鹽炙小茴香醋酸乙酯部位化學(xué)成分及抗酪氨酸酶活性研究

董維茂，朱奎霖，楊 興，尹 蕊，鄧徐麗，陳章賢，張洪川，王一謀，何紅平，董發(fā)武

云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院 云南省南藥可持續(xù)利用研究重點實驗室，云南 昆明 650500

小茴香為傘形科植物茴香FoeniculumvulgareMill.的干燥成熟果實[1]，其原名蘹香。其藥用歷史悠久，始載于《唐本草》，有1 千多年藥用歷史[2]。除藥用外，小茴香還是常用的食品香料，故為藥食兩用之佳品。小茴香分布廣泛，主要分布于地中海地區(qū)[3]，我國主要分布于西北地區(qū)的山西、甘肅、內(nèi)蒙古，以及東北地區(qū)的遼寧等地區(qū)[4]，其資源豐富，以栽培為主，栽培面積廣泛，其中以山西產(chǎn)量最大、內(nèi)蒙古河套附近產(chǎn)品質(zhì)優(yōu)。

小茴香味辛、性溫，具有散寒止痛、理氣和胃之功效[5-6]。小茴香化學(xué)成分主要為苯丙素，以及糖苷、脂肪油、黃酮、酚酸等多種類型的化合物[7]以及部分含量較少的無機元素。現(xiàn)代研究表明，小茴香具有改善腸道微生物平衡、促進胃腸運動、抗菌、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎等的作用[8-15]。其中主要成分苯丙素類化合物還具有抑制酪氨酸酶活性的作用[16]。包括雀斑在內(nèi)的皮膚病都與黑色素的合成有關(guān)，其中酪氨酸酶作為黑色素形成的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)酶[17-20]。因此，從天然產(chǎn)物中尋找抑制酪氨酸酶活性的化合物成為該領(lǐng)域中研究的熱點。目前，對小茴香生品的研究主要注重于揮發(fā)油成分，然而關(guān)于小茴香鹽炙品化學(xué)成分及藥理活性研究報道不多，因此本實驗對小茴香鹽炙品進行成分分離純化，從其醋酸乙酯部位分離得到 20 個化合物，分別鑒定為bombasinol A（1）、齊墩果酸（oleanolic acid，2）、山柰素（kaempferide，3）、槲皮素（quercetin，4）、(1R,2R)-1-(4-methoxypheny)propane-1,2-diol（5）、(1S,2R)-1-(4-methoxyphenyl)propane-1,2-diol（6）、(3S,5R,6S,7E)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one（7）、齊墩果酮酸（oleanonic acid，8）、刺五加酮（acanthone，9）、phenylpropanoid（10）、(Z)-4-[30-(β-D-glucopyranosyloxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one （ 11 ）、 3-oxo-α-ionol-β-Dglucopyranoside（12）、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷 [(+)-pinoresinol-β-D-glucopyranoside，13]、trans-4-(1-propenyl)-phenol-β-D-glucopyranoside（14）、1-O-β-D-glucopyranosyl-4-allybenzene （ 15 ）、 3-hydroxyestragole β-D-glucopyranoside（16）、黃花夾竹桃黃酮（thevetiaflavone，17）、3,5-dihydroxyestragole 3-O-β-D-glucopyranoside（18）、水楊酸（salicylic acid，19）和benzyl β-D-glucopyranoside（20）。并對分離的單體成分進行了體外抗酪氨酸酶的活性研究。此外，通過分子對接推測其可能的相互作用機制。

1 材料與儀器

1.1 材料

酪氨酸酶（Sigma-Aldrich 公司）；L-酪氨酸（上海麥克林生化科技有限公司）、β-熊果苷（上海源葉生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)98%）；色譜硅膠（200～300、300～400 目，青島海洋化工廠）；GF254薄層色譜硅膠（青島海洋化工廠）；LH-20 羥丙基葡聚糖凝膠（Sephadex LH-20，美國Pharmacia 公司）；MCI 樹脂（日本三菱化學(xué)公司）；反相C18柱色譜材料（ODS，德國Merck 公司）；D101 大孔吸附樹脂（天津市大鈞科技有限公司）；薄層色譜顯色劑（10%硫酸乙醇溶液）；甲醇、乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸乙酯、二氯甲烷、石油醚等試劑為重蒸的工業(yè)或化學(xué)純?nèi)軇簧V乙腈（上海星可高純?nèi)軇┯邢薰荆?/p>

小茴香藥材于2022年9月購自新螺螄灣藥材市場，由云南中醫(yī)藥大學(xué)李宏哲副教授鑒定為傘形科植物茴香F.vulgareMill.的干燥成熟果實，標(biāo)本（D2022-001）保存于云南省高校民族藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點實驗室。

