。1618 cm?1和1715 cm?1兩處吸收峰分別是透明質(zhì)酸和熊果酸結(jié)構(gòu)中-COOH 的對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（νC=O）；而在HSU 與HU 圖譜中，并未出現(xiàn)熊果酸的特征峰，推測(cè)其已被掩蓋，熊果酸經(jīng)反應(yīng)已生成新鍵；HA-CYS 圖譜中1653、1558 cm?1處吸收峰和HA-ADH 圖譜中1644、1559 cm?1處吸收峰分別對(duì)應(yīng)酰胺鍵對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰（νC=O，酰胺I 帶）和面內(nèi)彎曲振動(dòng)峰（βC=O，酰胺II 帶），證明HA-CYS 和HA-ADH 的成功合成；根據(jù)HSU 圖譜中1653 cm?1（νC=O，酰胺I 帶）、1558 cm?1（βC=O，酰胺II 帶）和HU 圖譜中1646 cm?1（νC=O，酰胺I 帶）、1541 cm?1（βC=O，酰胺II 帶）處出現(xiàn)酰胺鍵特征峰，推測(cè)HSU 圖譜和HU 圖譜中出現(xiàn)的酰胺鍵可能為熊果酸與2 中間體反應(yīng)生成的新酰胺鍵吸收峰，但與原來中間體酰胺鍵吸收峰重疊。為證實(shí)HSU 和HU合成成功，HSU 和HU 的結(jié)構(gòu)需要通過H1-NMR 進(jìn)一步表征。

圖2 合成原料及聚合物FT-IR 圖Fig. 2 FT-IR diagram of synthetic materials and polymers

2.2.2 H1-NMR 分別將適量透明質(zhì)酸、HA-CYS、HA-ADH、HSU 和HU 溶于D2O，熊果酸溶于DMSO-d6，H1-NMR 表征結(jié)構(gòu)，并計(jì)算CYS、ADH以及熊果酸的取代度（degree of substitution，DS，定義為每100 個(gè)透明質(zhì)酸單體上CYS 和ADH 的嫁接個(gè)數(shù)）。HSU（D2O）、HU（D2O）及反應(yīng)原料透明質(zhì)酸（D2O）、HA-CYS（D2O）、HA-ADH（D2O）、熊果酸（DMSO-d6）的H1-NMR 圖如圖3 所示。透明質(zhì)酸特征峰出現(xiàn)在δ2.03（3H，-NH-CO-CH3）處和δ3.25～4.78（2H-CH2-、H、-OH）；與透明質(zhì)酸相比，合成中間體HA-CYS 和HA-ADH 分別在δ2.84（2H，-CH2CH2NH2-，CYS 特征峰）和δ1.69（2H，-NHNHCOCH2CH2-CH2-，ADH 特征峰）、δ2.18～2.33（2H，-NHNHCOCH2CH2-，ADH 特征峰）處出現(xiàn)的吸收峰，證明中間體合成成功，與FT-IR結(jié)果一致。按照透明質(zhì)酸（δ2.0）、CYS（δ2.9）和ADH（δ2.6）的特征峰面積，計(jì)算出中間體CYS 和ADH 的DS，分別為（31.13±1.13）%和（50.75±2.63）%；在此基礎(chǔ)上，HSU H1-NMR 圖在δ0.97～1.10、1.28～1.29 和HU H1-NMR 圖在δ1.28～1.29（HU H1-NMR 圖中δ0.97～1.10 處吸收峰由于磁各向異性的緣故，向低場(chǎng)移動(dòng)，被HA-ADH 中δ1.14覆蓋，因此消失）處出現(xiàn)的吸收峰歸屬于熊果酸角甲基的特征吸收峰，結(jié)合FT-IR 推測(cè)的結(jié)果，判斷熊果酸已成功接枝，HSU 和HU 合成成功。通過熊果酸角甲基氫（δ1.28）與透明質(zhì)酸中N-乙酰基中甲基氫（δ2.0）的吸收峰面積比值，計(jì)算出HSU 和HU 中熊果酸的取代度分別為（3.12±0.17）%和（3.33±0.47）%，除了中間化學(xué)連接臂結(jié)構(gòu)不同，二者取代度相差不大，因此，HU 可以做HSU 的對(duì)比參照。