1.2 儀器

Synergy2 多功能酶標(biāo)儀（美國BIOTEK 公司）；Bruker Avance III 400 MHz 及Bruker DRX 500 MHz超導(dǎo)核磁共振儀，TMS 為內(nèi)標(biāo)（德國Bruker 公司）；Agilent 1200 型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；離子井飛行時間質(zhì)譜儀Esquire HCT 型（德國Bruker 公司）；萬分之一分析天平FA2004（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司）；循環(huán)水式多用真空泵SHB-Ⅲ（鞏義市予華儀器有限公司）；海道夫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀Hei-VAP Core HL/G（德國heidolph 公司）。

2 提取與分離

2.1 小茴香的鹽炙

取小茴香20 kg，加入2000 mL 配制好的0.2 g/mL 鹽水，密封，燜透30 min，而后置炒制容器內(nèi)，以文火加熱，不間斷翻炒，并炒至微黃且至規(guī)定程度時，取出，放涼備用。

2.2 提取

鹽炙小茴香樣品20 kg 粉碎過篩（10 目），在10 L 的75%乙醇中（10 L×2 h×5）回流提取。合并得提取液，通過減壓濃縮得到2.387 kg 粗提物，粗提物加水混懸并使用石油醚、醋酸乙酯、正丁醇依次分別萃取5 次，合并萃取液，減壓濃縮得到石油醚相（203.6 g）、醋酸乙酯相（73.9 g）、正丁醇相（316.7 g）和水相（759.3 g）。

2.3 分離及純化

醋酸乙酯部位經(jīng)正向硅膠色譜（200～300 目），以二氯甲烷-甲醇（100∶1～1∶1）梯度洗脫，得到7 個組分（Fr. 1～7）。Fr. 2（13.9 g）經(jīng)MCI 柱色譜以甲醇-水（30∶70～100∶0）梯度洗脫，得到6 個流分（Fr. 2.1～2.6），F(xiàn)r. 2.3 經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）進行分離，再通過二次凝膠得到Fr. 2-3-1-1，F(xiàn)r.2-3-1-1 經(jīng)半制備液相（乙腈-水24∶76；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物1（3.0 mg）。Fr. 2.4 經(jīng)反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（30∶70～100∶0）洗脫，經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）純化得化合物2（52.4 mg）。Fr. 2.5 經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離再經(jīng)半制備液相（乙腈-水20∶80；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物19（13.4 mg）。Fr.2.6 經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離純化得化合物3（2.4 mg）。Fr. 2.6.5 經(jīng)MCI 柱色譜以甲醇-水（30∶70～100∶0）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20色譜（甲醇）分離純化得化合物4（8.8 mg）。Fr.4（9.1 g）經(jīng)正向硅膠色譜（200～300 目），以石油醚-醋酸乙酯（6∶1～1∶1）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得化合物7（1.9 mg）和8（4.0 mg），再通過半制備液相（乙腈-水15∶85；體積流量3 mL/min；檢測波長：365 nm）純化得化合物5（17.6 mg）和6（12.9 mg）。Fr.5（8.2 g）經(jīng)正向硅膠色譜（200～300 目），以石油醚-醋酸乙酯（2∶1～1∶1）梯度洗脫，反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～100∶0）洗脫，再通過半制備液相（乙腈-水21∶79；體積流量3 mL/min；檢測波長254 nm）純化得化合物9（3.0 mg）。Fr. 26（11.0 g）經(jīng)正向硅膠色譜（100～200 目），以二氯甲烷-甲醇（50∶1-1∶1）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離半制備液相（乙腈-水26∶74；體積流量3 mL/min；檢測波長254 nm）純化得化合物10（3.0 mg）。Fr. 7（12.1 g）經(jīng)正向硅膠色譜（100-200目），以二氯甲烷-甲醇（50∶1～1∶1）梯度洗脫得到9 個流分（Fr. 7.1～7.9），F(xiàn)r. 7.5 以反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～100∶0）梯度洗脫得到6 個流分，F(xiàn)r. 7.5.3 以Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得到化合物13（5.0 mg），再以半制備液相色譜（乙腈-水33∶67；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物11（6.0 mg）和12（6.0 mg），F(xiàn)r.7.5.6 經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得再以半制備液相（乙腈-水 46∶54；體積流量 3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物20（18.8 mg），F(xiàn)r. 7.6 以反相ODS 柱色譜，以甲醇-水（20∶80～100∶0）梯度洗脫得到6 個流分，F(xiàn)r.7.6.4經(jīng)正向硅膠二氯甲烷-甲醇（50∶1）等度洗脫再以半制備液相（乙腈-水12∶88；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物16（17.0 mg），F(xiàn)r.7.6.2 經(jīng)Sephadex LH-20 色譜（甲醇）分離得再以半制備液相（乙腈-水15∶85；體積流量3 mL/min；檢測波長365 nm）純化得化合物14（9.9 mg）和15（24.3 mg），F(xiàn)r. 7.9 以正向硅膠色譜（100～200目），以二氯甲烷-甲醇（30∶1～1∶1）梯度洗脫得Fr. 7.9.2，F(xiàn)r. 7.9.2 經(jīng) MCI 柱色譜以甲醇-水（20∶80～100∶0）梯度洗脫，再經(jīng)Sephadex LH-20色譜（甲醇）分離最后以半制備液相（乙腈-水23∶77；體積流量3 mL/min；檢測波長254 nm）純化得化合物17（4.2 mg）和18（32.6 mg）。