圖3 合成原料及聚合物的H1-NMR 圖Fig. 3 H1-NMR diagram of synthetic materials and polymers

2.3 PTX-HSU 的制備

固定HSU 載體投料量為18 mg，紫杉醇與HSU質(zhì)量比為 1 ∶1.8，以粒徑、 多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）、包封率、載藥量為考察指標(biāo)。精密稱取HSU 載體18 mg，加水3 mL，室溫溶解30 min，逐滴滴加25 mg/mL 的紫杉醇乙醇溶液400 μL 于載體水溶液中，劇烈攪拌15 min，冰浴探頭超聲30 min，重蒸水透析過夜，0.8 μm 濾膜濾過，即得載藥膠束溶液。PTX-HU 同法可制得。

取500 μL 膠束溶液稀釋至5 mL，通過激光粒度測(cè)定儀分別測(cè)定PTX-HSU 及PTX-HU 的平均粒徑、PDI 和ζ 電位。結(jié)果見表1。PTX-HSU 和PTXHU 膠束ζ 電位穩(wěn)定在?18～?20 mV，這是因?yàn)橥该髻|(zhì)酸結(jié)構(gòu)中的-COOH 在水中解離為帶負(fù)電荷COO?，較大的ζ 電位表明粒子間存在較大的斥力，說明該膠束制劑物理穩(wěn)定性良好。

表1 粒徑及分布、ζ 電位 (±s, n = 3)Table 1 Particle size and distribution, ζ potential (±s, n = 3)

表1 粒徑及分布、ζ 電位 (±s, n = 3)Table 1 Particle size and distribution, ζ potential (±s, n = 3)

樣品 粒徑/nm PDI ζ 電位/mV 載藥量% 包封率%PTX-HSU 152.8±8.5 0.105±0.010 ?20.98±3.44 33.11±2.36 89.27±9.52 PTX-HU 183.4±3.7 0.176±0.009 ?18.69±2.79 30.40±1.90 85.00±10.10

2.4 載藥量與包封率的測(cè)定

精密量取100 μL PTX-HSU 和PTX-HU 膠束溶液，甲醇稀釋定容至10 mL，參照本研究前期所建立的方法學(xué)，采用HPLC 法進(jìn)行測(cè)定[19]。

紫杉醇含量測(cè)定色譜條件：色譜柱為Agilent 5 TC-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-水（75∶25）；體積流量為1 mL/min；進(jìn)樣量為20 μL；柱溫為30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。分別按照以下公式計(jì)算紫杉醇的載藥量和包封率。

所制備的PTX-HSU 和PTX-HU 均具有較高的紫杉醇包封率（表1），分別為（89.27±9.52）%和（85.00±10.10）%；同時(shí)具有良好的負(fù)載效果，其載藥量分別為（33.11±2.36）%和（30.40±1.90）%。

2.5 PTX-HSU 的物相鑒定

稱取紫杉醇、HSU、紫杉醇與HSU 的物理混合物（含量比與PTX-HSU 相同）及PTX-HSU 適量，分別進(jìn)行DSC 分析和XRD 測(cè)試。

2.5.1 DSC 紫杉醇、HSU、紫杉醇與HSU 物理混合物、PTX-HSU 凍干粉針的DSC 圖譜如圖4 所示。219.9 ℃（吸熱峰）和240.8 ℃（放熱峰）分別為紫杉醇的熔融峰和降解峰，說明紫杉醇是以結(jié)晶態(tài)存在；241.3 ℃放熱峰為HSU 中修飾的熊果酸降解峰；紫杉醇的2 個(gè)特征峰（222.75、242.5 ℃）出現(xiàn)在紫杉醇和HSU 的物理混合物中，而未在PTXHSU 載藥膠束圖譜中出現(xiàn)；PTX-HSU 載藥膠束圖譜中僅出現(xiàn)了HSU 中熊果酸的降解峰（241.4 ℃）；說明紫杉醇可能以分子狀態(tài)或無定形形式存在于HSU 膠束骨架中。