3 酪氨酸酶抑制活性測試

3.1 溶液的配制

3.1.1 磷酸鹽緩沖液的配制 精密量取20 mL 10×PBS 緩沖液，用超純水稀釋至200 mL，最后使用0.2 mol/L 氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 6.5～7.5（規(guī)定范圍）即得PBS 緩沖液。

3.1.2 酪氨酸酶試液的配制 精密移取提前分裝好的1000 units/mL 的酪氨酸酶9 mL，加入PBS 緩沖液稀釋至30 mL 即得300 units/mL 的酪氨酸酶試液，將試液放入?20 ℃冰箱待用。

3.1.3L-酪氨酸溶液的配制 精密稱取5 mgL-酪氨酸粉末于100 mL EP 管中加入50 mL PBS 緩沖液，搖勻，即得0.1 mg/mLL-酪氨酸溶液，放置，待用。

3.1.4 樣品溶液的配制

（1）陽性藥溶液的配制：精密稱取β-熊果苷4 mg，加入30 μL DMSO 使其完全溶解，再使用移液槍精密加入970 μL PBS 即得4 mg/mL 陽性藥試液，再將陽性藥依次梯度稀釋濃度為2、1、0.5、0.25 mg/mL，待用。

（2）待測樣品溶液的配制：精密稱取樣品適量，加入30 μL DMSO 使其完全溶解，再精密加入PBS使其質(zhì)量濃度依次為1、0.5、0.25、0.125、0.062 5 mg/mL；其中化合物15 稀釋質(zhì)量濃度依次為0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625 mg/mL，待用。

3.2 酪氨酸酶活性抑制率的測定

用移液槍按表的體積向96 孔板依次加入PBS緩沖液、不同濃度梯度的化合物受試液、不同濃度梯度的熊果苷對照液和酪氨酸酶液，37 ℃下孵育10 min 后，加入L-酪氨酸試液，同等條件下孵育30 min，孵育完成后立即放入多功能酶標(biāo)儀在492 nm測定其吸光度（A），并記錄數(shù)據(jù)，每個濃度實驗做3 個平行組，使用3 組數(shù)據(jù)的平均值，按照公式計算測定化合物對酪氨酸酶的抑制率。

T 為加樣品且加酪氨酸的反應(yīng)液組別；B 為加樣品且未加酪氨酸的反應(yīng)液組別；C 為未加樣品且加酪氨酸的反應(yīng)液組別；N 為未加樣品且未加酪氨酸的反應(yīng)液組別；AT為T 組反應(yīng)液在492 nm 處測得的A值；AB為B 組反應(yīng)液在492 nm 處測得的A值；AC為C 組反應(yīng)液在492 nm 處測得的A值；AN為N 組反應(yīng)液在492 nm 處測得的A值

3.3 數(shù)據(jù)處理與分析

運用IBM SPSS Statistics 26 進行計算IC50，并采用GraphPad Prism 9 軟件進行做圖。

4 分子對接

4.1 化合物結(jié)構(gòu)的獲取與處理

在Chemdraw 2D 中畫出所需化合物的2D 平面結(jié)構(gòu)，再通過Chemdraw 3D 將其轉(zhuǎn)化為PDB 格式的3D 結(jié)構(gòu)文件。

4.2 靶蛋白的獲取與處理

從PDB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）獲得酪氨酸酶蛋白的PDB 格式的三維晶體結(jié)構(gòu)文件，運用OpenBabel 2.4.1、AutoDockTools 1.5.7 軟件進行前期處理，得到相對應(yīng)的PDB 文件，備用。

4.3 化合物與靶蛋白的對接

將上述處理好的化合物與靶蛋白文件導(dǎo)入Autodock vina，并通過Autodock vina 進行分子對接，最后將Autodock vina 對接并對對接結(jié)果打分，將得到的PDB 格式文件，使用PyMol 軟件對分子對接結(jié)果進行可視化。

5 結(jié)果與分析

5.1 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：黃色油狀物，分子式為C21H24O6，HR-ESI-MSm/z: 395.146 0 [M＋Na]+（計算值395.146 5）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 6.95(1H, d,J= 1.9 Hz, H-2′), 6.82 (1H, dd,J= 8.1, 1.9 Hz, H-6′), 6.77 (1H, d,J= 8.1 Hz, H-5′), 6.66 (2H, d,J= 1.5 Hz, H-2, 6), 4.72 (2H, d,J= 4.2 Hz, H-7, 7′),4.25 (2H, dd,J= 9.1, 6.7 Hz, H-9α, 9′α), 3.88 (3H, s,3′-OMe), 3.86 (6H, s, 3, 5-OMe), 3.85 (2H, dd,J=8.5, 3.5 Hz, H-9β, 9′β), 3.15 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 149.4 (C-3, 5), 149.2(C-3′), 147.4 (C-4′), 134.3 (C-1), 133.8 (C-1′), 120.1(C-6′), 116.1 (C-5′), 111.0 (C-2′), 106.2 (C-4), 104.5(C-2, 6), 87.7 (C-7), 87.5 (C-7′), 72.7 (C-9′), 72.6(C-9), 56.8 (3, 5-OMe), 56.4 (3′-OMe), 55.6 (C-8),55.3 (C-8′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[21]，故鑒定化合物1 為bombasinol A。

化合物2：白色固體，分子式為C30H48O3，HR-ESI-MSm/z: 479.348 8 [M＋Na]+（計算值479.349 6）。1H-NMR (400 MHz, Pyridine-d5)δ: 5.52(1H, s, H-12), 3.47 (1H, m, H-3α), 3.33 (1H, dd,J=14.1, 4.6 Hz, H-18), 1.31 (3H, s, H-27), 1.27 (3H, s,H-23), 1.05 (9H, s, H-24, 25, 30), 0.97 (3H, s, H-29),0.92 (3H, s, H-26)；13C-NMR (100 MHz, Pyridine-d5)δ: 180.7 (C-28), 145.3 (C-13), 123.0 (C-12), 78.6(C-3), 56.3 (C-5), 48.6 (C-4), 47.2 (C-9), 46.9 (C-17),42.7 (C-19), 42.5 (C-14), 40.2 (C-18), 39.9 (C-1), 39.4(C-8), 37.9 (C-10), 37.7 (C-2), 33.8 (C-21), 33.8(C-29), 33.7 (C-22), 31.4 (C-7), 29.3 (C-20), 28.8(C-15), 28.6 (C-23), 26.6 (C-27), 24.3 (C-30), 24.2(C-1), 24.2 (C-16), 19.3 (C-24), 17.9 (C-6), 17.0(C-26), 16.0 (C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[22]，故鑒定化合物2 為齊墩果酸。

化合物3：黃色粉末，分子式為C16H12O6，HR-ESI-MSm/z: 323.052 4 [M＋Na]+（計算值323.052 6）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ: 8.08(2H, d,J= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 6.90 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-3′, 5′), 3.34 (3H, s, 4′-OMe)；13C-NMR (150 MHz,CD3OD)δ: 177.4 (C-4), 165.6 (C-7), 162.5 (C-9),160.6 (C-4′), 158.3 (C-5), 148.1 (C-2), 137.2 (C-3),130.7 (C-2′, 6′), 123.8 (C-1′), 116.3 (C-3′, 5′), 104.5(C-10), 99.3 (C-6), 94.4 (C-8), 56.5 (4′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[23]，故鑒定化合物3 為山奈素。

化合物4：黃色粉末，分子式為C15H10O7，HRESI-MSm/z: 303.049 2 [M＋H]+（計算值303.049 9）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.75 (1H, d,J= 2.2 Hz, H-2′), 7.65 (1H, dd,J= 8.4, 2.2 Hz, H-6′), 6.90(1H, d,J= 8.4 Hz, H-5′), 6.40 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-8), 6.19 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-6)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 177.4 (C-4), 165.6 (C-7), 162.5(C-5), 158.2 (C-9), 148.8 (C-2), 148.0 (C-4′), 146.2(C-3′), 137.3 (C-3), 124.2 (C-1′), 121.7 (C-6′), 116.2(C-5′), 115.9 (C-2′), 104.5 (C-10), 99.2 (C-6), 94.4(C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[24]，故鑒定化合物4 為槲皮素。

化合物5：無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C10H14O3，HR-ESI-MSm/z: 205.082 6 [M＋Na]+（計算值205.083 5）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.26 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6), 6.86 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5), 5.08 (1H, d,J= 5.0 Hz, H-1′), 4.40 (1H,dq,J= 5.0, 6.0 Hz, H-2′), 3.75 (3H, s, 4-OMe), 1.09(1H, d,J= 6.0 Hz, H-3′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 160.5 (C-4), 135.4 (C-1), 129.2 (C-2, 6),114.4 (C-3, 5), 78.7 (C-1′), 72.4 (C-2′), 55.6 (4-OMe),18.4 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[25]，故鑒定化合物 5 為 (1R,2R)-1-(4-methoxyphenyl)propane-1,2-diol。

化合物6：無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C10H14O3，HR-ESI-MSm/z: 205.082 5 [M＋Na]+（計算值205.083 5）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.23 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-2, 6), 6.86 (2H, d,J= 8.7 Hz, H-3, 5), 4.26 (1H, d,J= 7.0 Hz, H-1′), 3.82 (1H,dq,J= 6.0, 7.0 Hz, H-2′), 3.75 (3H, s, 4-OMe), 0.91(1H, d,J= 6.0 Hz, H-3′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 160.7 (C-4), 135.3 (C-1), 129.3 (C-2, 6),114.6 (C-3, 5), 79.9 (C-1′), 72.9 (C-2′), 55.6 (4-OMe),19.2 (C-3′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[25]，故鑒定化合物6 為 (1S,2R)-1-(4-methoxyphenyl) propane-1,2-diol。