圖4 DSC 圖譜Fig. 4 DSC patterns

2.5.2 XRD 紫杉醇、HSU、紫杉醇與HSU 物理混合物、PTX-HSU 載藥膠束的XRD 圖譜如圖5 所示。XRD 圖譜中5°、9°和12°處3 個(gè)強(qiáng)吸收峰以及15°～30°若干弱雜峰為紫杉醇特征峰；HSU 的XRD圖譜在5°～30°無任何吸收峰；紫杉醇與HSU 物理混合物則在XRD 圖譜中出現(xiàn)了紫杉醇的特征峰，而PTX-HSU 載藥膠束圖譜與HSU 圖譜相似，在5°～30°無任何吸收峰。綜合以上圖譜數(shù)據(jù)，說明紫杉醇以分子狀態(tài)或無定形存在于納米膠束骨架中。

圖5 XRD 圖譜Fig. 5 XRD patterns

2.6 PTX-HSU 體外釋藥動(dòng)力學(xué)考察

配制紫杉醇質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的PTX-HSU和PTX-HU 溶液，分別取1 mL 置于透析袋（MWCO14 000）內(nèi)，放入50 mL 含有不同GSH 濃度（0、10 mmol/L）的水楊酸鈉（1 mol/L）的PBS（pH 7.4）緩沖液中，100 r/min 恒定振速和37 ℃溫度下，考察紫杉醇制劑的體外釋放特性。分別在0、1、3、6、8、10、12 h 用相同體積的新鮮釋放介質(zhì)更新釋放介質(zhì)，HPLC 測(cè)定釋放介質(zhì)中的紫杉醇質(zhì)量濃度，計(jì)算各取樣時(shí)間點(diǎn)紫杉醇的累積釋放量。

體外釋藥結(jié)果如圖6 所示。當(dāng)GSH 濃度為0 mmol/L 時(shí)，PTX-HSU 和PTX-HU 在12 h 時(shí)累積釋藥量分別為76.31%和67.24%，二者釋藥趨勢(shì)一致，均無快速釋藥的趨勢(shì)；而在GSH 濃度為10 mmol/L時(shí)，PTX-HU 累積釋放量?jī)H為61.17%，而PTX-HSU累積釋放量則已經(jīng)達(dá)到89.18%；PTX-HU 載藥膠束無論是0 μmol/L 或是10 mmol/L 的GSH 釋放介質(zhì)中，累積釋放量相差不大；相對(duì)來說，PTX-HSU 在0 μmol/L 的GSH 釋放介質(zhì)中的12 h 累積釋放量與PTX-HU 釋放趨勢(shì)一致，但是在10 mmol/L 的GSH釋放介質(zhì)中在3 h 內(nèi)釋放量急劇增加，呈現(xiàn)出快速釋放現(xiàn)象，推測(cè)原因可能是因?yàn)镠SU 分子結(jié)構(gòu)中的二硫鍵被釋放介質(zhì)中的GSH 切斷，促使處于PTXHSU 載藥膠束核心的紫杉醇快速釋放，證明HSU具有還原響應(yīng)快速釋藥的能力。