化合物7：白色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C13H22O4，HR-ESI-MSm/z: 265.142 5 [M＋Na]+（計算值265.141 0）。1H-NMR (600 MHz, CD3OD)δ:7.15 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-7), 6.16 (1H, d,J= 15.7 Hz, H-8), 3.74 (1H, m, H-3), 2.29 (1H, ddd,J= 14.3,5.0, 1.7 Hz, H-4a), 2.28 (3H, s, H-10), 1.64 (1H, dd,J= 14.3, 9.2 Hz, H-4b), 1.56 (1H, ddd,J= 12.9, 3.4,1.7 Hz, H-2a), 1.25 (1H, m, H-2b), 1.18 (3H, s, H-12),1.16 (3H, s, H-13), 0.94 (3H,s, H-11)；13C-NMR (150 MHz, CD3OD)δ: 200.3 (C-9), 145.4 (C-7), 133.8(C-8), 70.8 (C-6), 68.8 (C-5), 64.4 (C-3), 47.7 (C-2),41.3 (C-4), 36.1 (C-1), 29.8 (C-12), 27.4 (C-10), 25.1(C-11), 20.0 (C-13)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[26]，故鑒定化合物 7 為 (3S,5R,6S,7E)-3,5,6-trihydroxy-7-megastigmen-9-one。

化合物 8：白色無定形粉末，分子式為C30H46O3，HR-ESI-MSm/z: 455.351 4 [M＋H]+（計算值455.352 0）。1H-NMR (400 MHz, CDCl3)δ: 5.30(1H, s, H-12), 2.84 (1H, m, H-18), 2.54 (1H, m, H-2),2.36 (1H, m, H-2), 1.14 (3H, s, H-27), 1.08 (3H, s,H-23), 1.05 (3H, s, H-25), 1.03 (3H, s, H-24), 0.93(3H, s, H-30), 0.91 (3H, s, H-29), 0.81 (3H, s, H-26)；13C-NMR (100 MHz, CDCl3)δ: 217.9 (C-3), 183.7(C-28), 143.8 (C-13), 122.6 (C-12), 55.5 (C-5), 47.6(C-4), 47.0 (C-9), 46.7 (C-17), 45.9 (C-19), 41.9(C-14), 41.2 (C-18), 39.4 (C-1), 39.3 (C-8), 36.9(C-10), 34.3 (C-2), 33.9 (C-21), 33.2 (C-29), 32.6(C-22), 32.3 (C-7), 30.8 (C-20), 27.8 (C-15), 26.6(C-23), 25.9 (C-27), 23.7 (C-30), 23.6 (C-1), 23.1(C-16), 21.6 (C-24), 19.7 (C-6), 17.2 (C-26), 15.2(C-25)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[27]，故鑒定化合物8 為齊墩果酮酸。

化合物9：無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C22H26O9，HR- ESI-MSm/z: 435.165 3 [M＋H]+（計算值435.165 0）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.35 (2H, s, H-2, 6), 6.69 (2H, s, H-2′, 6′), 4.61 (1H, s,H-7′), 4.26 (1H, m, H-8), 4.19 (2H, m, H-9a, 9b), 3.88(6H, s, 3, 5-OMe), 3.82 (6H, s, 3′, 5′-OMe), 3.64 (2H,m, H-9′a, 9′b), 2.61 (1H, m, H-8′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 200.3 (C-7), 149.2 (C-3′, 5′), 148.1(C-3, 5), 136.2 (C-4), 132.9 (C-1′), 128.0 (C-1), 107.7(C-2, 6), 105.1 (C-2′, 6′), 85.4 (C-7′), 71.6 (C-9), 61.3(C-9′), 56.9 (3, 5-OMe), 56.8 (3′, 5′-OMe), 55.2(C-8′), 49.9 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[28]，故鑒定化合物9 為刺五加酮。

化合物10：無色油狀物，分子式為C10H14O4，HR-ESI-MSm/z: 221.077 5 [M＋Na]+（計算值221.078 4）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.30(2H, d,J= 8.6 Hz, H-2′, 6′), 6.89 (2H, d,J= 8.6 Hz,H-3′, 5′), 4.55 (1H, d,J= 6.2 Hz, H-1), 3.78 (3H, s,4′-OMe), 3.66 (1H, m, H-2), 3.47 (1H, m, H-3b), 3.34(1H, m, H-3a)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 160.7(C-4′), 135.3 (C-1′), 129.1 (C-2′, 6′), 114.6 (C-3′, 5′),77.6 (C-2), 75.2 (C-1), 64.2 (C-3), 55.7 (4′-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[29]，故鑒定化合物10 為phenylpropanoid。