2.7 體外逆轉(zhuǎn)耐藥

MCF-7 和MCF-7/ADR 細(xì)胞分別以1×104個(gè)/孔接種于96 孔板，細(xì)胞貼壁24 h 后，棄去培養(yǎng)基，不同紫杉醇質(zhì)量濃度（0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg/mL）的不同組（對(duì)照、紫杉醇、PTX-HSU、PTXHU）含藥培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h 后，棄去含藥培養(yǎng)基，100 μL/孔加入MTT 溶液（1 mg/mL），37 ℃培養(yǎng)4 h 后，棄去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，570 nm 波長(zhǎng)測(cè)定吸光度。計(jì)算紫杉醇各制劑的半抑制濃度（50% inhibiting concentration，IC50），按照公式和分別計(jì)算耐藥倍數(shù)和逆轉(zhuǎn)倍數(shù)[20]。結(jié)果表明（表2），紫杉醇各制劑組對(duì)2 種乳腺癌細(xì)胞均呈現(xiàn)出濃度相關(guān)性的細(xì)胞毒性，且PTX-HSU 制劑組的IC50明顯低于PTX-HU 和紫杉醇組，說明HSU 膠束作為載體可增強(qiáng)紫杉醇對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用。

表2 體外逆轉(zhuǎn)MDR 細(xì)胞毒性結(jié)果 (±s, n = 3)Table 2 Results of in vitro reversal of MDR cytotoxicity (±s, n = 3)

表2 體外逆轉(zhuǎn)MDR 細(xì)胞毒性結(jié)果 (±s, n = 3)Table 2 Results of in vitro reversal of MDR cytotoxicity (±s, n = 3)

與紫杉醇組比較：*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001；與PTX-HU 組比較：#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001 vs paclitaxel group;#P＜0.05##P＜0.01###P＜0.001 vs PTX-HU group

質(zhì)量濃度/(μg?mL?1)MCF-7 細(xì)胞存活率/% MCF-7/ADR 細(xì)胞存活率/%紫杉醇 PTX-HU PTX-HSU 紫杉醇 PTX-HU PTX-HSU 0.001 85.59±1.46 80.34±1.36 76.34±0.63* 99.11±1.68 97.63±1.49 96.37±3.20 0.01 72.81±3.59 52.94±0.97* 41.11±1.20**# 98.16±1.22 97.55±3.64 94.62±1.11 0.1 30.20±1.90 25.46±0.29 24.23±1.04* 94.00±1.00 93.15±2.18 93.33±0.78 1 24.39±0.17 21.41±0.15* 20.62±0.96* 87.03±2.19 84.74±0.39 66.32±3.63**##10 19.72±0.14 13.48±0.41*** 11.93±0.07***# 72.93±3.01 70.97±1.09 41.88±4.50***##100 12.98±0.20 9.64±0.36* 9.30±0.18** 42.18±0.27 41.46±0.95 30.14±0.94***###

在MCF-7 的細(xì)胞毒性結(jié)果中，紫杉醇、PTXHU 以及PTX-HSU 組的IC50分別為0.028、0.013、0.006 μg/mL，其中PTX-HU 制劑組IC50是紫杉醇組的2.15 倍，推測(cè)這可能是MCF-7 細(xì)胞表面過度表達(dá)CD44 受體（透明質(zhì)酸靶向受體），MCF-7 細(xì)胞通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用增加對(duì)PTX-HU 的攝取，使得更多的紫杉醇進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)；而PTX-HSU 組IC50分別是PTX-HU 組和紫杉醇組的2.17 倍和4.67 倍，推測(cè)一方面可能是由于在受體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向攝取載藥膠束后腫瘤細(xì)胞內(nèi)強(qiáng)還原敏感環(huán)境切斷了HSU 膠束中還原感二硫鍵，使得PTX-HSU 中紫杉醇相對(duì)紫杉醇組更多進(jìn)入細(xì)胞的基礎(chǔ)上，快速?gòu)哪z束內(nèi)釋放出來，顯著提高了抗腫瘤活性；另一方面，熊果酸自身就具有殺傷腫瘤細(xì)胞的能力，可能是HSU 膠束斷裂后的疏水端熊果酸起到了殺傷MCF-7 細(xì)胞的作用。