化合物11：無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C19H30O7，HR-ESI-MSm/z: 393.188 0 [M＋Na]+（計算值393.188 4）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:5.97 (1H, t,J= 7.8 Hz, H-1′), 5.91 (1H, s, H-2), 4.43(1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′′), 4.04 (1H, m, H-3′), 2.62 (2H,m, H-2′), 2.37 (2H, d,J= 6.0 Hz, H-6), 2.30 (3H, s, H-9),1.34 (3H, d,J= 5.3 Hz, H-4′), 1.22 (6H, s, H-7, 8)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 202.1 (C-1), 159.1(C-3), 143.7 (C-4), 134.4 (C-1′), 125.6 (C-2), 103.9(C-1′′), 78.2 (C-3′′), 77.9 (C-3′), 77.2 (C-5′′), 75.3(C-2′′), 71.7 (C-4′′), 62.8(C-6′′), 54.7 (C-6), 39.3(C-5), 37.7 (C-2′), 29.3 (C-8), 29.2 (C-7), 22.7 (C-9),22.2 (C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[30]，故鑒定化合物 11 為 (Z)-4-[30-(β-D-glucopyranosyloxy)butylidene]-3,5,5-trimethyl-2-cyclohexen-l-one。

化合物12：無色固體，分子式為C19H30O7，HR-ESI-MSm/z: 393.188 2 [M＋Na]+（計算值393.188 4）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 5.88(1H, s, H-4), 5.74 (1H, dd,J= 15.4, 9.3 Hz, H-7), 5.58(1H, dd,J= 15.4, 7.8 Hz, H-8), 4.49 (1H, m, H-9),4.34 (1H, d,J= 7.8 Hz, H-1′), 3.87 (1H, dd,J= 11.9,2.1 Hz, H-6′a), 3.64 (1H, dd,J= 11.9, 5.9 Hz, H-6′b),3.23 (4H, m, H-2′), 2.71 (1H, d,J= 9.3 Hz, H-6), 2.44(1H, d,J= 16.7 Hz, H-2b), 2.07 (1H, d,J= 16.7 Hz,H-2a), 1.94 (3H, d,J= 1.4 Hz, H-13), 1.28 (3H, d,J=5.9 Hz, H-10), 1.05 (3H, s, H-11), 1.03 (3H, s, H-12)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 201.9 (C-3), 165.5(C-5), 137.1 (C-8), 131.4 (C-7), 126.2 (C-4), 101.0(C-1′), 78.3 (C-3′), 78.2 (C-5′), 75.0 (C-2′), 74.8 (C-9),71.8 (C-4′), 62.9 (C-6′), 56.9 (C-6), 48.4 (C-2), 37.1(C-1), 28.1 (C-12), 27.7 (C-11), 23.7 (C-13), 22.2(C-10)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[31]，故鑒定化合物12 為3-oxo-α-ionol-β-D-glucopyranoside。

化合物13：無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C26H32O11，HR-ESI-MSm/z: 519.187 3 [M-H]?（計算值519.187 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.86 (6H, m, H-2, 5, 6, 2′, 5′, 6′), 4.85 (1H, d,J= 7.0 Hz, H-1′′), 4.74 (1H, d,J= 4.0 Hz, H-7), 4.69 (1H, d,J= 4.0 Hz, H-7′), 4.22 (2H, m, H-9, 9′), 3.85 (6H, s, 3,3′-OMe), 3.11 (2H, m, H-8, 8′)；13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 150.9 (C-3′), 149.1 (C-3), 147.5 (C-4),147.3 (C-4′), 137.5 (C-1′), 133.7 (C-1), 120.1 (C-6),119.8 (C-6′), 117.9 (C-5), 116.1 (C-5′), 111.6 (C-2),110.9 (C-2′), 102.8 (C-1′′), 87.5 (C-7′), 87.1 (C-7),78.2 (C-5′′), 77.8 (C-3′′), 74.9 (C-2′′), 72.7 (C-9′), 72.7(C-9), 71.3 (C-4′′), 62.5 (C-6′′), 56.7 (3-OMe), 56.4(3′-OMe), 55.5 (C-8′), 55.4 (C-8)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[32]，故鑒定化合物13 為 (+)-pinoresinol-β-Dglucopyranoside。

化合物14：白色粉末狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C15H20O6，HR-ESI-MSm/z: 319.115 2 [M＋Na]+（計算值319.115 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.36 (1H, d,J= 15.8 Hz, H-7), 6.15 (1H, dq,J= 15.8,6.5 Hz, H-8), 3.80 (5H, m, H-2′～6′), 1.85 (3H, d,J=6.5 Hz, H-9)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 158.1(C-4), 133.8 (C-1), 131.6 (C-7), 127.8 (C-2, 6), 124.8(C-8), 117.8 (C-3, 5), 102.4 (C-1′), 78.1 (C-3′), 77.9(C-5′), 74.9 (C-2′), 71.4 (C-4′), 62.5 (C-6′), 18.5 (C-9)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[33]，故鑒定化合物14 為trans-4-(1-propenyl)-phenol-β-D-glucopyranoside。