在MCF-7/ADR 的細(xì)胞毒性結(jié)果中，紫杉醇、PTX-HU 以及PTX-HSU 組的IC50分別為15.01、13.09、1.39 μg/mL。為考察MCF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥強(qiáng)度以及是否可以作為體外逆轉(zhuǎn)MDR的細(xì)胞模型，通過計(jì)算得到MCF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)紫杉醇的耐藥倍數(shù)為533，表明此細(xì)胞對(duì)紫杉醇呈現(xiàn)出較強(qiáng)的耐藥性，可以作為逆轉(zhuǎn)MDR 的細(xì)胞模型。MTT 結(jié)果表明，紫杉醇各制劑組均顯示出濃度依賴性的細(xì)胞毒性，通過各組制劑的IC50值計(jì)算MDR逆轉(zhuǎn)倍數(shù)發(fā)現(xiàn)，PTX-HSU 組和PTX-HU 組相對(duì)紫杉醇組逆轉(zhuǎn)倍數(shù)分別為10.79 倍和1.15 倍，且PTXHSU 組是PTX-HU 組的9.41 倍，表明HSU 載藥系統(tǒng)在逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR 方面呈現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。原因推測(cè)一方面可能是由于HSU 通過透明質(zhì)酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞和連接臂CYS 還原敏感快速釋藥增效紫杉醇；另一方面可能與HSU 中疏水端熊果酸具有多靶點(diǎn)殺傷腫瘤耐藥細(xì)胞的活性有關(guān)。

2.8 體外逆轉(zhuǎn)耐藥的細(xì)胞機(jī)制研究

2.8.1 HSU/HU 對(duì)細(xì)胞定性攝取的影響 MCF-7/ADR 細(xì)胞以1×105個(gè)/孔接種于24 孔板，按照0.5 mL/孔接種于24 孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含有C6-HSU 和C6-HU（膠束質(zhì)量濃度為80 μg/mL）的培養(yǎng)基，37 ℃孵育0.5 h 后，棄去培養(yǎng)基，PBS 洗5 次，于倒置熒光顯微鏡下成像。結(jié)果如圖7 所示，在相同條件下，給以C6-HSU干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度顯著強(qiáng)于給以C6-HU 干預(yù)的細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，透明質(zhì)酸的結(jié)構(gòu)中羧基是透明質(zhì)酸靶向受體（CD44 受體）的識(shí)別位點(diǎn)，其羧基的修飾程度與其靶向性有關(guān)；因此，推測(cè)可能是由于HU 結(jié)構(gòu)中透明質(zhì)酸骨架上的羧基修飾程度大于HSU，影響了其靶向效率，導(dǎo)致用C6-HU 干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)綠色熒光強(qiáng)度較弱；進(jìn)一步推測(cè)，HSU 很可能可以通過增加乳腺癌耐藥細(xì)胞對(duì)其的攝取量，以增加進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)化療藥物的量，相對(duì)于單純的化療藥，在耐藥細(xì)胞同步外排的作用下，HSU 干預(yù)的細(xì)胞內(nèi)化療藥有望具有更多的有效積累藥量，來發(fā)揮部分逆轉(zhuǎn)MDR 的作用。

圖7 定性考察細(xì)胞對(duì)HSU 與HU 的攝取情況 (×400)Fig. 7 Qualitative examination of cellular uptake of HSU and HU (× 400)