化合物15：白色粉末狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C15H20O6，HR-ESI-MSm/z: 319.114 9 [M＋Na]+（計算值319.115 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.11 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-2, 6), 7.03 (2H, d,J= 8.6 Hz, H-3, 5), 5.95 (1H, m, H-8), 5.06 (1H, d,J= 15.4 Hz, H-9b), 5.02 (1H, d,J= 8.9 Hz, H-9a), 3.90 (1H,dd,J= 12.0, 1.9 Hz, H-6b), 3.71 (1H, dd,J= 12.0, 4.8 Hz, H-6a), 3.45 (4H, m, H-2′～5′), 3.33 (2H, d,J= 7.1 Hz, H-7)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 157.5(C-4), 139.2 (C-8), 135.2 (C-1), 130.5 (C-3, 5), 117.8(C-2, 6), 115.7 (C-9), 102.5 (C-1′), 78.0 (C-3′), 77.9(C-5′), 74.9 (C-2′), 71.4 (C-4′), 62.5 (C-6′), 40.3(C-7)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[34]，故鑒定化合物15 為1-O-β-D-glucopyranosyl-4-allybenzene。

化合物16：無定形粉末，分子式為C16H22O7，HR-ESI-MSm/z: 350.1292 [M ＋Na]+（計算值350.129 2）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.03(1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.93 (1H, d,J= 8.3 Hz, H-5),6.83 (1H, dd,J= 8.3, 2.0 Hz, H-6), 5.96 (1H, ddt,J=17.0, 10.0, 6.8 Hz, H-2′), 5.69 (1H, d,J= 7.0 Hz,H-1′′), 5.09 (1H, dd,J= 10.0, 2.0 Hz, H-3′), 5.02 (1H,dd,J= 17.0, 2.0 Hz, H-3′), 3.84 (3H, s, 4-OMe), 3.32(2H, d,J= 6.8 Hz, H-1′)。13C-NMR (100 MHz,CD3OD)δ: 149.1 (C-3), 147.9 (C-4), 139.0 (C-2′),134.6 (C-1), 123.8 (C-6), 118.5 (C-2), 115.8 (C-3′),113.8 (C-5), 102.9 (C-1′′), 78.2 (C-3′′), 77.8 (C-5′′),74.9 (C-2′′), 71.3 (C-4′′), 62.5 (C-6′′), 56.9 (4-OMe),40.5 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[35]，故鑒定化合物16 為3-hydroxyestragole β-D-glucopyranoside。

化合物17：淡黃色粉末，分子式為C16H12O5，HR-ESI-MSm/z: 307.057 0 [M＋Na]+（計算值307.057 7）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 7.45(2H, d,J= 8.5 Hz, H-2′, 6′), 7.02 (2H, d,J= 8.5 Hz,H-3′, 5′), 6.22 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-8), 6.19 (1H, d,J= 2.1 Hz, H-6), 3.78 (3H, s, 5-OMe)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 175.9 (C-4), 162.1 (C-7), 160.5(C-4′), 160.1 (C-2), 159.8 (C-5), 159.6 (C-9), 127.5(C-2′, 6′), 121.6 (C-1′), 115.9 (C-3′, 5′), 106.9 (C-3),106.7 (C-10), 96.7 (C-6), 96.0 (C-8), 57.6 (4-OMe)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[36]，故鑒定化合物17 為黃花夾竹桃黃酮。

化合物18：無色針狀結(jié)晶（甲醇），分子式為C16H22O8，HR-ESI-MSm/z: 365.120 6 [M＋Na]+（計算值365.120 7）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:6.55 (1H, d,J= 2.0 Hz, H-2), 6.41 (1H, d,J= 2.0 Hz,H-6), 5.93 (1H, ddt,J= 16.9, 10.0, 6.7 Hz, H-2′), 5.73(1H, d,J= 7.0 Hz, H-1′′), 5.07 (1H, dd,J= 16.9, 2.2 Hz, H-3′b), 5.02 (1H, dd,J= 2.2, 1.0 Hz, H-3′a), 3.83(3H, s, 4-OMe), 3.25 (2H, d,J= 6.7 Hz, H-1′)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 152.1 (C-5), 151.6(C-3), 138.7 (C-2′), 137.6 (C-4), 136.7 (C-1), 115.9(C-3′), 111.6 (C-6), 109.2 (C-2), 102.6 (C-1′′), 78.1(C-3′′), 78.0 (C-5′′), 74.9 (C-2′′), 71.3 (C-4′′), 62.5(C-6′′), 61.6 (4-OMe), 40.0 (C-1′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報 道 一 致[37]， 故 鑒 定 化 合 物 18 為 3,5-dihydroxyestragole 3-O-β-D-glucopyranoside。

化合物19：白色結(jié)晶性粉末，分子式為C7H6O3，HR-ESI-MSm/z: 139.038 2 [M ＋H]+（計算值139.039 0）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ: 8.02(1H, dd,J= 7.8, 1.8 Hz, H-6), 7.77 (1H, dd,J= 8.3,1.8 Hz, H-4), 7.34 (1H, t,J= 7.8 Hz, H-5), 6.81 (1H,d,J= 8.3 Hz, H-3)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ:174.3 (C=O), 163.1 (C-2), 136.1 (C-4), 131.6 (C-6),119.9 (C-5), 117.9 (C-3), 110.9 (C-1)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[38]，故鑒定化合物19 為水楊酸。