2.8.2 HSU/HU 對(duì)細(xì)胞定量攝取的影響 細(xì)胞以5×105個(gè)/孔的細(xì)胞量接種于6 孔板中，按照2 mL/孔接種于6 孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，棄去培養(yǎng)基，分別加入含有C6-HSU 和C6-HU（膠束質(zhì)量濃度為100 μg/mL）的培養(yǎng)基，37 ℃孵化4 h 后，移去上層供試液，加入預(yù)冷PBS 洗3 遍終止攝取。往6 孔板中加入消化液，收集細(xì)胞，2000 r/min 離心3 min，棄去上清液，用預(yù)冷PBS 洗3 遍后加入0.7 mL PBS重懸，在流式細(xì)胞儀的FL2 通道（Ex488 nm）檢測(cè)C6 含量，分析結(jié)果。在競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)中，預(yù)先用質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的透明質(zhì)酸溶液孵育2 h，再重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)步驟。結(jié)果如表3 所示，在相同質(zhì)量濃度下，HSU-C6 和HU-C6 組的熒光強(qiáng)度均大于游離C6（P＜0.001），說明C6 探針經(jīng)膠束包載后，在透明質(zhì)酸的主動(dòng)靶向作用下促進(jìn)了細(xì)胞對(duì)C6 的攝取。HSU-C6 和HU-C6 相比，還原敏感型HSU 膠束組的熒光強(qiáng)度更強(qiáng)，推測(cè)是因?yàn)镠SU 含有二硫鍵，可以使C6 快速釋放從而促進(jìn)C6 在細(xì)胞內(nèi)的累積。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也表明，隨著膠束濃度的增加，熒光強(qiáng)度也隨之增加，說明細(xì)胞對(duì)膠束攝取呈現(xiàn)一定的質(zhì)量濃度相關(guān)性。

表3 定量考察細(xì)胞對(duì)HSU 與HU 的攝取情況 (±s, n = 3)Table 3 Quantitative examination of cellular uptake of HSU and HU (±s, n = 3)

表3 定量考察細(xì)胞對(duì)HSU 與HU 的攝取情況 (±s, n = 3)Table 3 Quantitative examination of cellular uptake of HSU and HU (±s, n = 3)

與C6 組比較：***P＜0.001；與HU-C6 組比較：###P＜0.001；與透明質(zhì)酸＋HSU-C6 組比較：ΔΔP＜0.01***P＜0.001 vs C6 group;###P＜0.001 vs HU-C6;ΔΔP＜0.01 vs HA +HSU-C6 group

組別 劑量/(μg?mL?1) 熒光強(qiáng)度C6 ? 265.06±6.54 HU-C6 80 677.61±30.84***透明質(zhì)酸＋HSU-C6 80 727.17±22.23***HSU-C6 80 824.15±13.24***###ΔΔ

為進(jìn)一步闡明膠束攝取機(jī)制，采用10 mg/mL 的透明質(zhì)酸溶液先與細(xì)胞孵育，再加入HSU 膠束孵育。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，HSU 膠束的攝取被顯著抑制，熒光強(qiáng)度均顯著低于不加透明質(zhì)酸孵育的HSU 組（P＜0.01），此結(jié)果表明HSU 膠束是通過透明質(zhì)酸受體介導(dǎo)的內(nèi)吞而被攝取的。

2.8.3 HSU 對(duì)胞內(nèi)GSH 濃度的影響 MCF-7/ADR細(xì)胞以1×106個(gè)/孔接種于6 孔板，37 ℃培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)基，用含有HA-CYS、HSU、HU 的培養(yǎng)基干預(yù)48 h 后，還原型谷胱甘肽測(cè)定試劑盒檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)GSH 水平。結(jié)果表明（表4），相對(duì)于對(duì)照組，HA-CYS 均可顯著（P＜0.05）降低細(xì)胞內(nèi)的GSH表達(dá)水平，推測(cè)可能是由于HA-CYS 中的二硫鍵與細(xì)胞內(nèi)GSH 相互作用，胞內(nèi)GSH 在此過程中得到消耗；HSU 在HA-CYS 的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步降低了細(xì)胞內(nèi)的GSH 表達(dá)水平（P＜0.001），也可能與HSU釋放的熊果酸有關(guān)，此結(jié)果與文獻(xiàn)中報(bào)道熊果酸可以在一定程度上抑制細(xì)胞內(nèi)GSH 表達(dá)結(jié)果一致[21]。

表4 胞內(nèi)GSH 的測(cè)定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 4 Determination results of intracellular GSH (±s,n = 3)