化合物 20：白色無定形粉末，分子式為C13H18O6，HR-ESI-MSm/z: 293.099 3 [M＋Na]+（計算值293.099 6）。1H-NMR (400 MHz, CD3OD)δ:7.31 (5H, m, H-2～6), 4.91 (1H, d,J= 11.8 Hz,H-7b), 4.63 (1H, d,J= 11.8 Hz, H-7a), 4.32 (1H, d,J= 7.7 Hz, H-1′α), 3.86 (1H, dd,J= 11.9, 2.1 Hz,H-6′b), 3.66 (1H, dd,J= 11.9, 5.7 Hz, H-6′a)；13C-NMR (100 MHz, CD3OD)δ: 139.0 (C-1), 129.3(C-3, 5), 129.2 (C-2, 6), 128.7 (C-4), 103.2 (C-1′),78.1 (C-3′), 78.0 (C-5′), 75.1 (C-2′), 71.7 (C-7), 71.7(C-4′), 62.8 (C-6′)。以上數(shù)據(jù)與文獻報道一致[39]，故鑒定化合物20 為benzyl β-D-glucopyranoside。

5.2 化合物對酪氨酸酶抑制活性的影響

采用酪氨酸酶催化L-酪氨酸的方法，對小茴香醋酸乙酯部位分離出的20 個化合物進行體外酪氨酸酶抑制活性篩選，共篩選出5 個活性較好的具有酪氨酸酶抑制作用的化合物（4、13～15、17），其中以化合物15 和17 對酪氨酸酶的抑制作用最為明顯，在實驗濃度范圍內(nèi)，化合物17 對酪氨酸酶的抑制率已達到88.27%。各化合物IC50結(jié)果見表1。5 個化合物IC50均小于陽性藥β-熊果苷，其中化合物15 和17 的IC50值最小，表明這2 個化合物對酪氨酸酶抑制作用最強，抑制效果最好，化合物13和14 對酪氨酸酶的抑制率相當(dāng)，化合物4 在其中抑制效果較弱。

表1 各化合物的酪氨酸酶抑制活性 (, n = 3)Table 1 Tyrosinase inhibitory activity of compounds (,n = 3)

表1 各化合物的酪氨酸酶抑制活性 (, n = 3)Table 1 Tyrosinase inhibitory activity of compounds (,n = 3)

與β-熊果苷相比：*P＜0.05*P < 0.05 vs β-arbutin

化合物 IC50/(mg·mL?1)4 0.783±0.024 13 0.532±0.091 14 0.575±0.022*15 0.113±0.032*17 0.092±0.011*β-熊果苷 1.784±0.240

5.3 分子對接結(jié)果

通過對酪氨酸酶抑制活性最好的2 個化合物（15、17）進行分子對接并對其打分。

化合物15 對接結(jié)果如圖1 所示，化合物15 分別通過與酪氨酸酶蛋白中的半胱氨酸（Cys）、甘氨酸（Gly）殘基形成氫鍵，其鍵長分別為1.9、2.0、2.3、2.8、3.2，分子對接結(jié)合能為?3.5 kJ/mol，表明其具有良好的自由能結(jié)合能力。

圖1 化合物15 分子對接結(jié)果Fig. 1 Molecular docking results of compound 15

化合物17 對接結(jié)果如圖2 所示，化合物17 分別通過與酪氨酸酶蛋白中的Cys 殘基形成氫鍵，其鍵長分別為2.0、2.0、2.4、2.8，分子對接結(jié)合能為?5.74 kJ/mol，表明其具有良好的自由能結(jié)合能力。

圖2 化合物17 分子對接結(jié)果Fig. 2 Molecular docking results of compound 17

6 討論

酪氨酸酶是一種氧化還原酶，廣泛存在于植物和動物體中，是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶。黑色素的生物合成是由酪氨酸酶催化體內(nèi)L-酪氨酸（L-Tyr）生成多巴，多巴經(jīng)過進一步氧化生成多巴醌，多巴醌再經(jīng)過一系列的化學(xué)反應(yīng)，最后生成黑色素的過程，研究表明[40]，酪氨酸酶的活性與黑色素合成量相關(guān)，控制其活力即可控制黑色素生成量。

本研究報道了20 個從小茴香醋酸乙酯部位分離出來的化合物，并對其進行抑制酪氨酸酶活性實驗，實驗結(jié)果顯示化合物4、13～15、17 具有良好的酪氨酸酶抑制活性，抑制效果均高于陽性藥β-熊果苷，其中化合物15 和17 效果最好，其IC50分別為0.113、0.092 mg/mL，基于此對化合物15 和17進行分子對接，分子對接結(jié)果顯示化合物15 具有更好的與酪氨酸酶蛋白結(jié)合的能力，該結(jié)果與活性實驗結(jié)果一致?；衔?5 抑制效果優(yōu)于化合物14，可能由于化合物15 的末端雙鍵具有更好的代替多巴被氧化成黑色素這一過程，因此化合物15 的效果優(yōu)于化合物14。本研究結(jié)果將為小茴香化學(xué)成分美白效果的進一步開發(fā)和利用提供科學(xué)依據(jù)和參考價值。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突