表4 胞內(nèi)GSH 的測(cè)定結(jié)果 (±s, n = 3)Table 4 Determination results of intracellular GSH (±s,n = 3)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05**P＜0.01***P＜0.001；與HA-CYS 組比較：###P＜0.001；與HU 組比較：ΔP＜0.05*P < 0.05**P < 0.01***P < 0.001 vs control group;###P < 0.001 vs HA-CYS group;ΔP < 0.05 vs HU group

組別 GSH/(mmol?L?1) 組別 GSH/(mmol?L?1)對(duì)照 43.3±4.7 HU 19.2±1.7**HA-CYS 30.0±8.2* HSU 7.5±0.7***###Δ

HU 干預(yù)細(xì)胞48 h 后，相對(duì)對(duì)照組也顯著性降低了細(xì)胞內(nèi)GSH 表達(dá)水平（P＜0.01），推測(cè)也可能是HU 釋放了熊果酸有關(guān)；但是經(jīng)HU 干預(yù)后的胞內(nèi)GSH 表達(dá)水平顯著性地高于HSU（P＜0.05），可能是由于HU 結(jié)構(gòu)中沒有二硫鍵，既不能像HACYS 一樣消耗細(xì)胞內(nèi)GSH，也不能像HSU 一樣快速釋放熊果酸所致；文獻(xiàn)報(bào)道[22]，與GSH 相關(guān)的耐藥機(jī)制主要包括：（1）GST-π 可以催化GSH 與化療藥物結(jié)合，使化療藥物易于從尿液中排出或代謝為無毒性的醇類物質(zhì)；（2）GSH 的結(jié)構(gòu)可以作為細(xì)胞外排MRP 泵的底物，GST-π 可以通過調(diào)節(jié)GSH 而控制MRP 的耐藥程度。以上機(jī)制均表明胞內(nèi)GSH濃度下降后均能減少化療藥外排。因此，推測(cè)HSU中的還原敏感二硫鍵與熊果酸共同作用，通過降低癌細(xì)胞內(nèi)GSH 的水平，進(jìn)一步降低了腫瘤細(xì)胞對(duì)紫杉醇的外排和代謝，來發(fā)揮逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR 的作用。

3 討論

本研究成功合成了還原敏感型和非還原敏感型透明質(zhì)酸-熊果酸聚合物HSU 和HU。其中熊果酸以藥載兩用的形式，成功改善了其腫瘤靶向特異性低、水溶性差的缺點(diǎn)，提高了其生物利用度和臨床應(yīng)用。以HSU/HU 為載體成功制備了可高效負(fù)載紫杉醇的載藥膠束PTX-HSU 和PTX-HU，在體外還原性環(huán)境中，PTX-HSU 制劑顯示出還原響應(yīng)快速釋放藥物的能力。PTX-HSU 和PTX-HU 均呈現(xiàn)出濃度依賴性的細(xì)胞毒性，其中HSU 不僅可以增強(qiáng)紫杉醇對(duì)MCF-7 細(xì)胞的抗腫瘤活性，而且可以增強(qiáng)紫杉醇對(duì)MCF-7/ADR 細(xì)胞的殺傷作用，在逆轉(zhuǎn)乳腺癌MDR 方面呈現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，實(shí)現(xiàn)了HSU 對(duì)乳腺癌MDR 的逆轉(zhuǎn)目標(biāo)。

通過對(duì)體外逆轉(zhuǎn)耐藥的細(xì)胞研究推測(cè)出，HSU是通過：（1）受體介導(dǎo)的胞吞作用進(jìn)入MCF-7/ADR細(xì)胞內(nèi)，增加MCF-7/ADR 細(xì)胞對(duì)HSU 的攝取量，以增加細(xì)胞內(nèi)藥物的有效積累來逆轉(zhuǎn)MDR；（2）顯著性地降低MCF-7/ADR 細(xì)胞中的GSH 表達(dá)水平，從而減少GSH 相關(guān)的藥物外排以逆轉(zhuǎn)MDR。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突